Rapid Высокая пропускная способность Виды Идентификация ботанического материала с использованием прямого анализа в реальном времени с высоким разрешением масс-спектрометрии

На протяжении тысячелетий, психоактивные натуральные продукты были использованы в шаманских ритуалах, злоупотребляли за их психотропные атрибутов и поглотил своими целебными свойствами. При приеме внутрь этих растений и связанных с ними растительных веществ могут быть значительными в тех областях, где они являются эндемичными, и они имеют социальное и экономическое значение. Однако в последнее время наблюдается резкое увеличение использования этих "естественных" лекарств из-за легкости доступности через интернет-коммерции. Понимание того, что эти вещества являются безопасными для использования в сочетании с увеличенным разгоном владения и использования более традиционных препаратов и злоупотребления синтетическими веществами, способствовали всплеску злоупотребления наркотиков растительного происхождения. Это, как правило, трудно с помощью визуализации, чтобы отличить эти продукты и безвредным растительного материала, и, следовательно, существует интерес к разработке методов, которые можно использовать по идентификации этих продуктов. Однако обычные аналитические методы установкиидентификация видов являются длительными и нецелесообразно выполнять. Кроме того, процесс разработки методов времени и ресурсов. Эти факторы сделали крафта законодательства, чтобы обуздать использование этих веществ значительно отстают от темпов эскалации злоупотребления ими. Таким образом, есть несколько законов , которые регулируют производство, изготовление, продажа и потребление многих из этих природных психоактивных веществ и , как таковые, существуют сотни растений злоупотребления доступными для пользователей в тысячах различных форм. ^1,2

Два таких наркотиков растительного происхождения злоупотребления являются КРАТОМ, широко известный как Kratom, и растения из рода дурмана, а именно D. дурмана, Д. свирепый и D. inoxia. Kratom и дурман являются незапланированными в Соединенных Штатах, но администрация по борьбе с наркотиками и перечислил в качестве лекарственных средств, вызывающих озабоченность. ^3,4 Kratom характеризуется наличием психоактивных соединений митрагининй 7-hydroxymitragynine, а также другие не психоактивные алкалоиды включая mitraphylline, paynantheine, corynoxeine и rhynchophylline. ^4-8 Психоактивные свойства Datura SPP. приписываются атропин и скополамин, но целый ряд других тропана алкалоидов были идентифицированы в растениях. ^9-12 Оба Kratom и дурмана были вовлечены в отравлений и несчастных случаев, а также их идентификация становится все более необходимым в обоих судебных и токсикологических контекстах, а злоупотребление этих продуктов находится на подъеме. ^13-16

По большому счету, традиционные методы, используемые для анализа судебно-медицинской экспертизы материалов наркотиков, таких как цветные тесты, микроскопии и комбинационного и инфракрасной спектроскопии, используются в правиле-в / правилах из Предположительный емкости. Дефис методы, такие как ГХ-МС и жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS), являются методы анализа Подтверждающие на основе сравнения профилей обнаруженных аналитовРабочей группе по научным по анализу изъятых наркотиков (SWGDRUG) библиотечных стандартов. ¹⁷ Стадии обработки пробы, которые выполняются до анализа , включая пульверизации, экстракции, дериватизации и испарения, можно добавить часы на время выполнения и фальсифицировать образца, ^{9,11 , 18,19} делая анализ растительных препаратов менее проста по сравнению с другими традиционными для злоупотреблением наркотиками , как кокаин или героин. Кроме того, отдельные программы хроматографические должны быть разработаны для каждого интересующего продукта, что делает реализацию стандартных оперативных протоколов для каждого вида или разновидности лекарственного средства на растительной основе злоупотребления весьма непрактичной для рутинного судебных дел.

