Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Применение флуоресцентного резонанса переноса энергии (FRET) для изучения Эффектор транслокации эффективности путем

10.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54210

⸱

6 июля 2016 г.

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, University of Melbourne

В этой статье

Краткое содержание

Исследование взаимодействия между бактериальными патогенами и их хозяев является важной областью биологических исследований. Здесь мы опишем необходимые методы для измерения эффекторной транслокацию по Coxiella burnetii во время миРНК молчанием генов с использованием Бламу субстрата.

Аннотация

Coxiella burnetii, возбудитель лихорадки Ку, является внутриклеточным патогеном , который зависит от типа IV Dot / Icm секреция системы , чтобы создать репликативной нишу. Когорта эффекторов транслоцируются через эту систему в клетку-хозяина, чтобы управлять процессами хоста и позволяют создание уникального лизосом происхождения вакуоли для репликации. Метод, представленный здесь, включает в себя комбинацию двух хорошо известных методов: специфического молчанием генов с использованием миРНК и измерения эффекторной транслокации с использованием FRET на основе подложки, которая опирается на β-лактамазы активности. Применение этих двух подходов, мы можем начать понимать роль факторов хозяина в бактериальной функции системы секреции и эффекторной транслокации. В данном исследовании мы рассмотрели роль Rab5A и Rab7A, как важных регуляторов эндоцитотического пути торговли. Показано, что глушение экспрессию либо белка приводит к снижению эффекторной translocatioп эффективность. Эти методы могут быть легко изменены, чтобы исследовать другие внутриклеточные и внеклеточные патогенные микроорганизмы, которые также используют системы секреции. Таким образом, глобальная картина факторов хозяина, участвующих в бактериальной транслокации эффектора могут быть выявлены.

Введение

Coxiella burnetii является уникальным внутриклеточным патогеном , который вызывает зоонозных инфицирования человека вирусом лихорадки Ку. Это заболевание связано с широким спектром клинических проявлений , простирающихся от бессимптомной сероконверсией к угрожающей жизни хронической инфекции , которая часто проявляется как эндокардит лет после облучения 1. Человек заражение происходит в основном за счет вдыхания загрязненных аэрозолей с жвачных Главным резервуаром инфекции, в частности, молочных коров, овец и коз. Хотя Coxiella инфекция у этих животных , как правило , субклинический, инфекция может вызвать аборт , и значительная бактериальной нагрузки в родильном жидкости и плаценты может сильно повредить окружающей среде 1. Примером огромное бремя такого загрязнения может иметь на недавно наблюдался как общественного здравоохранения и промышленности сельского хозяйства в Q лихорадки вспышки, произошедшей в Нидерландах 2. Между 2007 и2010, более 4000 случаев заболевания людей лихорадкой Ку был поставлен диагноз , и эта вспышка была связана со значительным загрязнением козьих ферм 3. Кроме того, Coxiella является потенциальным биологическим оружием, по классификации Центров США по контролю и профилактике заболеваний, в связи с экологической устойчивости бактерий и низкой инфекционной дозы , необходимой для возникновения серьезных заболеваемости и смертности 4.

Coxiella существует в двух фазах: Фаза I организмы, выделенные из природных источников, являются чрезвычайно вирулентных и фазовые организмы II являются сильно ослаблена в естественных условиях. Например, после того, как несколько в пробирке пассажей Coxiella burnetii Девять Миля этап I организмов, бактерии II фазы были получены , которые содержат необратимые хромосомные делеции что приводит к укороченной липополисахарида (LPS) 5. Этот штамм, C. burnetii NMII, фенотипически подобна фазе I в моделях тканевой культуры и обеспечивает более безопасный режимл для исследователей для изучения Coxiella патогенеза в лабораториях 5. В последние годы некоторые прорывы быстро продвигались поле Coxiella генетики. В частности, развитие аксенными сред (подкисленной цитрат цистеина среда - ACCM-2) позволил рост клеток , свободных от Coxiella как в жидком , так и на твердых средах 6,7. Это привело к улучшению прямых генетических инструментов , доступных для Coxiella включая индуцибельной системы экспрессии генов, челночных векторов и случайных систем транспозонов 8-11. Совсем недавно, два способа целевой инактивации генов были также разработаны, проложив путь для изучения кандидатов 12 генов вирулентности конкретных.

После интернализации альвеолярными макрофагами, Coxiella размножается до высоких цифр в мембраносвязанного отсек называется Coxiella- содержащий вакуоли (CCV). ККТ требует незаконного оборота хост эндоцитических-йгрубые ранние и поздние эндосомы , пока она не созревает в лизосом происхождения органелл 13. На протяжении всего этого процесса, ККТ приобретает факторы хозяина , которые либо появляются скоротечно или остаются связанными с вакуоль, в том числе, но не ограничиваясь ими, Rab5, Rab7, CD63 и LAMP-1 13-15. Репликация Coxiella внутри клеток - хозяев полностью зависит от полностью функциональной Dot / Icm Тип системы IVB секрецией (T4SS) 8,16,17. Эта система секреции является многослойной структуры белка праязыка , связанные с системами конъюгации и охватывает как бактериальные и вакуолярной мембраны для доставки бактериальные белки, называемые эффекторы, в цитоплазме хозяина 18. Coxiella T4SS функционально очень похож на хорошо охарактеризован тип IVB Dot / Icm секрецией системы легионелл 19,20. Интересно отметить , что активация эффекторной транслокации T4SS и последующее не происходит до тех пор , пока не достигнет Coxiella кислой лизосомы , производныйорганеллы, приблизительно 8 ч после инфицирования 17,21. На сегодняшний день более 130 Dot / ИВМ эффекторы были идентифицированы 9,17,22-24. Многие из этих эффекторов , вероятно , играют важную роль в процессе репликации Coxiella внутри клеток - хозяев; Тем не менее, лишь немногие эффекторы были функционально характеризуется 25-29.

