Применение флуоресцентного резонанса переноса энергии (FRET) для изучения Эффектор транслокации эффективности путем Coxiella burnetii Во время миРНК Глушащий

Coxiella burnetii является уникальным внутриклеточным патогеном , который вызывает зоонозных инфицирования человека вирусом лихорадки Ку. Это заболевание связано с широким спектром клинических проявлений , простирающихся от бессимптомной сероконверсией к угрожающей жизни хронической инфекции , которая часто проявляется как эндокардит лет после облучения ^1. Человек заражение происходит в основном за счет вдыхания загрязненных аэрозолей с жвачных Главным резервуаром инфекции, в частности, молочных коров, овец и коз. Хотя Coxiella инфекция у этих животных , как правило , субклинический, инфекция может вызвать аборт , и значительная бактериальной нагрузки в родильном жидкости и плаценты может сильно повредить окружающей среде ^1. Примером огромное бремя такого загрязнения может иметь на недавно наблюдался как общественного здравоохранения и промышленности сельского хозяйства в Q лихорадки вспышки, произошедшей в Нидерландах ^2. Между 2007 и2010, более 4000 случаев заболевания людей лихорадкой Ку был поставлен диагноз , и эта вспышка была связана со значительным загрязнением козьих ферм ^3. Кроме того, Coxiella является потенциальным биологическим оружием, по классификации Центров США по контролю и профилактике заболеваний, в связи с экологической устойчивости бактерий и низкой инфекционной дозы , необходимой для возникновения серьезных заболеваемости и смертности ^4.

Coxiella существует в двух фазах: Фаза I организмы, выделенные из природных источников, являются чрезвычайно вирулентных и фазовые организмы II являются сильно ослаблена в естественных условиях. Например, после того, как несколько в пробирке пассажей Coxiella burnetii Девять Миля этап I организмов, бактерии II фазы были получены , которые содержат необратимые хромосомные делеции что приводит к укороченной липополисахарида (LPS) ^5. Этот штамм, C. burnetii NMII, фенотипически подобна фазе I в моделях тканевой культуры и обеспечивает более безопасный режимл для исследователей для изучения Coxiella патогенеза в лабораториях ^5. В последние годы некоторые прорывы быстро продвигались поле Coxiella генетики. В частности, развитие аксенными сред (подкисленной цитрат цистеина среда - ACCM-2) позволил рост клеток , свободных от Coxiella как в жидком , так и на твердых средах ^6,7. Это привело к улучшению прямых генетических инструментов , доступных для Coxiella включая индуцибельной системы экспрессии генов, челночных векторов и случайных систем транспозонов ^8-11. Совсем недавно, два способа целевой инактивации генов были также разработаны, проложив путь для изучения кандидатов ¹² генов вирулентности конкретных.

После интернализации альвеолярными макрофагами, Coxiella размножается до высоких цифр в мембраносвязанного отсек называется Coxiella- содержащий вакуоли (CCV). ККТ требует незаконного оборота хост эндоцитических-йгрубые ранние и поздние эндосомы , пока она не созревает в лизосом происхождения органелл ^13. На протяжении всего этого процесса, ККТ приобретает факторы хозяина , которые либо появляются скоротечно или остаются связанными с вакуоль, в том числе, но не ограничиваясь ими, Rab5, Rab7, CD63 и LAMP-1 ^13-15. Репликация Coxiella внутри клеток - хозяев полностью зависит от полностью функциональной Dot / Icm Тип системы IVB секрецией (T4SS) ^8,16,17. Эта система секреции является многослойной структуры белка праязыка , связанные с системами конъюгации и охватывает как бактериальные и вакуолярной мембраны для доставки бактериальные белки, называемые эффекторы, в цитоплазме хозяина ^18. Coxiella T4SS функционально очень похож на хорошо охарактеризован тип IVB Dot / Icm секрецией системы легионелл ^19,20. Интересно отметить , что активация эффекторной транслокации T4SS и последующее не происходит до тех пор , пока не достигнет Coxiella кислой лизосомы , производныйорганеллы, приблизительно 8 ч после инфицирования ^17,21. На сегодняшний день более 130 Dot / ИВМ эффекторы были идентифицированы ^9,17,22-24. Многие из этих эффекторов , вероятно , играют важную роль в процессе репликации Coxiella внутри клеток - хозяев; Тем не менее, лишь немногие эффекторы были функционально характеризуется ^25-29.

