Method Article

Анализ мозга Митохондрии Использование последовательного Block-Face сканирующая электронная микроскопия

DOI:

10.3791/54214

⸱

July 9th, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Virginia Tech Carilion Research Institute, 2Renovo Neural Incorporated

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Визуализация и анализ митохондриальных тканей мозга млекопитающих — сложная задача. В этой статье мы опишем, как трехмерный (3D) анализ реконструкции с помощью последовательной сканирующей электронной микроскопии (SBFSEM) может быть использован для получения представления о морфологическом и объемном анализе этой критически важной органеллы, генерирующей энергию.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человеческий мозг является высокое потребление энергии орган, который в основном опирается на глюкозу в качестве источника топлива. Глюкоза катаболизируется митохондрий мозга с помощью гликолиза, пути три-карбоновой кислоты (ТСА) цикл и окислительного фосфорилирования (OXPHOS) для получения клеточной энергии в виде аденозинтрифосфата (АТФ). Нарушение митохондриальной АТФ вызывает митохондриальных нарушений, которые представляют клинически с видными неврологическими и миопатии симптомов. Митохондриальные дефекты также присутствуют в неврологическими расстройствами (например , расстройства спектра аутизма) и нейродегенеративных расстройств (например , боковой амиотрофический склероз, болезнь Альцгеймера и болезни Паркинсона). Таким образом, существует повышенный интерес к области для проведения 3D анализа митохондриальной морфологии, структуры и распределения в рамках обоих здоровых и болезненных состояний. Мозг митохондриальная морфологии чрезвычайно разнообразны, с некоторыми митохондрии особенно всинаптической области находится в диапазоне от <диаметром 200 нм, что ниже предела разрешения традиционной световой микроскопии. Выражая митохондрии нацеленную зеленый флуоресцентный белок (GFP) в головном мозге значительно повышает органоидного обнаружение с помощью конфокальной микроскопии. Тем не менее, оно не устраняет ограничения на чувствительность обнаружения относительно небольших размеров митохондрий без oversaturating образы больших размеров митохондрий. В то время как последовательная передача электронной микроскопии была успешно использована для описания митохондрии на нейронном синапсе, этот метод очень много времени, особенно при сравнении нескольких образцов. Метод последовательного блок-лицо сканирующей электронной микроскопии (SBFSEM) включает в себя автоматизированный процесс секционирования, блоки формирования изображения ткани и сбора данных. Здесь мы приводим протокол для выполнения SBFSEM из определенной области от мозга грызуна быстро реконструировать и визуализировать митохондриальной морфологии. Эта технологияNique также может быть использован для обеспечения точной информации о митохондриальной номер, объем, размер и распределение в определенной области мозга. Так как полученное разрешение изображения высокое (как правило, до 10 нм), также могут быть обнаружены какие-либо грубые митохондриальные морфологические дефекты.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондрии являются динамическими органеллы , которые изменяют свою форму и расположение в зависимости от сотовой связи киев и потребностей, в тесном взаимодействии с цитоскелета клетки, и в ответ на клеточных событий , таких как токи кальция в нейронах 1. Митохондрии также взаимодействовать с другими клеточные органеллы , например , эндоплазматический ретикулум, что , в свою очередь , регулирует их динамику и метаболизм 2. Митохондриальная морфология показывает гетерогенность в различных типах клеток т.е.. форма органеллы изменяется от трубчатой ​​до , что состоящие из листов, мешков и овалы 3. Было показано , что митохондриальные синтеза и деления белков цикл может регулировать местоположение, размер, форма и распределение митохондрий 4. Более того, изменения в митохондриальной формы связаны с нейродегенерации, нейрональной пластичности, мышечной атрофии, кальциевой сигнализации, генерации активных форм кислорода, а также продолжительность жизни и гибели клеток вовлекая тхаТ - клеток специфических митохондриальная морфологии имеет решающее значение для поддержания нормальной клеточной функции 5-11.