В данном исследовании мы используем анализ транслокации флуоресценции на основе , которая опирается на расщепления субстрата CCF2-AM FRET (далее в качестве субстрата Бламу) через β-лактамазы активности в цитоплазме клетки - хозяина (рис 1). Интересующий ген слит с TEM-1 бета-лактамазы (Бламу) на репортерной плазмидой, которая обеспечивает конститутивную экспрессию. Субстрат Бламу состоит из двух флуорофоров (кумарин и флуоресцеин), которые образуют пару разъедать. Возбуждение результатов кумарина в ладу флуоресцеина и зеленого флуоресцентного излучения в отсутствие эффекторных транслокации; Тем не менее, если Дву-M-эффектор слитый белок транслоцируется в цитоплазме хозяина, в результате β-лактамазы расщепляет деятельности по β-лактам кольцо подложки Бламу, отделяя пары FRET по производству синего флуоресцентное излучение при возбуждении. Этот анализ транслокация было хорошо зарекомендовала себя как подход к идентификации эффекторных белков из ряда различных внутриклеточных и внеклеточных бактерий, в том числе С. burnetii, Л. pneumophila, Л. longbeachae, хламидиоза, энтеропатогенные Е. палочка, сальмонелла и Brucella 17,30-35.

Для определения роли конкретных факторов хозяина на Coxiella эффекторной транслокации мы используем устоявшийся метод молчанием генов , известного как РНК - интерференции, в частности малых интерферирующих РНК (миРНК). Первоначально определены в Caenorhabditis Элеганс, РНК - интерференция является сохраняющимся эндогенный клеточный процесс , используемый для врожденной оборNSE от вирусов, а также регуляции генов 36,37. После связывания последовательности конкретных миРНК, деградация мРНК происходит через RISC (РНК-индуцированного глушителей комплекса) приводит к определенному молчанием генов или бросовой 38. В этом исследовании миРНК был использован для целевой двух белков хозяина, Rab5A и Rab7A, которые являются важными регуляторами эндоцитотического пути. Влияние глушителей Rab5A и Rab7A на эффекторной транслокации было установлено с помощью С. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 был выбран , как это было показано ранее , транслоцироваться системой секреции Дот / Icm из Coxiella 17.

Используя оба миРНК глушителей гена и fluorescencebased анализа транслокации , описанный здесь, мы начинаем установить роль факторов хозяина в транслокации эффекторных белков с помощью Coxiella. Такой подход может быть применен к широкому кругу обеих внутриклеточной и внеклеточной бактерий, которые обладают сходными secretioN системы, отвечающие за транслокацию эффекторных белков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Все процедуры , связанные с ростом или манипулирования Coxiella burnetii RSA439 NMII должны быть выполнены в физическом уровне Контеймент 2 Лаборатория и в кабинете биологической безопасности в соответствии с местными правилами. Принципиальная схема обратной трансфекции и транслокации анализа рабочего процесса , описанного ниже, показан на рисунке 2.

1. Приготовление C. burnetii Культура Выражая CBU0077 слитую с бета-лактамазы (pBlaM-CBU0077) (1 день)

  1. Подготовка 1X ACCM-2 6:
    1. Смешайте компоненты , перечисленные в таблице 1. Отрегулируйте рН до 4,75 с 6 М NaOH и фильтр стерилизовать (не автоклав). ACCM-2 стабилен в течение приблизительно трех недель хранили при 4 ° С.
  2. Сформировать C. запасы burnetii pBlaM-CBU0077.
    1. Заражайте HeLa 229 клеток с C. burnetii штамм переноски pBlaM-CBU0077 и проход до большого vacuolЕ. С. наблюдаются в большинстве клеток.
      1. Растут C. burnetii штамм , несущий pBlaM-CBU0077 в 20 мл ACCM-2 , содержащей 3 мкг / мл хлорамфеникола в 75 см 2 для тканевой культуры колбы с вентилируемой крышкой в течение 7 дней при температуре 37 ° С в 5% CO 2, 2,5% O 2.
      2. Центрифуга C. burnetii pBlaM-CBU0077 культуры при 15000 х г в течение 15 мин при комнатной температуре.
      3. Повторно приостанавливать осадок в 20 мл DMEM + 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), + 3 мкг / мл хлорамфеникола (техническое обслуживание средств массовой информации). Удалить носитель из 50% сливающийся 75 см 2 колбы клеток HeLa 229. Добавить ресуспендировали C. burnetii в клетках HeLa 229. Инкубировать в течение 2 -х дней при температуре 37 ° С в 5% CO 2 , чтобы позволить инфекции клеток HeLa , 229 , чтобы установить.
      4. Сплит клеток в 175 см 2 колбу с тканевой культурой.
        1. Удалите носитель из колбы 75 см 2 и промывают монослой дважды 10 мл подогретого PBS.
        2. Добавить 1 мл оF 0,05% трипсин-ЭДТА и место клетки при 37 ° C + 5% CO 2 в течение 3 - 5 мин , чтобы отделить клетки.
        3. Повторное приостановить клеток в 10 мл поддерживающей сред. Добавьте 2 мл взвешенное клеток в 175 см 2 колбу , содержащую 38 мл поддерживающей сред.
        4. Инкубируют при 37 ° С в 5% CO 2 в течение 3 - 5 дней до 100% конфлуэнтности пока не будет достигнуто и наблюдаются большие вакуоли.
    2. Собрать супернатанта от 2 см колбу 175, добавляют 10 мл дН 2 O , чтобы покрыть инфицированные клетки HeLa 229 и инкубировать в течение 15 мин для лизиса инфицированных клеток.
    3. Объединить супернатанта и подвергали лизису клеток и осадок при 15000 х г в течение 15 мин при комнатной температуре.
    4. Повторное приостановить осадок в 10 мл дН 2 O. Клетки Lyse далее неоднократно проходя ресуспензию через 23G иглы, прикрепленной к шприц объемом 10 мл, по меньшей мере в 20 раз. Гранула при 500 х г в течение 5 мин для удаления остатков клеток.
    5. Удалить и осадок супернатант при 15000 & bull ; g в течение 15 мин при комнатной температуре , чтобы собрать C. burnetii.
    6. Повторное приостановить C. burnetii в DMEM + 10% FCS и количественного определения количества бактерий в соответствии с 4. Разбавить до 1 × 10 9 геномов / мл с использованием DMEM + 10% FCS + 10% диметилсульфоксид (ДМСО), аликвоты 50 акций мкл в микроцентрифужных пробирках и хранят при -80 ° С.
  3. Привить 10 мл подогретого ACCM-2 , содержащей 3 мкг / мл хлорамфеникола с 20 мкл C. burnetii pBlaM-CBU0077 штамм 17 (из запасов , образующихся в 1,2 хранили при -80 ° С) в 25 см 2 тканевой культуры колбы с вентилируемой крышкой. Grow бактериальной культуры в течение 7 дней при температуре 37 ° С в 5% CO 2, 2,5% O 2.