Прямой анализ в реальном времени с высоким разрешением масс-спектрометрии является окружающей среды ионизации метод масс-спектрометрии, что позволяет обойти некоторые из проблем, связанных с обычными аналитическими методами. Газы, жидкости, твердые вещества, порошки, ТСХ пластины и завод матерМВЛ могут быть проанализированы непосредственно с помощью прямого анализа в реальном масштабе времени-масс - спектрометрии с высокой разрешающей способностью , и оба полярных и неполярных соединений могут быть легко обнаружены в сложных матрицах. ^20-22 Кроме того, исследования показали , что психоактивные соединения могут быть быстро идентифицированы в Растительный материал путем непосредственного анализа в реальном времени с высоким разрешением масс - спектрометрии, а также информацию видоспецифичного можно почерпнуть из статистической обработки массовых спектральных данных. ^22-26

Здесь мы покажем , что непосредственный анализ в реальном времени с высоким разрешением масс - спектрометрии может быть использован для быстрой оценки различных растительных материалов (например, растения, порошки, экстракты и семена) для их психоактивных компонентов, а также о том , что виды и разновидности растительной полученные продукты могут быть определены в быстрой и высокой пропускной способностью образом. Анализ судебнохимически соответствующего ботанического материала без необходимости стадий подготовки проб или длительного хроматографическогоанализ о времени выполнения, в дополнение к идентификации видов растений сообщается.

1. Подготовка растительных материалов

1. Кратом Свежие листья Материал
   1. Используйте 6 мм отверстие диаметром штампа , чтобы создать единообразные Chads из Kratom листового материала из M. Спесиоза завод. Повторить 5 раз.
2. Кратом Порошок Extraction
   1. Смешайте 5 мл этанола и 5 мл дистиллированной воды, чтобы создать 1: 1 смесь растворителей для экстракции.
   2. В пробирку микроцентрифужных 1,5 мл, приостановить небольшое количество (~ 5 мг) порошка Kratom Бали в 1 мл 1: 1 EtOH: H ₂ O , смесь указанных растворителей. Повторить 5 раз.
   3. Разрушать ультразвуком Kratom Бали образцы экстракта порошка в ультразвуковой ванне в течение 30 мин при комнатной температуре.
   4. Центрифуга Kratom Бали образцы экстракта порошка в течение 2 мин при 750 мкг при комнатной температуре.
   5. Декантируйте растворителя из остаточного порошка для последующего анализа.
3. Подготовка семян дурмана
   1. Срезе D. Stramониевая семян пополам по поперечной плоскости с помощью лезвия бритвы. Повторите с использованием 5 различных семян.
   2. Повторите эти действия для D. inoxia и D. Семена Ferox.

2. Анализ прямых в реальном времени Источник ионов Параметры

1. Газ Температура нагревателя
   1. Установите температуру нагревателя газа источника ионов до 350 ° C.
2. Режим Ion
   1. Провести анализ в режиме положительных ионов с сеточного напряжения 250 В.
3. Гелий скорость потока газа
   1. Установить расход газа гелия до 2,0 л / сек.

3. Время пролета масс-спектрометре Параметры

1. Диафрагменные Напряжения
   1. Установите напряжение диафрагмы 1 до 20 В и напряжение диафрагмы от 2 до 5 В.
2. Кольцо объектива и Пик напряжения
   1. Отрегулируйте напряжение кольцо объектива до 5V и изменение пиков напряжения до 600 В.
3. Масс - спектральный приобретение
   1. Установите масс - спектрометрический скорость съемки до 1 спектра в секунду в течение диапазоне масс т / г 60-800.
4. Масс - спектрометр Разрешающая способность
   1. Установите разрешающую способность масс-спектрометра до 6000 FWHM.