Одна из основных биоэнергетической функция митохондрий является создание аденозинтрифосфата (АТФ), выполнив ряд метаболических реакций , которые включают полный распад питательных веществ (т.е. глюкоза, жирные кислоты или амино-кислоты) через ЦТК и OXPHOS путей 12. Человеческий мозг составляет лишь 2% от массы тела , однако он потребляет ~ 20% от общего объема произведенной энергии делает его чрезвычайно энергию с требованием органа 13. Поэтому не удивительно , что митохондриальной дисфункцией у человека приводит к большому числу неврологических проявлений 14-17 лет. Генетические мутации в компонентах OXPHOS , которые ослабляют приводит АТФ поколения к митохондриальных нарушений 17,18, которые клинически гетерогенную группу расстройств с преобладанием ~ 1: 5000 человек, и одна из наиболее распространенных причин мetabolic расстройства у детей и взрослых. Дефицит митохондрии происхождения АТФ влияет на несколько органов и систем с требовательными органов высоких энергий , таких как мозг, сердце и скелетных мышц будучи преимущественно затронуты в этих больных 14,17,18. В последние годы, несколько исследований были получены данные для митохондриальной дисфункции у обоих неврологическими и нейродегенеративные расстройства 15-17,19,20. Поскольку митохондрии являются существенными и решающее значение для развития и функционирования мозга, что необходимо разработать протоколы, которые могут анализировать изменения мозга митохондриальной морфологии, структуры, размера, количества и распределения по обоим здоровых и больных состояний. Мышиные модели с митохондриях-целевой зеленого флуоресцентного белка (GFP) были произведены для визуализации митохондриальные движения и локализации в головном мозге 21,22. Хотя это является чрезвычайно полезным инструментом для изучения митохондриальной моторику и общее распределение, есть некоторые недостатки, которые входите ограниченное разрешение и чувствительность флуоресцентной микроскопии. Эти свойства делают его трудно отследить относительно небольшие митохондрии размера. Аналогичным образом , последовательная передача электронной микроскопии была успешно использована для просмотра синаптическую митохондрии 23, но этот метод очень много времени. Митохондриальная морфология , как известно, весьма динамично , как они проходят непрерывные деления и термоядерных циклов, и в большинстве клеток митохондрии поддерживать высокосвязных сети 24-26. Нейроны высоко поляризованные клетки с множественными дендритов и аксонов, протяженных и митохондрий , которые образуют соединение с сетью сетчатую в теле клетки , возможно , придется разделить , как они делают свой ​​путь через эти невриты (рис 1). Это делает митохондрии мозга весьма разнообразные по форме и размеру. Например, с помощью последовательного блок-слойного сканирующей электронной микроскопии (SBFSEM) метод, ранее мы наблюдали, что разница в объеме или размер внесинаптического mitochondrIA в митохондриях , присутствующих в нервных окончаниях , может быть столько , сколько шестнадцать сгиб 27.

Есть несколько подходов к проведению анализа объема 28, который включает в себя последовательный раздел TEM 29, автоматизированная лента сбора ультрамикротоме SEM 30, сфокусированный пучок ионов SEM 31 и SBFSEM 32. Анализ SBFSEM имеет преимущества в том, что она имеет разрешение предоставлять количественные данные о морфологической формы, размера, распределения и числа органелл, таких как митохондрии в районах до 1 мм мозга. Техническая операция также наименее требовательным, с сбора и анализа данных в рамках возможностей многих биологических лабораторий, которые испытывают недостаток предыдущего опыта EM. Появление коммерческих инструментов для создания последовательных секций подобные изображения сделал 3D ультраструктурную анализ тканей рутинной техникой, которая дополнительно позволяет непредвзятый анализ объемный в быстрой и повторяемым способом 28 . SBFSEM была впервые описана и используется в области нейробиологии в 2004 году 32, основанный на идее , введенной Лейтона в 1981 году 33. Несколько исследований с тех пор установили эту технику в качестве основного инструмента при анализе реконструкции нейронной цепи 34. Кроме того, для многих небольших масштабных проектов, обеспечивает анализ реконструкции для выявления клеточных органелл 27,35-39. Так, приобретенные изображения являются производными от низкого напряжения обратного рассеяния электронов, были разработаны новые протоколы окрашивания , которые сочетают в себе различные известные методы окраски тяжелых металлов , чтобы увеличить разрешение 40.