В данном исследовании мы используем анализ транслокации флуоресценции на основе , которая опирается на расщепления субстрата CCF2-AM FRET (далее в качестве субстрата Бламу) через β-лактамазы активности в цитоплазме клетки - хозяина (рис 1). Интересующий ген слит с TEM-1 бета-лактамазы (Бламу) на репортерной плазмидой, которая обеспечивает конститутивную экспрессию. Субстрат Бламу состоит из двух флуорофоров (кумарин и флуоресцеин), которые образуют пару разъедать. Возбуждение результатов кумарина в ладу флуоресцеина и зеленого флуоресцентного излучения в отсутствие эффекторных транслокации; Тем не менее, если Дву-M-эффектор слитый белок транслоцируется в цитоплазме хозяина, в результате β-лактамазы расщепляет деятельности по β-лактам кольцо подложки Бламу, отделяя пары FRET по производству синего флуоресцентное излучение при возбуждении. Этот анализ транслокация было хорошо зарекомендовала себя как подход к идентификации эффекторных белков из ряда различных внутриклеточных и внеклеточных бактерий, в том числе С. burnetii, Л. pneumophila, Л. longbeachae, хламидиоза, энтеропатогенные Е. палочка, сальмонелла и Brucella ^17,30-35.

Для определения роли конкретных факторов хозяина на Coxiella эффекторной транслокации мы используем устоявшийся метод молчанием генов , известного как РНК - интерференции, в частности малых интерферирующих РНК (миРНК). Первоначально определены в Caenorhabditis Элеганс, РНК - интерференция является сохраняющимся эндогенный клеточный процесс , используемый для врожденной оборNSE от вирусов, а также регуляции генов ^36,37. После связывания последовательности конкретных миРНК, деградация мРНК происходит через RISC (РНК-индуцированного глушителей комплекса) приводит к определенному молчанием генов или бросовой ^38. В этом исследовании миРНК был использован для целевой двух белков хозяина, Rab5A и Rab7A, которые являются важными регуляторами эндоцитотического пути. Влияние глушителей Rab5A и Rab7A на эффекторной транслокации было установлено с помощью С. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 был выбран , как это было показано ранее , транслоцироваться системой секреции Дот / Icm из Coxiella ^17.

Используя оба миРНК глушителей гена и fluorescencebased анализа транслокации , описанный здесь, мы начинаем установить роль факторов хозяина в транслокации эффекторных белков с помощью Coxiella. Такой подход может быть применен к широкому кругу обеих внутриклеточной и внеклеточной бактерий, которые обладают сходными secretioN системы, отвечающие за транслокацию эффекторных белков.

Примечание: Все процедуры , связанные с ростом или манипулирования Coxiella burnetii RSA439 NMII должны быть выполнены в физическом уровне Контеймент 2 Лаборатория и в кабинете биологической безопасности в соответствии с местными правилами. Принципиальная схема обратной трансфекции и транслокации анализа рабочего процесса , описанного ниже, показан на рисунке 2.

1. Приготовление C. burnetii Культура Выражая CBU0077 слитую с бета-лактамазы (pBlaM-CBU0077) (1 день)

1. Подготовка 1X ACCM-2 ^6:
   1. Смешайте компоненты , перечисленные в таблице 1. Отрегулируйте рН до 4,75 с 6 М NaOH и фильтр стерилизовать (не автоклав). ACCM-2 стабилен в течение приблизительно трех недель хранили при 4 ° С.
2. Сформировать C. запасы burnetii pBlaM-CBU0077.
   1. Заражайте HeLa 229 клеток с C. burnetii штамм переноски pBlaM-CBU0077 и проход до большого vacuolЕ. С. наблюдаются в большинстве клеток.
      1. Растут C. burnetii штамм , несущий pBlaM-CBU0077 в 20 мл ACCM-2 , содержащей 3 мкг / мл хлорамфеникола в 75 см ² для тканевой культуры колбы с вентилируемой крышкой в течение 7 дней при температуре 37 ° С в 5% CO _2, 2,5% O _2.
      2. Центрифуга C. burnetii pBlaM-CBU0077 культуры при 15000 х г в течение 15 мин при комнатной температуре.
      3. Повторно приостанавливать осадок в 20 мл DMEM + 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), + 3 мкг / мл хлорамфеникола (техническое обслуживание средств массовой информации). Удалить носитель из 50% сливающийся 75 см ² колбы клеток HeLa 229. Добавить ресуспендировали C. burnetii в клетках HeLa 229. Инкубировать в течение 2 -х дней при температуре 37 ° С в 5% CO ₂ , чтобы позволить инфекции клеток HeLa , 229 , чтобы установить.
      4. Сплит клеток в 175 см ² колбу с тканевой культурой.
         1. Удалите носитель из колбы 75 см ² и промывают монослой дважды 10 мл подогретого PBS.
         2. Добавить 1 мл оF 0,05% трипсин-ЭДТА и место клетки при 37 ° C + 5% CO ₂ в течение 3 - 5 мин , чтобы отделить клетки.
         3. Повторное приостановить клеток в 10 мл поддерживающей сред. Добавьте 2 мл взвешенное клеток в 175 см ² колбу , содержащую 38 мл поддерживающей сред.
         4. Инкубируют при 37 ° С в 5% CO ₂ в течение 3 - 5 дней до 100% конфлуэнтности пока не будет достигнуто и наблюдаются большие вакуоли.
   2. Собрать супернатанта от ² см колбу 175, добавляют 10 мл дН ₂ O , чтобы покрыть инфицированные клетки HeLa 229 и инкубировать в течение 15 мин для лизиса инфицированных клеток.
   3. Объединить супернатанта и подвергали лизису клеток и осадок при 15000 х г в течение 15 мин при комнатной температуре.
   4. Повторное приостановить осадок в 10 мл дН ₂ O. Клетки Lyse далее неоднократно проходя ресуспензию через 23G иглы, прикрепленной к шприц объемом 10 мл, по меньшей мере в 20 раз. Гранула при 500 х г в течение 5 мин для удаления остатков клеток.
   <Li> Удалить и осадок супернатант при 15000 & bull ; g в течение 15 мин при комнатной температуре , чтобы собрать C. burnetii.
3. Повторное приостановить C. burnetii в DMEM + 10% FCS и количественного определения количества бактерий в соответствии с 4. Разбавить до 1 × 10 ⁹ геномов / мл с использованием DMEM + 10% FCS + 10% диметилсульфоксид (ДМСО), аликвоты 50 акций мкл в микроцентрифужных пробирках и хранят при -80 ° С.