4. Анализ растительных материалов

1. Анализ Kratom листьев
   1. Нажмите "Start Run" в серийном программном обеспечении управления спектрометром. Приостановить Чаде растительного материала между источником ионов и масс-спектрометра (входное отверстие примерно в 2 см от входного отверстия) с помощью пинцета, пока не будет получен спектр. Повторите 5 раз с помощью отдельных Chads растительного материала.
   2. Откалибруйте спектр с полиэтиленгликолем 600 (ПЭГ).
      1. Dip закрытый конец капиллярной трубки температурой плавления в стандарт ПЭГ. Приостановка капилляр с покрытием betwееп источник ионов и масс-спектрометр на входе.
   3. После анализа стандарта PEG, нажмите кнопку "Стоп", чтобы завершить аналитический прогон.
   4. Нажмите "Start Run" в серийном программном обеспечении управления спектрометром. Приостановка небольшое количество высушенного листа материала между ионным источником и входом масс-спектрометр с помощью пинцета, пока не будет получен спектр. Повторите 5 раз, анализируя новый растительный материал каждый раз.
   5. Откалибруйте спектр с PEG.
      1. Dip закрытый конец капилляра в стандарт PEG. Приостановка капилляр с покрытием между ионным источником и входным отверстием масс-спектрометра.
   6. После анализа стандарта PEG, нажмите кнопку "Стоп", чтобы завершить аналитический прогон.
2. Анализ Kratom порошка
   1. Нажмите "Start Run" в серийном программном обеспечении управления спектрометром. Dip закрытый конец точки плавления капилляра в порошок Kratom.
   2. Suspend капилляр с покрытием между ионным источником и входным отверстием масс-спектрометра до спектра получается. Повторить анализ 5 раз с новым капилляра каждый раз.
   3. Откалибруйте спектр с PEG.
      1. Dip закрытый конец капилляра в стандарт PEG. Приостановка капилляр с покрытием между ионным источником и входным отверстием масс-спектрометра.
   4. После анализа стандарта PEG, нажмите кнопку "Стоп", чтобы завершить аналитический прогон.
3. Анализ экстракта Kratom
   1. Погрузитесь закрытый конец капиллярной трубки в экстракт.
   2. Приостановка капиллярную трубку в держатель 12-образца на линейного рельса, прикрепленного к масс-спектрометре. Повторите 5 раз с помощью другого экстракта каждый раз.
   3. Нажмите "Start Run" в серийном программном обеспечении управления спектрометром. С помощью панели управления, нажмите кнопку ">" для продвижения линейного рельса через поток ионов со скоростью 1 мм / с дособирать спектры.
   4. Откалибруйте спектр с PEG.
      1. Dip закрытый конец капилляра в стандарт PEG. Приостановка капилляр с покрытием между ионным источником и входным отверстием масс-спектрометра.
   5. После анализа стандарта PEG, нажмите кнопку "Стоп", чтобы завершить аналитический прогон.
4. Анализ семян Datura
   1. Нажмите "Start Run" в серийном программном обеспечении управления спектрометром. Приостановить семян половину Datura между ионным источником и входным отверстием масс - спектрометр с помощью пинцета , пока спектр не собирается. Убедитесь в том, что боковой вырез ориентирован перед источником ионов. Повторите 5 раз, анализируя новое семя половину каждый раз.
   2. Откалибруйте спектр с PEG.
      1. Dip закрытый конец капилляра в стандарт PEG. Приостановка капилляр с покрытием между ионным источником и входным отверстием масс-спектрометра.
   3. После анализа стандарта PEG,выберите кнопку "Стоп", чтобы завершить аналитический прогон.
   4. Повторите шаги 4.4.1-4.4.3 для каждого вида Datura.

5. Обработка данных

1. Перевод файлов данных
   1. В программе обработки данных, выберите Файл, "Перевести DART файлы" с "автоматической калибровки" включен, для создания калиброванных файлов данных.
   2. Щелкните левой кнопкой мыши и перетащите рамку вокруг первого пика на хроматограмме и выберите "Среднее значение", чтобы создать усредненный спектр.
   3. Щелкните правой кнопкой мыши и растяните рамку вокруг области, где не была собрана не образец и выберите "Average весь ящик в качестве фона" вычесть фон от усредненного спектра.
   4. Сохранить спектр масс в виде текстового файла.
   5. Повторите шаги 5.1.1-5.1.4 для каждого пика в хроматограмме, чтобы создать усредненный спектр для каждого реплицировать в файле.
   6. Повторите шаги 5.1.2-5.1.5 для каждого файла собранной.