2. Обратный Трансфекция киРНК и обсеменения HeLa 229 клеток (День 4)

  1. При использовании экспериментальной Серна впервые приготовитькиРНК следующим образом:
    1. Кратко центрифугировать лиофилизированный миРНК, чтобы гарантировать, что миРНК осадок собирают в нижней части трубы.
    2. Повторное приостановить Осажденный миРНК до конечной концентрации акций 20 мкМ пипеткой соответствующий объем 1x миРНК буфера (таблица 2).
    3. Пипетировать раствор вверх и вниз 3 - 5 раз перемешать и место на орбитальном смесителе в течение 30 мин при комнатной температуре, переворачивая пробирку каждые 5 - 10 мин.
    4. Кратко отцентрифугировать пробирку для того чтобы обеспечить миРНК собирается в нижней части трубы.
    5. Алиготе миРНК в 50 мкл аликвоты в микроцентрифужных труб и хранить при температуре -20 ° С, пока не требуется.
    6. Для создания 1 мкМ рабочих концентрацию миРНК, пипетка 950 мкл 1X буфера миРНК в 50 мкл аликвоты запаса (20 мкМ) в случае необходимости. Примечание: Эта 1 мкМ рабочая концентрация может быть сублимацией оттаивали несколько раз для повторных трансфекциях.
  2. Поместите DMEM + 10% FCS,; 0,05% трипсин-ЭДТА и PBS, в С водяной бане при 37 ° (или эквивалент) в течение 30 мин, чтобы нагреть перед использованием.
  3. Получение компонентов трансфекции:
    Примечание: Следующий протокол был оптимизирован для HeLa 229 клеток в 96-луночного микропланшета с черными стенами и плоской, прозрачным дном. Оптимизация количества реагента для трансфекции, концентрация миРНК и высева плотность клеток могут быть необходимы для различных клеточных линий.
    1. Для каждой лунки, используют 0,1 мкл реагента для трансфекции, 15,9 мкл уменьшенного сыворотки среда (минимальной основной среде , используемой для трансфекциях, обратитесь к таблице материалов) и 4 мкл 1 мкМ миРНК ( что приводит к конечной концентрации киРНК 40 нМ). Используйте отдельные микроцентрифуге трубки для OTP, PLK1, Rab5A и Rab7A. Измерьте каждое условие анализа в трех экземплярах. Пример компоновки пластины 96-луночного показана на рисунке 3.
      Примечание: Этот протокол включает в себя использование двух элементов управления: OTP и PLK1. ОТРсостоит из четырех объединенных миРНК, которые были оптимизированы для уменьшения вне цели эффектов и, таким образом, ОТР используют в качестве отрицательного, ненацеливании контроля. Зашифрованный миРНК также могут быть использованы в качестве отрицательного контроля. Потеря результатов экспрессии PLK1 в обширной гибели клеток в ряде клеточных линий путем индукции проапоптотического путей и, следовательно, PLK1 миРНК используется в качестве положительного контроля для трансфекции, где гибель клеток коррелирует эффективность трансфекции.
      1. Для каждой экспериментальной миРНК трансфекции, объединить 0,4 мкл реагента для трансфекции и 63,6 мкл с пониженным содержанием сыворотки среды в отдельной пробирке. Мешалке все микроцентрифуге трубки и позволяют компоненты комплекса в течение 5 мин при комнатной температуре.
      2. Добавить 16μl каждой экспериментальной миРНК к соответствующим микроцентрифужных пробирки, содержащие комплекс трансфекцию. Vortex и инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре. Примечание: Важно, чтобы не превышать 30 мин, так как эффективность трансфекции будет уменьшаться.
  4. В течение 20 мин вклubation (2.3.1.2) добавляют 20 мкл реагента для трансфекции + уменьшенного сыворотки среды + миРНК смесь в соответствующие лунки стерильный черный, плоский прозрачным дном лотка 96-луночного.
  5. Как только 20 мин инкубационный период завершается, семена HeLa 229 клеток при плотности 3,92 × 10 3 клеток / лунку.
    1. Урожай HeLa 229 клеток из сливного или суб-сливающийся 75 см 2 для тканевой культуры колбы в предварительно нагретый DMEM + 10% FCS , и повторно приостанавливать клеток до конечной плотности 4,9 × 10 4 клеток / мл в соответствии со стандартными методами. Для того, чтобы обеспечить трансфекцию эффективность не скомпрометированы, подготовить клетки в течение 20 - минутного периода инкубации (2.3.1.2).
      1. Промыть монослой HeLa 229 клеток дважды 10 мл подогретого PBS.
      2. Добавьте 1 мл 0,05% раствора трипсина-ЭДТА и место HeLa 229 клеток при 37 ° С + 5% CO 2 в течение 3 - 5 мин , чтобы отделить клетки.
      3. Сбор клеток в 9 мл подогретого DMEM + 10% FCС. Граф клеток с использованием гемоцитометра и подготовить клетки к конечной плотности 4,9 × 10 4 клеток / мл с использованием DMEM + 10% FCS.
    2. Пипеток 80 мкл HeLa 229 клеток при плотности 4,9 × 10 4 клеток / мл в каждую лунку , которая содержит трансфекцию реагент + уменьшенного сыворотки среда + миРНК смесь. Это соответствует плотности клеток 3,92 × 10 3 клеток / лунку.
      Примечание: вычитание фона требуется для подложки Бламу.
      1. Не добавляйте клетки или миРНК в "пустые" скважины (рисунок 3). Вместо этого добавьте 80 мкл DMEM + 10% FCS этих скважин, установленных в трех экземплярах.
    3. Инкубируют в течение 24 ч при 37 ° С + 5% CO 2.