2. Обратный Трансфекция киРНК и обсеменения HeLa 229 клеток (День 4)

1. При использовании экспериментальной Серна впервые приготовитькиРНК следующим образом:
   1. Кратко центрифугировать лиофилизированный миРНК, чтобы гарантировать, что миРНК осадок собирают в нижней части трубы.
   2. Повторное приостановить Осажденный миРНК до конечной концентрации акций 20 мкМ пипеткой соответствующий объем 1x миРНК буфера (таблица 2).
   3. Пипетировать раствор вверх и вниз 3 - 5 раз перемешать и место на орбитальном смесителе в течение 30 мин при комнатной температуре, переворачивая пробирку каждые 5 - 10 мин.
   4. Кратко отцентрифугировать пробирку для того чтобы обеспечить миРНК собирается в нижней части трубы.
   5. Алиготе миРНК в 50 мкл аликвоты в микроцентрифужных труб и хранить при температуре -20 ° С, пока не требуется.
   6. Для создания 1 мкМ рабочих концентрацию миРНК, пипетка 950 мкл 1X буфера миРНК в 50 мкл аликвоты запаса (20 мкМ) в случае необходимости. Примечание: Эта 1 мкМ рабочая концентрация может быть сублимацией оттаивали несколько раз для повторных трансфекциях.
2. Поместите DMEM + 10% FCS,; 0,05% трипсин-ЭДТА и PBS, в С водяной бане при 37 ° (или эквивалент) в течение 30 мин, чтобы нагреть перед использованием.
3. Получение компонентов трансфекции:
   Примечание: Следующий протокол был оптимизирован для HeLa 229 клеток в 96-луночного микропланшета с черными стенами и плоской, прозрачным дном. Оптимизация количества реагента для трансфекции, концентрация миРНК и высева плотность клеток могут быть необходимы для различных клеточных линий.
   1. Для каждой лунки, используют 0,1 мкл реагента для трансфекции, 15,9 мкл уменьшенного сыворотки среда (минимальной основной среде , используемой для трансфекциях, обратитесь к таблице материалов) и 4 мкл 1 мкМ миРНК ( что приводит к конечной концентрации киРНК 40 нМ). Используйте отдельные микроцентрифуге трубки для OTP, PLK1, Rab5A и Rab7A. Измерьте каждое условие анализа в трех экземплярах. Пример компоновки пластины 96-луночного показана на рисунке 3.
      Примечание: Этот протокол включает в себя использование двух элементов управления: OTP и PLK1. ОТРсостоит из четырех объединенных миРНК, которые были оптимизированы для уменьшения вне цели эффектов и, таким образом, ОТР используют в качестве отрицательного, ненацеливании контроля. Зашифрованный миРНК также могут быть использованы в качестве отрицательного контроля. Потеря результатов экспрессии PLK1 в обширной гибели клеток в ряде клеточных линий путем индукции проапоптотического путей и, следовательно, PLK1 миРНК используется в качестве положительного контроля для трансфекции, где гибель клеток коррелирует эффективность трансфекции.
      1. Для каждой экспериментальной миРНК трансфекции, объединить 0,4 мкл реагента для трансфекции и 63,6 мкл с пониженным содержанием сыворотки среды в отдельной пробирке. Мешалке все микроцентрифуге трубки и позволяют компоненты комплекса в течение 5 мин при комнатной температуре.
      2. Добавить 16μl каждой экспериментальной миРНК к соответствующим микроцентрифужных пробирки, содержащие комплекс трансфекцию. Vortex и инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре. Примечание: Важно, чтобы не превышать 30 мин, так как эффективность трансфекции будет уменьшаться.
4. В течение 20 мин вклubation (2.3.1.2) добавляют 20 мкл реагента для трансфекции + уменьшенного сыворотки среды + миРНК смесь в соответствующие лунки стерильный черный, плоский прозрачным дном лотка 96-луночного.
5. Как только 20 мин инкубационный период завершается, семена HeLa 229 клеток при плотности 3,92 × 10 ³ клеток / лунку.
   1. Урожай HeLa 229 клеток из сливного или суб-сливающийся 75 см ² для тканевой культуры колбы в предварительно нагретый DMEM + 10% FCS , и повторно приостанавливать клеток до конечной плотности 4,9 × 10 ⁴ клеток / мл в соответствии со стандартными методами. Для того, чтобы обеспечить трансфекцию эффективность не скомпрометированы, подготовить клетки в течение 20 - минутного периода инкубации (2.3.1.2).
      1. Промыть монослой HeLa 229 клеток дважды 10 мл подогретого PBS.
      2. Добавьте 1 мл 0,05% раствора трипсина-ЭДТА и место HeLa 229 клеток при 37 ° С + 5% CO ₂ в течение 3 - 5 мин , чтобы отделить клетки.
      3. Сбор клеток в 9 мл подогретого DMEM + 10% FCС. Граф клеток с использованием гемоцитометра и подготовить клетки к конечной плотности 4,9 × 10 ⁴ клеток / мл с использованием DMEM + 10% FCS.
   2. Пипеток 80 мкл HeLa 229 клеток при плотности 4,9 × 10 ⁴ клеток / мл в каждую лунку , которая содержит трансфекцию реагент + уменьшенного сыворотки среда + миРНК смесь. Это соответствует плотности клеток 3,92 × 10 ³ клеток / лунку.
      Примечание: вычитание фона требуется для подложки Бламу.
      1. Не добавляйте клетки или миРНК в "пустые" скважины (рисунок 3). Вместо этого добавьте 80 мкл DMEM + 10% FCS этих скважин, установленных в трех экземплярах.
   3. Инкубируют в течение 24 ч при 37 ° С + 5% CO _2.