   6. Статистический анализ

   1. Анализ главных компонентов
      1. В разделе Classify спектрального анализа программного обеспечения (см перечень материалов), на вкладке "Настройка", создавать классы для обработки данных, выбрав "Add Class".
      2. Импорт текстовых файлов данных, выбрав "Добавить файл (ы)".
      3. Назначение файлов данных к соответствующему классу растений путем выбора текстовых файлов и "Установить класс для выбранных файлов".
      4. Выбор функции массы для дискриминации со стороны MS из обучающего набора и установленного порогового значения% до 1%.
      5. Установите массовый допуск (MMU) до 10 и выберите "Построить векторы из файлов данных".
      6. В разделе "Compute", выполнить анализ главных компонентов, установив флажок для 3D PCA Graph и выберите "Рассчитать".
      7. Выполните проверку кросс-отпуск один из выбрав "Подтвердить (МЕДЛЕННО!)."
   3. На вкладке Частота участка спектрального анализа программного обеспечения, генерировать тепловую карту данных, выбрав "Тепловая карта".
   4. Выберите "Threshold сохраненных данных", чтобы установить порог изобилие до 1%.
   5. Экспорт карту тепла в электронную таблицу, выбрав команду "Сохранить Теплокарта в Excel."
   6. В программе электронных таблиц, сохранить экспортированный карту тепла в виде текстового файла.
2. Иерархическая кластерный анализ
   1. Импорт карту тепла в качестве текстового файла в Cluster 3.0 программного обеспечения.
   2. На вкладке иерархическом в Cluster 3.0, под Гены и массивам, флажков "кластер" и "Рассчитать веса". Установить порог отсечения на уровне 0,1 и показателем 1. Выберите одиночной связи кластеризацию для выполнения анализа.
   3. Просмотр сгенерированный .cdt файл данных в Java Treeview.

Представитель мягкой ионизации в режиме положительных ионов прямой анализ в режиме реального времени с высоким разрешением данных масс - спектрометрии продуктов Кратом и семена Datura показаны на рисунках 2 и 3. Различные соединения ранее выделены из М. зресюза, в том числе митрагинин (С 23 Н 30 N 2 O 4 + H +, м / з 399,2284) и 7-hydroxymitragynine (С 23 Н 30 N 2 O 5 + Н +, м / з 415,2233), были обнаружены во всех четырех образцы и соответствующие данные измерений массы представлены в таблице 1. 4-8 данные представитель Datura показаны на рисунке 3 и подписные биомаркеров , включая атропин (C 17 H 23 NO 3 + Н +, м / з 290,1756) и скополамин (с 17 H 21 NO 4 + H + М / з 304,1549) были обнаружены в трех видов. Данные масс - измерения , связанные с рисунке 3 представлены в таблице 2. 9-12 Составные идентичности были подтверждены с помощью элементарного определения состава, согласования изотопов, и сопоставление отчетов в литературе. 23-24

Тепловая карта визуализации прямого анализа в режиме реального времени с высокой разрешающей способностью масс - спектрометрии спектров Kratom и дурмана показаны на рисунке 4. Данные , представленные были использованы анализа главных компонент (PCA) , чтобы различать два класса растительных препаратов злоупотребление (рисунок 5). ППТС участок был построен с использованием десяти полнометражных масс (перечислены в таблице 3), с синими кругами , представляющими данные кратоме и красные квадраты , представляющие данные дурмана. Комфортные массы выбранные соответствует различным алкалоидов представляем вДурман или Mitragyna SPP., В том числе психоактивные соединения атропин, скополамин, митрагинина и 7-hydroxymitragynine. 23-24 Три основных компонента составили 75,26% дисперсии и оставить-один из кросс - валидации (LOOCV) составила 100%. Участок РСА ясно показывает , что данные Kratom и данные Datura хорошо разрешены друг от друга. Анализ PCA также показал , что отдельные сорта Kratom и различные виды дурмана могут быть идентифицированы и отличаются друг от друга (рисунок 6). LOOCV был 94.29% с тремя основными компонентами покрытия 75,26% дисперсии. Два сорта Kratom (Бали в синих кругов и Rifat в красных квадратах) кластера вместе, показывая , что они принадлежат к виду M. зресюза, но разрешаются друг от друга, демонстрируя , что они представляют собой различные сорта. Кроме того, группа видов дурмана вместе и отделены от М. зрданные eciosa, но каждый из отдельных видов дурмана (Д. inoxia в зеленых треугольников, Д. дурмана в розовых квадратов и Д. Ferox в бирюзовых кругах) четко различаются. Несмотря на точку данных для D. дурман , появляясь быть выбивающихся, семя правильно классифицируется как D. дурман , а не D. inoxia использованием PCA. Самое главное, что разница в цвете семян между D. дурмана и D. inoxia подтверждает это разные виды и что точка данных идет речь , не может быть D. inoxia.