В этой статье мы приводим протокол для использования 3D электронной микроскопии и обработки изображений объемный анализ митохондрий мозга , основанный на методах, которые ранее были использованы нами и другими 38,39,41. Методы ткани после обработки , используемые были , как описано ранее Deerinck и др40.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этика Заявление: Процедуры с участием субъектов животных были одобрены Animal Care и использование комитета Institutional (IACUC) в Вирджинии с.

Внимание: Экстремальные меры предосторожности следует соблюдать осторожность при обращении и утилизации нескольких компонентов, используемых в данном протоколе. Перед использованием местных институциональных руководящих принципов и практики охраны здоровья и безопасности должны быть установлены и с последующим, в частности, для осмия, который является летучим и чрезвычайно ядовиты, уранилацетате, который является одновременно тяжелый металл и источник радиоактивности, а также нитрат свинца, который является тяжелый металл яд. Тиокарбогидразида (TCH) может разлагаться производить взрывчатые и ядовитые газы, если неправильно обрабатывается. Многие учреждения будут иметь базовый центр EM, в котором эти реагенты обычно используются и могут оказать помощь.

1. Подготовка ткани головного мозга и SBFSEM визуализации

  1. Обезболить молодой (~ 2 - 4 месяца) C57 черная мышь (C57BL / 6J штамма), используя 4 - 5% isofluraпе следуя институциональных руководящих принципов. Подтвердите обезболивание путем контроля потери мышечного тонуса, отсутствие произвольных движений и ответов на неприятные стимулы, как хвост крайнем случае.
  2. Pin мыши на рассечение лотка и сделать надрез на коже вдоль вентральной срединной линии. Сделайте дополнительные надрезы в коже, чтобы подвергать грудной клетки мыши. Надрезать диафрагму, и осторожно рассекают из грудной полости по периферии, чтобы выставить бьющееся сердце, а затем сделать надрез на правое предсердие.
  3. Использование бабочки канюлю, вводить иглу в левый желудочек. Заливать мышь транскардиальную, используя 10 - 20 мл фосфатно-солевого буфера (PBS), рН 7,2, до тех пор, пока обескровливание подтверждается изменением цвета печени.
    Примечание: Изменение цвета печени используется в качестве ориентира для определения степени обескровливания. Убедитесь, что цвет печени изменяется от красновато-коричневого до бледно-розового цвета.
  4. Заливать мышь транскардиальную, используя 10 - 20 мл 2% глутаровыхальдегид и 4% параформальдегида сделано в 0,10 М какодилатный буфер (рН 7,2), чтобы зафиксировать ткань мозга быстро изнутри. Фиксирование контролируется путем наблюдения за хвост жесткости.
    Примечание: Приготовьте 0,10 М какодилатный буфер (рН 7,2) при растворении 2,14 г какодилате натрия в 80 мл воды, добавляют соляную кислоту, чтобы довести рН, и сделать объем до 100 мл водой.
  5. После перфузию, обезглавить мышь, рассекать мозг, с последующим закреплением в 0,10 М какодилатном натрия буфера (рН 7,2) , содержащего 2% глутаральдегида и 4% параформальдегида в течение 48 ч при 4 о С.
  6. Через 48 ч , до 400 мкм Коронарные срезы , используя vibratome , а затем осторожно рассекают интересующую область в мозге (например, гиппокамп) под микроскопом рассечение 42. Аккуратно обрежьте ткань и сделайте снимок для сохранения ориентации.
    Примечание: Post методы обработки окрашивания тканей в SBFSEM сочетает в себе различные методы окрашивания тяжелых металлов вдля того , чтобы повысить разрешение и основаны на методике , разработанной ранее Deerinck соавт 40.
  7. Промыть глутаральдегида фиксированных тканей 3 раза, 5 мин каждая в 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,2).
  8. Готовят 0,1% раствор дубильной кислоты путем растворения дубильные кислоты в 0,1 М буфере какодилатном натрия (рН 7,2). Вихревой до растворения и фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм, если это необходимо.
  9. Postfix ткани с какодилате буферном 0,1% дубильной кислоты путем инкубации в 1 мл реагента в течение 30 - 60 мин при комнатной температуре.
    Примечание: Время инкубации зависит от размера ткани, но 30 мин лучше всего работает для большинства тканей.
  10. Вымойте тканей 3 раза, 5 мин каждый в какодилатном буфере (рН 7,2).
  11. Растворить 0,3 г ферроцианида калия и 0,86 г какодилат натри в 10 мл дистиллированной H 2 O (дН 2 O). Хранить раствор кровяной соли на льду. Непосредственно перед использованием добавляют 10 мл 4% -ного осмия (OSO 4).