3. Изменение СМИ (ДЕНЬ 5)

1. Через 24 часа, удалите носитель с помощью многоканального адаптера, присоединенную к источнику вакуума или вручную с помощью многоканальной пипетки, и заменить 100 мкл свежей prewarmред DMEM + 10% FCS.
2. Инкубируют в течение еще ​​48 ч при 37 ° С ± 5% CO _2.
3. На данный момент, проверить жизнеспособность клеток визуально с использованием стандартного светового микроскопа. Если обратный трансфекция была успешной, значительная гибель клеток будет наблюдаться в лунках, содержащих Plk1 миРНК по сравнению с OTP миРНК.

4. Количественное Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 штамма с использованием КПЦР (ДЕНЬ 7)

1. После 7 дней роста в ACCM-2 при 37 ° С в 5% СО _2, 2,5% O ₂ (1,3), центрифугировать 10 мл C. burnetii pBlaM-CBU0077 культуры при 15000 х г в течение 15 мин при комнатной температуре.
2. Повторное приостановить бактериальных гранул в 10 мл подогретого DMEM + 10% FCS. Готовят в соотношении 1:10 и 1: 100 разведени культуры (образца) с использованием дН ₂ O.
3. Настройте компоненты, необходимые для кПЦР.
   Примечание: извлечение гДНК может быть выполнена заранее и хранить при температуре от -20 ° C UNTтребуется ил.
   1. Подготовка стандартов:
      1. Экстракт GDNA из Coxiella burnetii RSA439 NMII штамма дикого типа , выращенных в ACCM-2 при 37 ° С в 5% CO _2, 2,5% O ₂ в течение 7 дней с использованием набора для экстракции GDNA, в соответствии с инструкциями изготовителя.
      2. Измеряют концентрацию GDNA (г / мкл) с использованием NanoDrop (или эквивалент) при поглощении 260 нм.
      3. Подсчитайте количество геномных копий на мкл с использованием следующей формулы ниже, и преобразование в несколько геномов / мл.
         