Иерархическая кластеризация (рисунок 7) был выполнен без выбора априори художественных масс. Вместо этого вся группа спектральных наборов данных , охватывающих диапазон масс м / г 60-800 была импортирована в программное обеспечение с открытым исходным кодом и геномная кластерной образовывалось дендрограммы показывая эти данные. Результаты Oе HCA также показал класс, видов и разнообразие дифференциации исключительно на основе прямого анализа масс-спектрометрии в реальном времени с высоким разрешением полученных данных и подтвердили те из РСА-анализа. Два класса наркотиков растительного происхождения злоупотреблений, Kratom и дурмана, были разделены на отдельные клады из дендрограммы. Кроме того, сорта и Рифат Бали из Kratom были изолированы друг на отдельные суб-клады в пределах класса Kratom. Точно так же, Д. inoxia, Д. свирепый и D. дурмана были решены в свои клады видами в пределах класса дурмана.

Рисунок 1. Изображение M. Спесиоза (Kratom) продукты и Datura SPP семена: с Бали Kratom сушеных листьев; б:.. порошковая Bali Kratom; C: Рифат Kratom живой завод; D. Дурман семян; е: D. Семена inoxia, F: D. Семена Ferox. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Прямой анализ в режиме реального времени с высоким разрешением-масс - спектрометрия положительных ионов спектров М. Спесиоза (Kratom) продукты: с Рифат свежих листьев, б:. Бали сушеных листьев; C: Бали порошок; d: Бали экстракт порошка. Данные измерений массы , связанные с этими спектров приведены в таблице 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Прямой анализ в режиме реального времени с высокой разрешающей способностью масс - спектрометрия положительных ионов спектров Datura SPP. . Семена: с D. свирепый; б: D. inoxia; C: D. дурмана. Данные измерения массы , связанные с этими спектров приведены в таблице 2. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. Тепловая карта визуализации прямого анализа в режиме реального времени , высокое разрешение масс - спектрометрии спектров Кратом и Datura растительных материалов. Приветпики интенсивности СТГ показаны в темно - красных и нижних пиков интенсивности показаны в более светлых оттенков. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5. Анализ главных компонент (PCA) участок Кратом и Datura продуктов построены с использованием прямого анализа в реальном времени данных высокого разрешения масс - спектрометрии происхождения. Три основных компонентов (ПК) составили 75,26% вариации, а отпуск-один- перекрестное проверки (LOOCV) составила 100%. Комфортные массы , используемые для РСА, приведены в таблице 3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7. Иерархические результаты кластеризации получены с использованием прямого анализа в реальном масштабе тимне- с высокой разрешающей способностью масс - спектрометрия-полученные данные анализа Кратом и Datura растительных материалов. Два класса растений четко разделены на две отдельные ветви в дендрограммы ( как показано в синих и красных скобках для Kratom и дурмана, соответственно). Виды семян дурмана также разрешены друг от друга ( как показано на зеленый, бирюзовый и розовый пунктирная коробки для Д. inoxia, Д. Ferox и Д. дурмана соответственно). В Kratom растительные материалы отделены друг от друга разнообразием (показаны красным и синим пунктирная ящики для Rifat и Бали, соответственно). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1. Данные измерений массы , связанные с мягкой ионизации спектров Kratom продКТС , представленные на рисунке 2. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.

Таблица 2. Данные измерения массы , связанные с мягкой ионизации спектров семян Datura , представленных на рисунке 3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.

Таблица 3. Характеристика массы , используемые для анализа главных компонент участке Кратом и Datura продуктов , показанных на рисунках 5 и 6.

Авторы не раскрывают информацию.