3. Изменение СМИ (ДЕНЬ 5)

  1. Через 24 часа, удалите носитель с помощью многоканального адаптера, присоединенную к источнику вакуума или вручную с помощью многоканальной пипетки, и заменить 100 мкл свежей prewarmред DMEM + 10% FCS.
  2. Инкубируют в течение еще ​​48 ч при 37 ° С ± 5% CO 2.
  3. На данный момент, проверить жизнеспособность клеток визуально с использованием стандартного светового микроскопа. Если обратный трансфекция была успешной, значительная гибель клеток будет наблюдаться в лунках, содержащих Plk1 миРНК по сравнению с OTP миРНК.

4. Количественное Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 штамма с использованием КПЦР (ДЕНЬ 7)

  1. После 7 дней роста в ACCM-2 при 37 ° С в 5% СО 2, 2,5% O 2 (1,3), центрифугировать 10 мл C. burnetii pBlaM-CBU0077 культуры при 15000 х г в течение 15 мин при комнатной температуре.
  2. Повторное приостановить бактериальных гранул в 10 мл подогретого DMEM + 10% FCS. Готовят в соотношении 1:10 и 1: 100 разведени культуры (образца) с использованием дН 2 O.
  3. Настройте компоненты, необходимые для кПЦР.
    Примечание: извлечение гДНК может быть выполнена заранее и хранить при температуре от -20 ° C UNTтребуется ил.
    1. Подготовка стандартов:
      1. Экстракт GDNA из Coxiella burnetii RSA439 NMII штамма дикого типа , выращенных в ACCM-2 при 37 ° С в 5% CO 2, 2,5% O 2 в течение 7 дней с использованием набора для экстракции GDNA, в соответствии с инструкциями изготовителя.
      2. Измеряют концентрацию GDNA (г / мкл) с использованием NanoDrop (или эквивалент) при поглощении 260 нм.
      3. Подсчитайте количество геномных копий на мкл с использованием следующей формулы ниже, и преобразование в несколько геномов / мл.
        figure-protocol-1
      4. Регулировка количества геномов / мл до 10 9 / мл (в конечном объеме 100 мкл) в новой пробирке с использованием дН 2 O. Это может быть кипятили в течение 10 мин и хранили при -20 ° С до тех пор, пока требуется.
      5. В день инфицирования, генерировать 10-кратных серийных разведений 10 8 геномов / мл до 10 5 геномов / мл из 10 9 геномаs / мл запаса.
        1. Пипетка 10 мкл 10 9 геномов / мл в 90 мкл дН 2 O для создания 10 8 геномы / мл. Vortex перемешать. Пипетка 10 мкл 10 8 геномов / мл в 90 мкл дН 2 O для создания 10 7 геномы / мл. Vortex и повторить до 10 5 геномов / мл.
    2. Настройка реакции КПЦР. Создание мастер-микс для 25 скважин для учета любых ошибок при использовании пипеток. Для каждой лунки, используйте 10 мкл КПЦР Master Mix; 2 мкл смеси праймера ОмПО (4.3.2.2) и 3 мкл дН 2 O.
      Примечание: OmpA представляет собой внешний мембранный белок С. burnetii '39 и блок 82-пар оснований в пределах высококонсервативной области был выбран для применения в качестве зонда , как было описано выше 40.
      1. Настройка каждого стандарта (Dh 2 O, 10 5, 10 6, 10 7, 10 8, 10 9 геномов / мл) и образец (1:10 и разведение 1: 100) в 96-луночный ПЦР отторгнуть пластину (не огибать) в двух экземплярах или трех экземплярах, соответственно. Добавьте 5 мкл образца или стандарта в соответствующие лунки.
      2. Использование дН 2 O, разбавить как OmpA прямого праймера (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 ') и обратного праймера , OmpA (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') до конечной концентрации 4 мкМ и комбинируются в то же пробирке.
        Примечание: Смесь праймер OmpA можно приготовить заранее и хранить при -20 ° С до тех пор , пока требуется.
      3. Объединить 250 мкл КПЦР Master Mix, 50 мкл смеси ОмПО праймера, 75 мкл дН 2 O и вихревую перемешать. Добавьте 15 мкл этой основной смеси в лунки, содержащие либо стандарты или образцы.
      4. Поместите 8-крышки ПЦР стрип крышки на соответствующие лунки и импульсной центрифуге пробирки для ПЦР, чтобы убедиться, что все собранные в нижней части труб.
      5. Настройте следующую программу на количественной ПЦР маскула: 50 ° С в течение 2 мин, 95 ° С в течение 10 мин, а затем 45 циклов при 95 ° С в течение 1 сек и 60 ° C в течение 20 сек (рис 4а).
    3. Анализ Ct (пороговый цикл) значения из кПЦР:
      1. Передача значения Ct в электронную таблицу с помощью функции экспорта программы.
      2. Создайте диаграмму рассеяния стандартов 10 5 геномов / мл до 10 9 геномов / мл (выраженное в виде значений LOG). Откажитесь от любых явных выбросов среди трех образцов. Генерация логарифмической трендовая и определить уравнение графика.
      3. Подсчитайте общее количество геномов / мл в образце с использованием уравнения генерируемый в 4.3.3.2. Не забудьте учесть первоначального разведения (1:10 и 1: 100) образцов.