      4. Регулировка количества геномов / мл до 10 ⁹ / мл (в конечном объеме 100 мкл) в новой пробирке с использованием дН ₂ O. Это может быть кипятили в течение 10 мин и хранили при -20 ° С до тех пор, пока требуется.
      5. В день инфицирования, генерировать 10-кратных серийных разведений 10 ⁸ геномов / мл до 10 ⁵ геномов / мл из 10 ⁹ геномаs / мл запаса.
         1. Пипетка 10 мкл 10 ⁹ геномов / мл в 90 мкл дН ₂ O для создания 10 ⁸ геномы / мл. Vortex перемешать. Пипетка 10 мкл 10 ⁸ геномов / мл в 90 мкл дН ₂ O для создания 10 ⁷ геномы / мл. Vortex и повторить до 10 ⁵ геномов / мл.
   2. Настройка реакции КПЦР. Создание мастер-микс для 25 скважин для учета любых ошибок при использовании пипеток. Для каждой лунки, используйте 10 мкл КПЦР Master Mix; 2 мкл смеси праймера ОмПО (4.3.2.2) и 3 мкл дН ₂ O.
      Примечание: OmpA представляет собой внешний мембранный белок С. burnetii ^'39 и блок 82-пар оснований в пределах высококонсервативной области был выбран для применения в качестве зонда , как было описано выше ^40.
      1. Настройка каждого стандарта (Dh ₂ O, 10 ^5, 10 ^6, 10 ^7, 10 ^8, 10 ⁹ геномов / мл) и образец (1:10 и разведение 1: 100) в 96-луночный ПЦР отторгнуть пластину (не огибать) в двух экземплярах или трех экземплярах, соответственно. Добавьте 5 мкл образца или стандарта в соответствующие лунки.
      2. Использование дН ₂ O, разбавить как OmpA прямого праймера (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 ') и обратного праймера , OmpA (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') до конечной концентрации 4 мкМ и комбинируются в то же пробирке.
         Примечание: Смесь праймер OmpA можно приготовить заранее и хранить при -20 ° С до тех пор , пока требуется.
      3. Объединить 250 мкл КПЦР Master Mix, 50 мкл смеси ОмПО праймера, 75 мкл дН ₂ O и вихревую перемешать. Добавьте 15 мкл этой основной смеси в лунки, содержащие либо стандарты или образцы.
      4. Поместите 8-крышки ПЦР стрип крышки на соответствующие лунки и импульсной центрифуге пробирки для ПЦР, чтобы убедиться, что все собранные в нижней части труб.
      5. Настройте следующую программу на количественной ПЦР маскула: 50 ° С в течение 2 мин, 95 ° С в течение 10 мин, а затем 45 циклов при 95 ° С в течение 1 сек и 60 ° C в течение 20 сек (рис 4а).
   3. Анализ Ct (пороговый цикл) значения из кПЦР:
      1. Передача значения Ct в электронную таблицу с помощью функции экспорта программы.
      2. Создайте диаграмму рассеяния стандартов 10 ⁵ геномов / мл до 10 ⁹ геномов / мл (выраженное в виде значений LOG). Откажитесь от любых явных выбросов среди трех образцов. Генерация логарифмической трендовая и определить уравнение графика.
      3. Подсчитайте общее количество геномов / мл в образце с использованием уравнения генерируемый в 4.3.3.2. Не забудьте учесть первоначального разведения (1:10 и 1: 100) образцов.

5. Инфекция обратного трансфицированных клеток (ДЕНЬ 7)

1. После расчета суммарных геномы / мл в C. репейникnetii pBlaM-CBU0077 культуры , которые будут использоваться для инфекции, скорректировать ресуспендировали бактериальной культуры , чтобы инфицировать клетки при MOI 300 в конечном объеме 50 мкл / лунку с использованием предварительно нагретые DMEM + 10% FCS.
   Примечание: ожидаемая плотность посеянных клеток HeLa 229 с нормальным временем удвоения после 72 ч составляет 3,136 × 10 ⁴ клеток / лунку. Количество бактерий , необходимых для инфицирования при MOI 300 составляет 9.408 × 10 ⁶ в 50 мкл, что эквивалентно 1,88 × 10 ⁸ бактерий / мл.
   1. Используя значение , вычисленное из КПЦР (геномов / мл) (4.3.3.3), разбавить ресуспендировали бактерий с использованием предварительно нагретого DMEM + 10% FCS , в конечном объеме 2 мл , чтобы инфицировать обратные трансфецированных клеток.
2. Удалите существующий носитель из заготовки и обратного трансфицированных клеток.
3. Добавляют 50 мкл разведенных бактерий (1,88 × 10 ⁸ бактерий / мл) в соответствующие лунки. Добавляют 50 мкл DMEM + 10% FCS к обоим заготовкой и Uninfected скважин.
4. Инкубируют в течение 24 ч при 37 ° С + 5% CO _2.