  12. Пятно ткани с 2% зеваMium-ферроцианида раствор в течение 90 мин, на льду. Промыть 3 раза, 5 мин каждый в дН 2 O.
  13. Готовят 1% раствор тиокарбогидразида (TCH) путем растворения 0,1 г TCH в 10 мл дН 2 O. Растворение при температуре 60 ° С с помощью закрученного каждые 10 мин до полного растворения. Соблюдать правила техники безопасности при обращении с ТКП, в частности, заботиться, чтобы избежать использования металлов, нагрев до высокой температуры, или позволяя раствору высохнуть.
  14. Treat образцы со свежеприготовленным 1% КН в течение 20 мин при комнатной температуре. Промыть 3 раза, 5 мин каждый в дН 2 O.
  15. Развести 4% OsO 4 до 2% с дН 2 O, ткани окрашиваются 2% -ным водным раствором осмия инкубацией в течение 1 ч. Вымойте тканей 3 раза, 5 мин каждый с дН 2 O.
  16. Инкубируйте образцы O / N в 1% ацетата уранила в дН 2 O при 4 ° С.
  17. Готовят раствор свинца аспартат Уолтона (как описано Deerinck соавт 40).
    1. Растворите 0,998 г L-аспартата в 250 мл дН 2 Oа затем добавляют 10 N гидроксида калия (КОН) по каплям моды до тех пор, пока рН не достигнет 5,5. После регулировки рН, добавляют 0,066 г нитрата свинца в 10 мл аспарагиновой кислоты запаса и нагревают до 60 ° С в течение 30 мин.
  18. Полоскание ткани в дН 2 O и инкубировать со свинцом аспартат пятно Уолтона в течение 30 мин в 60 ° C духовке. Промыть 3 раза, 5 мин каждый в дН 2 O.
  19. Высушить пробы через градуированных серии спирта с использованием охлажденных растворов на 20%, 50%, 75%, 85% и 95% этанолом в течение 5 мин каждый, а затем 100% -ным этанолом 3 раза, в течение 10 мин каждый.
    Примечание: Используйте 100% этанола из только что открытой бутылки, как прочитанного этанол поглощает воду из воздуха и вызывать встраивание потерпеть неудачу. Более длинные инкубирование необходимо будет с более крупными образцами тканей.
  20. Вымойте образцы 2 раза, 15 мин каждый раз в окись пропилена.
  21. Сделать пластическую вложение смолы с использованием 25 мл смолы, 10,5 мл DDSA (додеценил янтарного ангидрида), 15,5 мл NMA (надиковый метил ангидрид) и 1 млДМП-30 (2,4,6-трис диметиламинометил фенол). Смешайте смолу путем встряхивания. Спин и позволяют смолу стоять, пока пузырьки решимости.
    Примечание: Это стандартный рецепт среда твердости. Могут быть использованы другие типы электронной микроскопии (ЭМ) пластиковые смолы, но должна быть проверена с неосновной контрольного образца заранее, так как не все смолы работать на SBFSEM.
  22. Инкубируйте ткани O / N в 50: 50 смеси заливочных смол и окисью пропилена, в пузырек, который ограничен на начальном этапе, а затем без колпачков после 2 часов таким образом, чтобы окись пропилена испарится в течение периода приблизительно 8 - 10 часов.
  23. Передача ткани до 100% свежего вложению смолы в чистых флаконах в течение 2 часов.
  24. Код для вставки образцов в свежем вложении смолы, в плоских формах, содержащими печатные бумажные этикетки, и вылечить их в печи при температуре 60 ° С в течение 48 часов. Примерно через 1 час, проверьте размещение ткани и выравнивание снова, и при необходимости отрегулировать.
  25. Обрежьте образцы в интересующей области и смонтировать на алюминиевом штифтом с использованием gellinг цианакриловый суперклей или проводящую эпоксидную смолу, а затем слой с коллоидным серебром паста вокруг сторон блока для обеспечения токопроводящей дорожки к алюминиевым штифтом.
  26. Изучение образцов тканей с помощью микроскопа систему сканирующего электронного оснащенного стадии ультрамикротомом в-камере и низкой кВ детектора 32 обратного рассеяния электронов.
    Примечание: Получить приборостроении и сайт-обучение в сканирующей электронной микроскопии (SEM) использование и стать авторизованным пользователем. С другой стороны, сотрудничество с исследователем или основного объекта для небольших проектов может оказаться невозможным. Лучевая обучение также может потребоваться в качестве SEMs генерировать рентгеновские лучи.
  27. Для изображения образцов, используйте следующие настройки: 2,25 кВ, при 5 - 10 нм / разрешение пиксела, с размерами поля от 80 - 250 мкм в х, у (другое поле размеров возможно), и ломтик толщиной 50 - 100 нм, в общей сложности 250 - 600 ломтиков в 16 - период времени 20 ч.
    Примечание: Настройки существенно различаются между различными микроскопами, Индидуальные образцы и требуемое разрешение. Эти параметры должны создавать изображения, которые легко интерпретируемых для многих образцов.