5. Инфекция обратного трансфицированных клеток (ДЕНЬ 7)

  1. После расчета суммарных геномы / мл в C. репейникnetii pBlaM-CBU0077 культуры , которые будут использоваться для инфекции, скорректировать ресуспендировали бактериальной культуры , чтобы инфицировать клетки при MOI 300 в конечном объеме 50 мкл / лунку с использованием предварительно нагретые DMEM + 10% FCS.
    Примечание: ожидаемая плотность посеянных клеток HeLa 229 с нормальным временем удвоения после 72 ч составляет 3,136 × 10 4 клеток / лунку. Количество бактерий , необходимых для инфицирования при MOI 300 составляет 9.408 × 10 6 в 50 мкл, что эквивалентно 1,88 × 10 8 бактерий / мл.
    1. Используя значение , вычисленное из КПЦР (геномов / мл) (4.3.3.3), разбавить ресуспендировали бактерий с использованием предварительно нагретого DMEM + 10% FCS , в конечном объеме 2 мл , чтобы инфицировать обратные трансфецированных клеток.
  2. Удалите существующий носитель из заготовки и обратного трансфицированных клеток.
  3. Добавляют 50 мкл разведенных бактерий (1,88 × 10 8 бактерий / мл) в соответствующие лунки. Добавляют 50 мкл DMEM + 10% FCS к обоим заготовкой и Uninfected скважин.
  4. Инкубируют в течение 24 ч при 37 ° С + 5% CO 2.

6. Добавление Бламу субстрата для определения уровня транслокации (ДЕНЬ 8)

  1. Подготовка решения для Бламу субстрата раствором 6х нагрузки.
    Примечание: раствор А, В и С представлены в наборе подложки Бламу (обратитесь к таблице материалов). Раствор B может образовывать осадок при комнатной температуре. Подогрейте этот раствор до 37 ° C перед использованием и осадок должен раствориться.
    1. При использовании набора в первый раз, добавьте 185 мкл ДМСО (поставляется с комплектом подложки Бламу) в высушенном Solution A. Затем сохраните ресуспендировали растворе при -20 ° C.
    2. Приготовьте 0,1 М раствора пробеницида заранее и хранить в аликвоты объемом 1 мл при температуре от -20 ° С до тех пор, пока требуется.
      1. Приготовьте 0,4 М NaOH (1,6 г в 100 мл дН 2 O).
      2. Подготовьте 100 мМ Na фосфатный буфер с рН 8 (1,56 г NaH 2 PO 4 · 2H 2 O и 1,41 г Na 2 HPO 4 в 100 мл дН 2 O).
      3. Растворить 1,25 г пробеницида в 22 мл 0,4 М NaOH при интенсивном перемешивании.
      4. Добавить 22 мл 100 мМ Na фосфатный буфер с рН 8 (раствор будет мутнеть) и перемешивают для растворения осадка, который образуется.
      5. Доводят рН до 8 (при необходимости) с помощью 1 М NaOH / HCl.
      6. Перемешать энергично и тепло мягко (<50 ° С) до тех пор, пока раствор не станет в основном ясно.
      7. Фильтр (0,2 мкм размер пор) и аликвоты в объеме 1 мл. Храните аликвоты при -20 ° C.
  2. Для каждой лунки, используйте 0,06 мкл раствора А, 0,54 мкл раствора В, 7,9 мкл раствора C и 1,5 мкл 0,1 М пробеницида. Создание мастер-микс для 30 лунок сначала комбинированием 1,8 мкл раствора А и 16,2 мкл раствора B вместе в пробирке. Хорошо перемешать с помощью вихря. Добавьте 237 мкл раствора С и 45 мкл 0,1 М пробеницида. Vortex объединить все Componenц.
    Примечание: 6х загрузки раствор стабилен в течение до 4 ч (в темноте), но должны быть готовы как можно ближе перед использованием.
  3. Добавьте 10 мкл 6х погрузочной раствора непосредственно во все заготовки и реверс трансфицированных скважин без удаления существующих средств массовой информации.
  4. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 2 ч в темноте.
  5. Для того, чтобы определить уровень транслокации, определения количества флуоресценции с использованием микропланшет-ридера.
    Примечание: Следующая процедура является специфическим для читателя ClarioSTAR микропланшетов. Эквивалентные читатели микропланшетов также могут быть использованы.
    1. Создать новый протокол интенсивности флуоресценции с использованием конечной точки в режиме чтения.
    2. Настройте основные параметры следующим образом:
      1. Выберите 96-луночный микропланшет.
      2. Под оптическими параметрами, выберите 2 multichromatics со следующими пользовательскими настройками: (1) Входной 410-10 нм возбуждение и излучение 520-10 нм. (2) Ввод 410-10 нм возбуждения и эмиссии 450-10 нм. Обеспечить хорошо стьichromatics выбран.
      3. Выберите орбитальную усреднение с диаметром 3 мм.
      4. Под оптикой, выберите нижний оптический элемент.
      5. По скорости и точности, выберите точный. Это соответствует восьми регионов на лунку.
    3. Отрегулируйте расположение пластины, выбрав соответствующие лунки в качестве образцов.
    4. Выберите измерение начало.
    5. Снимите крышку и поместите лоток в ридере. Для того, чтобы избежать достижения максимальных значений флуоресценции, убедитесь, что значение коэффициента усиления регулируется. Для этого выполнить регулировку усиления на одном из зараженных колодцев, которая была обратной, трансфицированных OTP миРНК. Это соответствует самой высокой ожидаемой транслокации.
    6. Выберите измерение начинают измерять все соответствующие лунки с использованием донных флуоресценции при возбуждении 410 нм и эмиссии как 450 нм и 520 нм для синего и зеленого свечения, соответственно.