6. Добавление Бламу субстрата для определения уровня транслокации (ДЕНЬ 8)

1. Подготовка решения для Бламу субстрата раствором 6х нагрузки.
   Примечание: раствор А, В и С представлены в наборе подложки Бламу (обратитесь к таблице материалов). Раствор B может образовывать осадок при комнатной температуре. Подогрейте этот раствор до 37 ° C перед использованием и осадок должен раствориться.
   1. При использовании набора в первый раз, добавьте 185 мкл ДМСО (поставляется с комплектом подложки Бламу) в высушенном Solution A. Затем сохраните ресуспендировали растворе при -20 ° C.
   2. Приготовьте 0,1 М раствора пробеницида заранее и хранить в аликвоты объемом 1 мл при температуре от -20 ° С до тех пор, пока требуется.
      1. Приготовьте 0,4 М NaOH (1,6 г в 100 мл дН ₂ O).
      2. Подготовьте 100 мМ Na фосфатный буфер с рН 8 (1,56 г NaH ₂ PO ₄ · 2H ₂ HPO ₄ в 100 мл дН ₂ O).
      3. Растворить 1,25 г пробеницида в 22 мл 0,4 М NaOH при интенсивном перемешивании.
      4. Добавить 22 мл 100 мМ Na фосфатный буфер с рН 8 (раствор будет мутнеть) и перемешивают для растворения осадка, который образуется.
      5. Доводят рН до 8 (при необходимости) с помощью 1 М NaOH / HCl.
      6. Перемешать энергично и тепло мягко (<50 ° С) до тех пор, пока раствор не станет в основном ясно.
      7. Фильтр (0,2 мкм размер пор) и аликвоты в объеме 1 мл. Храните аликвоты при -20 ° C.
2. Для каждой лунки, используйте 0,06 мкл раствора А, 0,54 мкл раствора В, 7,9 мкл раствора C и 1,5 мкл 0,1 М пробеницида. Создание мастер-микс для 30 лунок сначала комбинированием 1,8 мкл раствора А и 16,2 мкл раствора B вместе в пробирке. Хорошо перемешать с помощью вихря. Добавьте 237 мкл раствора С и 45 мкл 0,1 М пробеницида. Vortex объединить все Componenц.
   Примечание: 6х загрузки раствор стабилен в течение до 4 ч (в темноте), но должны быть готовы как можно ближе перед использованием.
3. Добавьте 10 мкл 6х погрузочной раствора непосредственно во все заготовки и реверс трансфицированных скважин без удаления существующих средств массовой информации.
4. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 2 ч в темноте.
5. Для того, чтобы определить уровень транслокации, определения количества флуоресценции с использованием микропланшет-ридера.
   Примечание: Следующая процедура является специфическим для читателя ClarioSTAR микропланшетов. Эквивалентные читатели микропланшетов также могут быть использованы.
   1. Создать новый протокол интенсивности флуоресценции с использованием конечной точки в режиме чтения.
   2. Настройте основные параметры следующим образом:
      1. Выберите 96-луночный микропланшет.
      2. Под оптическими параметрами, выберите 2 multichromatics со следующими пользовательскими настройками: (1) Входной 410-10 нм возбуждение и излучение 520-10 нм. (2) Ввод 410-10 нм возбуждения и эмиссии 450-10 нм. Обеспечить хорошо стьichromatics выбран.
      3. Выберите орбитальную усреднение с диаметром 3 мм.
      4. Под оптикой, выберите нижний оптический элемент.
      5. По скорости и точности, выберите точный. Это соответствует восьми регионов на лунку.
   3. Отрегулируйте расположение пластины, выбрав соответствующие лунки в качестве образцов.
   4. Выберите измерение начало.
   5. Снимите крышку и поместите лоток в ридере. Для того, чтобы избежать достижения максимальных значений флуоресценции, убедитесь, что значение коэффициента усиления регулируется. Для этого выполнить регулировку усиления на одном из зараженных колодцев, которая была обратной, трансфицированных OTP миРНК. Это соответствует самой высокой ожидаемой транслокации.
   6. Выберите измерение начинают измерять все соответствующие лунки с использованием донных флуоресценции при возбуждении 410 нм и эмиссии как 450 нм и 520 нм для синего и зеленого свечения, соответственно.

7. Анализ результатов:

1. Рассчитать отношение450 нм до 520 нм (синий на зеленый) для всех образцов следующие сокращения пустой и выразить по отношению к неинфицированным образца OTP.
   Примечание: следующие шаги анализа предназначены для простой программы электронных таблиц.
   1. Используя функцию экспорта на планшет - ридере, передавать необработанные значения флуоресценции , полученные как для 520 нм и 450 нм длиной волны излучения (6.5) в электронную таблицу.
   2. Вычислить среднее значение "пустой" чтений (СМИ только, без клеток) для 520 нм, добавляя сырые 520 нм значения флуоресценции и деления на количество скважин (3). Повторите, используя пустые 450 нм значения. Эти значения представляют фоновой флуоресценции из-за 96-луночного планшета и средств массовой информации.
   3. Вычтите фоновой флуоресценции. Используя значения , полученные в 7.1.2 вычесть среднее заготовки 520 нм от всех значений нм флуоресценции образца 520. Повторите эти действия для значений 450 нм.
   4. Чтобы получить 450: соотношение 520 нм использовать пустые скорректированных значений (7.1.3). Разделите каждый образец 450 нм значение флуоресценции его соответствующим 520 нм значение.
   5. Вычислить среднее значение неинфицированных значений отношения КАП путем добавления 450: значения соотношения нм 520 (от 7.1.4) и деления на количество скважин (3).
   6. Рассчитывают соотношение количества образцов по отношению к неинфицированным OTP путем деления 450: 520 нм соотношение , рассчитанное в 7.1.4 в среднем неинфицированных значения отношения ОТП вычисленной в 7.1.5.

8. Добавление ядер Stain, чтобы определить после сотового телефона транслокации анализа (ДЕНЬ 8)

1. После количественного определения флуоресценции, удалите носители, содержащие 6х решение загрузки из всех скважин с использованием либо адаптера многоканального подключенного к источнику вакуума или вручную с помощью многоканальной пипетки.
2. Добавляют 50 мкл 4% раствора PFA (параформальдегид)в PBS, чтобы все соответствующие лунки для фиксации клеток. Инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин.
3. Удалить 4% раствора PFA PBS (согласно 8.1) и мыть клетки дважды с 75 мкл PBS.
4. Добавляют 50 мкл клеточной проницаемой, окрашивающий ядра, например, DAPI (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол), в каждую лунку. Получение изображений с помощью флуоресцентного микроскопа и количественного определения количества ядер , присутствующих в каждую лунку после лечения миРНК с использованием соответствующего программного обеспечения для анализа изображений, таких как ImageJ ^41.

Для этого исследования, C. burnetii pBlaM-CBU0077 штамм был выбран в качестве CBU0077 было ранее показано, что транслокация эффектор системы 17 секреции Coxiella Дот / ICM. До инфекции, общее количество геномов / мл в семидневный C. burnetii pBlaM-CBU0077 культуры был причислен использованием КПЦР. Рисунок 4 демонстрирует пример порогового цикла (Ct) значения ожидаются от обоих стандартов и образцов следующих кПЦР. Значения Ct (представлены графически в Amplification Plot (рис 4В) и численно (рис 4C)) были экспортированы и анализировали , как описано в 4.3.3. На основе репрезентативных данных , показанных, были 2,31 × 10 8 геномов / мл в 10 мл ресуспендировали бактериальной культуры (рис 4D). Для создания соответствующего бактериального разбавления (1,88 × 10 8 геномов / мл яN 2 мл), 1,63 мл ресуспендировали бактерий добавляют к 370 мкл свежей, подогретого DMEM + 10% FCS. Клетки обратной трансфицированные миРНК впоследствии были инфицированы C. burnetii pBlaM-CBU0077 при MOI 300 в течение 24 часов.

После инкубации обратной трансфицированные инфицированных клеток с Бламу субстратной квантификации эффекторной транслокации может быть определена с помощью флуоресцентном счетчике пластины. После анализа , как описано в 7, все значения отношения , которые были нормированы к неинфицированных OTP также могут быть нормализованы к зараженному OTP. Уровень эффекторной транслокации после глушителей генов-хозяев могут быть сгруппированы в три исхода после того, как по сравнению с зараженным контролем OTP: (1) Без изменений; (2) Увеличение эффекторной транслокацию; (3) Снижение эффекторной транслокации. Последующий статистический анализ, например, Т - критерий Стьюдента, может быть использован , чтобы определить значимость любого наблюдаемого разности Тто зараженных контроль OTP. В результате глушителей либо Rab5A или Rab7A на эффекторной транслокации из трех независимых экспериментов показано на рисунке 5А. Значительное снижение уровня Бламу-CBU0077 транслокации произошло во время глушителей обоих Rab5A и Rab7A по сравнению с контролем OTP (значение р = 0,0088 (Rab5A) и р = 0,0059 значение (Rab7A), парного, критерий Стьюдента). Было также установлено, влияние лечения миРНК на жизнеспособность клеток. После анализа транслокации, клетки фиксировали, окрашивали красителем ядер и впоследствии количественно. Как показано на рисунке 5С, хотя лечение с помощью либо Rab5A или Rab7A приводит к снижению жизнеспособности клеток по сравнению с контрольными OTP (12% и 31%, соответственно), это снижение не столь сильным , как PLK1 (97%), ген известного вызывает гибель клеток (величина р = 0,0102 (Rab5A); значение р = 0,0081 (Rab7A); значение р <0,0001 (PLK1), парные, Стьюдента-тест). Эти результаты показывают, как заставить замолчать хозяина GEуказанные в другом месте с помощью миРНК может отрицательно изменить уровни бактериальной транслокации эффектора.