2. Анализ формирования изображения Dataset

Примечание: Программное обеспечение Image J / Фиджи используется для анализа набора данных и опирается на плагин TrakEM2. Препроцессирование этапы могут быть выполнены с использованием различных программных средств, и может быть обширным или незначительным в зависимости от уровня опыта и полученные штабели. Основные преобразования с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом (ImageJ 1.50b вер, ФИДЖИ скачать 1 октября 2015) описаны здесь.

  1. Преобразование изображения в 8 битный формат TIFF с оригинальных фирменных 16-битных изображений, открыв в программном обеспечении и выборе элементов меню Image → Type → 8 бит.
    1. Если автоматическое преобразование контрастности / яркости во время этого шага не является идеальным для изображений, вновь открыть 16-битные изображения и нажмите Изображение → Настройка → Яркость / Контраст. Выберите диапазон, который работает для всех изображений, и нажмите кнопку Применить. Затем выполните грКонверсию. Примечание: На некоторых SEMs, этот шаг может потребоваться программное обеспечение микроскопа производителя.
    2. В случае необходимости, из - за недопустимого перемещения изображения между дольками (например. Дрейф из - за зарядки), зарегистрировать / выравнивания изображения стеки (пункты меню Плагины → Регистрация → Линейная StackAlignmentWithSIFT). В большинстве регистрации программного обеспечения, установленного для "перевод-только" режим, а не "твердого тела".
      Примечание: Многие подходы и программное обеспечение может работать: регистрация SIFT плагин работает для многих приложений и есть виртуальная версия стека.
      1. При необходимости увеличить размер холста до регистрации (Изображение → Настройка → CanvasSize) или уменьшить его в область интереса (Image → Crop).
        Примечание: Некоторые дрейфа или splaying может произойти, и попытки других плагинов или программного обеспечения может привести к лучшим результатам. Руководство опции также доступны (например. ImageJ / ФИДЖИ, Плагины → Регистрация → ManualLandmarkSelection).
    3. Если Desirе изд, масштаб изображения на меньшие, более приемлемого размера (например , 25%.) с использованием ImageJ (Изображение → Scale).
  2. Запустите программу, выберите Файл → Импорт → последовательность изображений, а затем выберите файлы TIFF.
  3. Запустите плагин, выбрав Файл → Создать → TrakEM2 (Blank). Два окна открываются; один управляет проектом и area_lists, а другой управляет трассировку, и упоминается как «холст».
  4. Загрузите стопку изображения в плагин, сделав щелчок правой кнопкой мыши на импорт холст. Выберите импорт и нажмите на стек импорта. В всплывающих опций, установите флажок для виртуальных стеков.
    Примечание: Хотя изображения стеки уже открыты в программном обеспечении, они также должны быть открыты в плагине. Компьютер может работать более плавно, если окно виртуального стека проверяется.
  5. После того, как мипмапов создаются и стек загружается, щелкните правой кнопкой мыши, чтобы назвать проект под окна плагина. Щелкните правой кнопкой мыши на "новый проект" в шаблоне седловинеитп, и выберите "добавить новый дочерний 'для этого проекта. Щелкните правой кнопкой мыши еще раз, чтобы выбрать 'area_list'.