7. Анализ результатов:

  1. Рассчитать отношение450 нм до 520 нм (синий на зеленый) для всех образцов следующие сокращения пустой и выразить по отношению к неинфицированным образца OTP.
    Примечание: следующие шаги анализа предназначены для простой программы электронных таблиц.
    1. Используя функцию экспорта на планшет - ридере, передавать необработанные значения флуоресценции , полученные как для 520 нм и 450 нм длиной волны излучения (6.5) в электронную таблицу.
    2. Вычислить среднее значение "пустой" чтений (СМИ только, без клеток) для 520 нм, добавляя сырые 520 нм значения флуоресценции и деления на количество скважин (3). Повторите, используя пустые 450 нм значения. Эти значения представляют фоновой флуоресценции из-за 96-луночного планшета и средств массовой информации.
    3. Вычтите фоновой флуоресценции. Используя значения , полученные в 7.1.2 вычесть среднее заготовки 520 нм от всех значений нм флуоресценции образца 520. Повторите эти действия для значений 450 нм.
    4. Чтобы получить 450: соотношение 520 нм использовать пустые скорректированных значений (7.1.3). Разделите каждый образец 450 нм значение флуоресценции его соответствующим 520 нм значение.
    5. Вычислить среднее значение неинфицированных значений отношения КАП путем добавления 450: значения соотношения нм 520 (от 7.1.4) и деления на количество скважин (3).
    6. Рассчитывают соотношение количества образцов по отношению к неинфицированным OTP путем деления 450: 520 нм соотношение , рассчитанное в 7.1.4 в среднем неинфицированных значения отношения ОТП вычисленной в 7.1.5.

8. Добавление ядер Stain, чтобы определить после сотового телефона транслокации анализа (ДЕНЬ 8)