Рисунок 1. Механизм действий Бламу субстрата во время инфекции. C. burnetii усвоена клетками - хозяевами и образует лизосом полученный вакуоль называется катио- вакуоль Coxiella. 24 ч после заражения, клетки загружаются с мембраной проницаемой Бламу субстрат , который обладает двумя флуорофоров , образующие FRET пары (А). При отсутствии β-лактамазы т.е. не транслокации эффектора Бламу-CBU0077, возбуждение кумарина в 410 нм приводит к FRET флуоресцеина, наблюдаемые в качестве зеленого флуоресцентного сигнала (520 нм) (В). В случае функциональной системы секреции Дот / ICM, слитый белок Бламу-CBU0077 будет транслокации в клетку - хозяина и клсвеса субстрат Бламу, с помощью β-лактамазы активности, в результате чего разделение двух красителей и приводит к нарушению FRET и сигнал синего флуоресценции (450 нм) после возбуждения при 410 нм (C). Оба зеленого и синего сигнала флуоресценции может быть детектируют с использованием флюоресцентный пластины. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

. Рисунок 2. Схема Обзор обратного Трансфекция и транслокации пробирной Workflow День 1: Подготовьте C. burnetii pBlaM-CBU0077 культуры 4 -й день:. Обратный использованием трансфекции 40 нМ миРНК и семян HeLa 229 клеток в конечной плотности 3,92 × 10 3 клеток / лунку в лоток 96-луночного 5 -й день: Ch.Анж СМИ 7 -й день:. Количественно суммарные геномов / мл C. burnetii pBlaM-CBU0077 культуры с использованием КПЦР и впоследствии заражает обратной трансфекции клеток с MOI 300. 8 -й день:. Добавить краситель 6х загрузки, измерения флуоресценции и количественного определения количества клеток Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. 96-луночного планшета Макет используется для настройки реверса Трансфекция и обсеменения HeLa 229 клеток. "Белые" скважины (показаны красным цветом) содержат только средства массовой информации и не нуждаются в добавление либо миРНК или HeLa 229 клеток. OTP миРНК (показано на светло-голубой для неинфицированных колодцев и темно-синего цвета для зараженных скважин) используется в качестве ненацеливании контроля, так как она была оптимизирована дляимеют меньше от ворот эффектов. Темно-бордовый и зеленые скважины представляют собой Rab5A и Rab7A миРНК, соответственно. PLK1 миРНК (показаны желтым цветом) используется в качестве меры эффективности трансфекции , как потеря экспрессии PLK1 может вызвать проапоптотического пути и обширную гибель клеток в подавляющем большинстве клеточных линий. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. Представитель КПЦР Ct значения , используемые для количественной оценки общего числа геномов / мл в C. burnetii pBlaM-CBU0077 Культура. (A) Условия цикла , используемые в кПЦР перечислить количество геномов / мл в Coxiella культур. Значения Ct для обоих стандартов и образцов представлены в графическом (B) и числовой (C)форматов. (D) Стандартные значения Ct были усреднены, рентгенографического и логарифмическая линия тренда была рассчитана. Используя уравнение и средние значения выборки Ct значения общее количество геномов / мл в C. burnetii pBlaM-CBU0077 культура была определена как 2,31 × 10 8. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5. Транслокация дот / Icm Эффектор Бламу-CBU0077 во миРНК глушителей Rab5A и Rab7A. HeLa 229 клеток обратной трансфицировали siРНК , специфичную Rab5A (бордовые бар), Rab7A (зеленые столбики), OTP (синие полосы) или PLK1 (желтые столбцы) и инкубировали в течение 72 ч перед инфицированием с C. штамм burnetii pBlaM-CBU0077 при MOI 300 в течение 24 ч. После того, как тон добавление субстрата Бламу флуоресценцию измеряли с использованием микропланшет - ридера (А) В таблице показано , необработанные значения флуоресценции , полученные из одного эксперимента наряду с 450:. 520 нм коэффициент по отношению к неинфицированным управления ОТР после вычитания пустых значений (медиа только нет клеток). Уровень транслокации (B) и жизнеспособность клеток (С) представлены в виде процентного среднее значение ± стандартное отклонение по сравнению с ОТР реверсивных трансфицированных клеток , инфицированных из трех независимых экспериментов. * Значение р <0,05; ** Р-значение <0,01; **** Р-значение <0,0001 (парный, Стьюдента -test). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1. Компоненты , необходимые для создания 1x ACCM-2.

Таблица 2. Объем буфера миРНК 1x Требуется для Hydrating лиофилизированных миРНК до соответствующей концентрации.

Авторам нечего раскрывать.