  6. Установите Z-оси масштаб проекта, чтобы согласовать с исходными параметрами электронно-микроскопический снимок правой кнопкой мыши на холсте, а затем нажмите дисплей и выберите калибровку. Кроме того, установите Z-шкалу, выбрав все слои в окне плагина, щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать масштаб Z и толщины.
  7. Нажмите и перетащите "проект" и всех "детей" в раздел, чтобы создать 'списки области' на вкладке 'Z' пространства в окне холст проект объектов.
  8. Выберите 'списка областей' и щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать и установить цвет. Теперь, используйте инструмент кисть, чтобы проследить объекты, такие как митохондрии, в электронной микрофотографии изображений. Используйте 'Shift + нажмите кнопку ", чтобы заполнить в замкнутом круге," Ctrl + прокрутка', чтобы увеличивать и уменьшать масштаб, и "Alt + клик", чтобы включить малярная кисть курсор в резинкой.
  9. Выберите две области ~ 10 - 15 мкмна 10 - 15 мкм, в верхнем левом углу и нижнем правом углу изображения и идентифицировать все митохондрии в этих районах, чтобы обеспечить беспристрастный отбор проб митохондрий в каждом наборе данных.
  10. На «холст», наблюдать и проследить митохондрии на протяжении секций. Примечание: Митохондрии довольно темные / плотные появляются органеллы, подобного размера в диаметре и свободно цилиндрические. Уникальный крист, образованный внутренней мембраны легко различимы внутри этой органеллы.
  11. Закончив трассировку, щелкните правой кнопкой мыши на area_list на вкладке Z пространства, выберите "Показать в 3D". Это запустит плагин просмотра 3D для просмотра 3D-реконструкция трассируемого изображения.
    1. Для проведения измерений митохондриальные тома, выберите объект в 3D-просмотра, нажмите на вкладку "Edit" и выберите "Свойства объекта". Оценка митохондриальный объем указана вместе с несколькими другими измерениями.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Показано, что мозг митохондриальная морфологии и размера неоднородна в различных нейрональных подразделам отсеков. Конфокальной микроскопии на низкой плотности нейрональных культур трансдуцированных с лентивирусов выражения митохондрии нацеленную зеленый флуоресцентный белок показал , что митохондрии , проживающих в нейронную сомы образуют сеть ретикулярной, а тех , кто проживает в дистальных невриты обладают дискретной удлиненную морфологию (рис 1 AB). С помощью метода ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сложность нервной системы представляет собой значительную проблему в реконструкции больших объемов тканей и анализа морфологии и распределения органелл, таких как митохондрии с достаточным разрешением. Несколько клеток включая нейроны, олигодендроциты и астроциты с многочисленными процессами протяженных в трех измерениях взаимодействуют в ткани головного мозга 43. Поскольку митохондрии проживает как в сомы клеток и удаленных процессов, митохондриальная морфологии чрезвычайно плеоморфная в нервной системе