  1. После количественного определения флуоресценции, удалите носители, содержащие 6х решение загрузки из всех скважин с использованием либо адаптера многоканального подключенного к источнику вакуума или вручную с помощью многоканальной пипетки.
  2. Добавляют 50 мкл 4% раствора PFA (параформальдегид)в PBS, чтобы все соответствующие лунки для фиксации клеток. Инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин.
  3. Удалить 4% раствора PFA PBS (согласно 8.1) и мыть клетки дважды с 75 мкл PBS.
  4. Добавляют 50 мкл клеточной проницаемой, окрашивающий ядра, например, DAPI (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол), в каждую лунку. Получение изображений с помощью флуоресцентного микроскопа и количественного определения количества ядер , присутствующих в каждую лунку после лечения миРНК с использованием соответствующего программного обеспечения для анализа изображений, таких как ImageJ 41.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для этого исследования, C. burnetii pBlaM-CBU0077 штамм был выбран в качестве CBU0077 было ранее показано, что транслокация эффектор системы 17 секреции Coxiella Дот / ICM. До инфекции, общее количество геномов / мл в семидневный C. burnetii pBlaM-CBU0077 культуры был причислен использованием КПЦР. Рисунок 4 демонстрирует пример порогового цикла (Ct) значения ожидаются от обоих стандартов и образцов следующих кПЦР. Значения Ct (предс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Секреция систем, а также бактериальные эффекторные белки эти транспортные системы в цитоплазму клеток-хозяев, являются важным компонентом вирулентности, что многие патогенные бактерии используют для установления инфекции в уникальных репликативному ниш. В центре внимания многих исследовательских групп было исследовать взаимодействие между бактериальными эффекторов и белков хозяина и влияние эти эффекторы оказывают на хост-клеточных путей. Очень ограниченные исследования, если таковые имеются, изучило потенциал для белко...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям (NHMRC) (Grant ID 1062383 и 1063646), присужденными HJN. EAL поддерживается Австралийской премией для аспирантов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Реагенты
Лимонная кислотаSigmaC0759ACCM-2 среднекомпонентный
Цитрат натрияSigmaS4641ACCM-2 среднекомпонентный
Фосфат калияSigma60218ACCM-2 среднекомпонентный
Магния хлоридCalbiochem442611ACCM-2 средний компонент компонент
Хлорид кальцияSigmaC5080ACCM-2 средний компонент
Сульфат железаFisherS93248ACCM-2 средний компонент
Хлорид натрияSigmaS9625ACCM-2 средний компонент
L-цистеинSigmaC6852ACCM-2 средний компонент
Bacto-neopeptoneBD211681среда ACCM-2 компонент
КазаминокислотыFisherBP1424ACCM-2 средний компонент
Метилбета циклодекстринSigmaC4555ACCM-2 средний компонент
RPMI + глутамаксThermoFisher Scientific61870-036ACCM-2 средний компонент
ХлорамфениколSigmaC0378Для бактериальной культуры
ON-TARGETplus Нецелевой контроль Пул (OTP)DharmaconD-001810-10-05Нецелевой контроль
siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpoolDharmaconM-003290-01-005Вызывает гибель клеток; мера эффективности трансфекции
siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpoolDharmaconM-004009-00-0005
siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpoolDharmaconM-010388-00-0005
5x буфер миРНКDharmaconB-002000-UB-100Используйте стерильную воду, не содержащую РНКазы, для разбавления 5x буфера миРНК до 1x буфера миРНК
DharmaFECT-1 Реагент для трансфекцииDharmaconT-2001-01Для трансфекции
Opti-MEM + GlutaMAXThermoFisher Scientific51985-034Среда с пониженным содержанием сыворотки, используемая для трансфекции
DMEM + GlutaMAXThermoFisher Scientific10567-014Для клеточной культуры и инфекции
Термоинактивированная фетальная сыворотка теленка (FCS)Thermo ScientificSH30071.03Можно использовать альтернативный эквивалентный продукт
DMSOSigmaD8418Для хранения штамма Coxiella
PBSДля клеточной культуры
0,05% Трипсин + ЭДТАThermoFisher Scientific25300-054Для клеточной культуры
dH2OДля разведения образцов и стандартов для количественной ПЦР
Quick-gDNA Mini PrepZYMO ResearchD3007Можно использовать альтернативный эквивалентный продукт для экстракции гДНК
SensiFAST SYBR No-ROX KitBiolineBIO-98020Можно использовать альтернативный эквивалент мастер-смеси для qPCR для qPCR реакции
LiveBLAzer FRET-B/G Загрузочный набор с CCF2-AMInvitrogenK1032Для измерения транслокации с помощью флуоресценции и генерации 6X нагрузочного раствора (содержит растворы A, B, C и DMSO)
Гидроксид натрияMerck106469компонент раствора пробеницида
одноосновной фосфат натрия одноосновной Sigma71505Компонент раствора пробеницида
ди-натрия гидроортофосфатMerck106586раствор пробеницида компонент
ProbenicidSigmaP8761Компонент раствора пробеницида
DRAQ5 Раствор флуоресцентного зонда (5 мМ)ThermoFisher Scientific62251Окрашивание ядер для определения жизнеспособности клеток. Используйте 1:4000, разведенный в PBS.
4% раствор PFA (параформальдегида) в PBSSigmaP6148Фиксирующий раствор для клеток HeLa 229
25 см2 колба для культуры тканей с вентилируемым колпачкомCorning430639Для роста бактериального штамма
96 Well Flat Clear Bottom Черный полистирол TC-обработанные микропланшеты, индивидуально упакованные, с крышкой, стерильныеCorning3603
75 см<суп>2 колба для культуры тканей с вентилируемым колпачкомCorning430641Для роста клеток HeLa 229
175 см<суп>2 колба для культуры тканей с вентилируемым колпачкомCorning431080Для роста клеток HeLa 229
гемоцитометрДля количественного определения клеток HeLa 229
Tear-A-Way 96 Луночные ПЦР-планшеты4titude4ti-0750/TAДля количественной ПЦР реакция
8-Крышка цепь, плоскаяSarstedt65.989.002Для реакции количественной ПЦР
Название<strong>CompanyНомер в каталоге>Комментарии
Оборудование
Настольный микрофуг
Настольный вихревой
орбитальный миксер
ЦентрифугаEppendorf5810 RДля гранулирования бактериальной культуры
NanodropДля количественного определения гДНК
Mx3005P QPCR машинаAligent Technologies401456Для количественного определения геномов Coxiella в 7-дневной культуре
ClarioSTAR микропланшет считывательBMG LabTechДля измерения флуоресценции