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов. Эмили К. Бенсон является оплачиваемым сотрудником Renovo Neural Inc., а Грэм Джей Кидд является научным директором 3DEM в компании Renovo Neural Inc., которая является коммерческим поставщиком услуг и анализа последовательных блочных поверхностей SEM.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Сидни Уокера за предоставленную техническую помощь. Эта работа была частично поддержана грантом Национального института здравоохранения (1R01EY024712-01A1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL/6J мыши,лаборатория Джексона 664
ИзофлуранВЕТон, торговое название Fluriso501017
Лоток для вскрытияFisher scientific S65105 
Ножницы для вскрытияTed Pella Inc.1316
Канюля бабочкиExel International26704
Фосфатный буфер физиологический растворSigma-AldrichP4417-100TAB
Фильтр (0,45 мкм)EMD Микроскоп для рассечения миллипорNC0813356
OlympusSZ61
Система вибратомного сеченияTed Pella Inc.Вибратом 3000
Какодилат натрияEMS12300
Дубильная кислотаEMS21700
Ферроцианид калияJ.T. Baker14459-95-1
Тетраоксид осмия 4% растворEMS19150
ТиокарбогидразидEMS21900
L-аспарагиновая кислотаSigma-AldrichA93100
Гидроксид калияAcros Organics43731000
Нитрат свинцаEMS17900
EMbed-812 НАБОР ДЛЯ ВСТРАИВАНИЯEMS14120Содержит закладную смолу 812  DDSA, NMA и DMP-30.
Глутаральдегид 25% EM GradePolysciences Inc.1909
ПараформальдегидEMS19202
УранилацетатEMS22400
ЭтанолEMS15055
Оксид пропиленаEMS20400
Закладная формаEMS70907
Алюминиевый штифт для образцаEMS70446
Коллоидное серебро ЖидкаяEMS12630
БритваEMS72000
Супер клей (контроль геля Loctite)Loctite234790Магазины скобяных изделий / рукоделия продают этот товар
Проводящая эпоксидная смолаTed Pella Inc.16043
Сканирующий электронный микроскопZeissSigma VP
В камере ультрамикротом для SEMGatan Inc.3View2Может быть разработан для других СЭМ
Обрезной микроскоп для подготовки булавокGatan Inc.поставляется в составе системы
Low kV обратного рассеяния электроновGatan Inc.Пакет обработки 3V-BSED
ImageJ/ Fiji ImageJ ver 1.50b, FIJI скачать 1 октября 2015http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf
http://rsb.info.nih.gov/ij/
http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf
http://fiji.sc/TrakEM2
3View г