Ссылки

  1. Delsing, C. E., Warris, A., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever: still more queries than answers. Adv Exp Med Biol. 719, 133-143 (2011).
  2. Delsing, C. E., Kullberg, B. J., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever in the Netherlands from 2007 to. Neth J Med. 68, 382-387 (2010).
  3. van der Hoek, W., et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Adv Exp Med Biol. 984, 329-364 (2012).
  4. Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. Lancet Infect Dis. 3, 709-721 (2003).
  5. Hoover, T. A., Culp, D. W., Vodkin, M. H., Williams, J. C., Thompson, H. A. Chromosomal DNA deletions explain phenotypic characteristics of two antigenic variants, phase II and RSA 514 (crazy), of the Coxiella burnetii nine mile strain. Infect Immun. 70, 6726-6733 (2002).
  6. Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii are facilitated by an improved axenic growth medium. Appl Environ Microbiol. 77, 3720-3725 (2011).
  7. Omsland, A., et al. Host cell-free growth of the Q fever bacterium Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4430-4434 (2009).
  8. Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. MBio. 2, e00175-e00111 (2011).
  9. Chen, C., et al. Large-scale identification and translocation of type IV secretion substrates by Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 21755-21760 (2010).
  10. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii cryptic plasmid is enriched in genes encoding type IV secretion system substrates. J Bacteriol. 193, 1493-1503 (2011).
  11. Beare, P. A., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. A. Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Front Microbiol. 2, 97(2011).
  12. Beare, P. A., Larson, C. L., Gilk, S. D., Heinzen, R. A. Two systems for targeted gene deletion in Coxiella burnetii. Appl Environ Microbiol. 78, 4580-4589 (2012).
  13. Howe, D., Shannon, J. G., Winfree, S., Dorward, D. W., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii phase I and II variants replicate with similar kinetics in degradative phagolysosome-like compartments of human macrophages. Infect Immun. 78, 3465-3474 (2010).
  14. Heinzen, R. A., Scidmore, M. A., Rockey, D. D., Hackstadt, T. Differential interaction with endocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of Coxiella burnetii and Chlamydia trachomatis. Infect Immun. 64, 796-809 (1996).
  15. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cell Microbiol. 9, 891-909 (2007).
  16. Beare, P. A. Genetic manipulation of Coxiella burnetii. Adv Exp Med Biol. 984, 249-271 (2012).
  17. Carey, K. L., Newton, H. J., Luhrmann, A., Roy, C. R. The Coxiella burnetii Dot/Icm system delivers a unique repertoire of type IV effectors into host cells and is required for intracellular replication. PLoS Pathog. 7, e1002056(2011).
  18. Segal, G., Shuman, H. A. Possible origin of the Legionella pneumophila virulence genes and their relation to Coxiella burnetii. Mol Microbiol. 33, 669-670 (1999).
  19. Zamboni, D. S., McGrath, S., Rabinovitch, M., Roy, C. R. Coxiella burnetii express type IV secretion system proteins that function similarly to components of the Legionella pneumophila Dot/Icm system. Mol Microbiol. 49, 965-976 (2003).
  20. Zusman, T., Yerushalmi, G., Segal, G. Functional similarities between the icm/dot pathogenesis systems of Coxiella'burnetii and Legionella pneumophila. Infect Immun. 71, 3714-3723 (2003).
  21. Newton, H. J., McDonough, J. A., Roy, C. R. Effector Protein Translocation by the Coxiella burnetii Dot/Icm Type IV Secretion System Requires Endocytic Maturation of the Pathogen-Occupied Vacuole. PLoS One. 8, e54566(2013).
  22. Lifshitz, Z., et al. Computational modeling and experimental validation of the Legionella and Coxiella virulence-related type-IVB secretion signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E707-E715 (2013).
  23. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii ankyrin repeat domain-containing protein family is heterogeneous, with C-terminal truncations that influence Dot/Icm-mediated secretion. J Bacteriol. 191, 4232-4242 (2009).
  24. Weber, M. M., et al. Identification of C. burnetii type IV secretion substrates required for intracellular replication and Coxiella-containing vacuole formation. J Bacteriol. , (2013).
  25. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Luhrmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-678 (2013).
  26. Larson, C. L., Beare, P. A., Howe, D., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii effector protein subverts clathrin-mediated vesicular trafficking for pathogen vacuole biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4770-E4779 (2013).
  27. Luhrmann, A., Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetii type IV effector protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18997-19001 (2010).
  28. Newton, H. J., et al. A screen of Coxiella burnetii mutants reveals important roles for Dot/Icm effectors and host autophagy in vacuole biogenesis. PLoS Pathog. 10, (2014).
  29. Pan, X., Luhrmann, A., Satoh, A., Laskowski-Arce, M. A., Roy, C. R. Ankyrin repeat proteins comprise a diverse family of bacterial type IV effectors. Science. 320, 1651-1654 (2008).
  30. Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
  31. de Felipe, K. S., et al. Legionella eukaryotic-like type IV substrates interfere with organelle trafficking. PLoS Pathog. 4, e1000117(2008).
  32. de Jong, M. F., Sun, Y. H., den Hartigh, A. B., van Dijl, J. M., Tsolis, R. M. Identification of VceA and VceC, two members of the VjbR regulon that are translocated into macrophages by the Brucella type IV secretion system. Mol Microbiol. 70, 1378-1396 (2008).
  33. Raffatellu, M., et al. Host restriction of Salmonella enterica serotype Typhi is not caused by functional alteration of SipA, SopB, or SopD. Infect Immun. 73, 7817-7826 (2005).
  34. Wood, R. E., Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Dot/Icm Effector Translocation by Legionella longbeachae Creates a Replicative Vacuole Similar to That of Legionella pneumophila despite Translocation of Distinct Effector Repertoires. Infect Immun. 83, 4081-4092 (2015).
  35. Mueller, K. E., Fields, K. A. Application of beta-lactamase reporter fusions as an indicator of effector protein secretion during infections with the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. PLoS One. 10, (2015).
  36. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
  37. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  38. Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e252(2015).
  39. Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS Pathog. 10, e1004013(2014).
  40. Jaton, K., Peter, O., Raoult, D., Tissot, J. D., Greub, G. Development of a high throughput PCR to detect Coxiella burnetii and its application in a diagnostic laboratory over a 7-year period. New Microbes New Infect. 1, 6-12 (2013).
  41. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  42. Prashar, A., Terebiznik, M. R. Legionella pneumophila: homeward bound away from the phagosome. Curr Opin Microbiol. 23C, 86-93 (2014).
  43. McDonough, J. A., et al. Host Pathways Important for Coxiella burnetii Infection Revealed by Genome-Wide RNA Interference Screening. MBio. 4 (1), e00606-e00612 (2013).
  44. Farfan, M. J., Toro, C. S., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella enterotoxin-2 is a type III effector that participates in Shigella-induced interleukin 8 secretion by epithelial cells. FEMS Immunol Med Microbiol. 61, 332-339 (2011).
  45. Al-Khodor, S., Price, C. T., Habyarimana, F., Kalia, A., Abu Kwaik, Y. A Dot/Icm-translocated ankyrin protein of Legionella pneumophila is required for intracellular proliferation within human macrophages and protozoa. Mol Microbiol. 70, 908-923 (2008).
  46. Geddes, K., Worley, M., Niemann, G., Heffron, F. Identification of new secreted effectors in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Infect Immun. 73, 6260-6271 (2005).
  47. Sory, M. P., Boland, A., Lambermont, I., Cornelis, G. R. Identification of the YopE and YopH domains required for secretion and internalization into the cytosol of macrophages, using the cyaA gene fusion approach. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 11998-12002 (1995).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

FRET-анализсайленсинг Rab5Aсайленсинг Rab7Aрепортер BlaMвзаимодействие хозяина и патогенаклеточная микробиологияизмерение флуоресценции
Применение флуоресцентного резонанса переноса энергии (FRET) для изучения Эффектор транслокации эффективности путем
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.