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kasahara, A., Scorrano, L. Mitochondria: from cell death executioners to regulators of cell differentiation. Trends Cell Biol. 24, 761-770 (2014).
  2. Friedman, J. R., et al. ER tubules mark sites of mitochondrial division. Science. 334, 358-362 (2011).
  3. Bereiter-Hahn, J., Voth, M., Mai, S., Jendrach, M. Structural implications of mitochondrial dynamics. Biotechnol J. 3, 765-780 (2008).
  4. Campello, S., Scorrano, L. Mitochondrial shape changes: orchestrating cell pathophysiology. EMBO Rep. 11, 678-684 (2010).
  5. Trimmer, P. A., et al. Abnormal mitochondrial morphology in sporadic Parkinson's and Alzheimer's disease cybrid cell lines. Exp Neurol. 162, 37-50 (2000).
  6. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Hum Mol Genet. 18, 169-176 (2009).
  7. Li, Z., Okamoto, K., Hayashi, Y., Sheng, M. The importance of dendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines and synapses. Cell. 119, 873-887 (2004).
  8. Romanello, V., et al. Mitochondrial fission and remodelling contributes to muscle atrophy. EMBO J. 29, 1774-1785 (2010).
  9. Szabadkai, G., et al. Drp-1-dependent division of the mitochondrial network blocks intraorganellar Ca2+ waves and protects against Ca2+-mediated apoptosis. Mol Cell. 16, 59-68 (2004).
  10. Yu, T., Robotham, J. L., Yoon, Y. Increased production of reactive oxygen species in hyperglycemic conditions requires dynamic change of mitochondrial morphology. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 2653-2658 (2006).
  11. Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat Cell Biol. 9, 99-105 (2007).
  12. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., 3rd,, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25, 158-170 (2015).
  13. Macke, J. H., et al. Contour-propagation algorithms for semi-automated reconstruction of neural processes. J Neurosci Methods. 167, 349-357 (2008).
  14. Parikh, S. The neurologic manifestations of mitochondrial disease. Dev Disabil Res Rev. 16, 120-128 (2010).
  15. Frye, R. E., Rossignol, D. A. Mitochondrial dysfunction can connect the diverse medical symptoms associated with autism spectrum disorders. Pediatr Res. 69, 41-47 (2011).
  16. Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1366, 211-223 (1998).
  17. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial disorders in the nervous system. Annu Rev Neurosci. 31, 91-123 (2008).
  18. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial respiratory-chain diseases. N Engl J Med. 348, 2656-2668 (2003).
  19. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Hum Mol Genet. 20, 4515-4529 (2011).
  20. Anitha, A., et al. Downregulation of the expression of mitochondrial electron transport complex genes in autism brains. Brain Pathol. 23, 294-302 (2013).
  21. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Methods. 4, 559-561 (2007).
  22. Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 10515-10520 (2015).
  23. Shepherd, G. M., Harris, K. M. Three-dimensional structure and composition of CA3→CA1 axons in rat hippocampal slices: implications for presynaptic connectivity and compartmentalization. J Neurosci. 18, 8300-8310 (1998).
  24. Wang, C., et al. Dynamic tubulation of mitochondria drives mitochondrial network formation. Cell Res. 25 (10), 1108-1120 (2015).
  25. Glancy, B., et al. Mitochondrial reticulum for cellular energy distribution in muscle. Nature. 523, 617-620 (2015).
  26. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics in mammals. Curr Top Dev Biol. 59, 119-144 (2004).
  27. Chavan, V., et al. Central presynaptic terminals are enriched in ATP but the majority lack mitochondria. PLoS One. 10, e0125185(2015).
  28. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  29. Harris, K. M., et al. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. J Neurosci. 26, 12101-12103 (2006).
  30. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68(2014).
  31. Bushby, A. J., et al. Imaging three-dimensional tissue architectures by focused ion beam scanning electron microscopy. Nat Protoc. 6, 845-858 (2011).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329(2004).
  33. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scan Electron Microsc. , 73-76 (1981).
  34. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  35. Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. J Microsc. 259, 155-164 (2015).
  36. Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J Mol Cell Cardiol. 76, 1-11 (2014).
  37. Miyazaki, N., Esaki, M., Ogura, T., Murata, K. Serial block-face scanning electron microscopy for three-dimensional analysis of morphological changes in mitochondria regulated by Cdc48p/p97 ATPase. J Struct Biol. 187, 187-193 (2014).
  38. Traka, M., et al. WDR81 is necessary for purkinje and photoreceptor cell survival. J Neurosci. 33, 6834-6844 (2013).
  39. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9953-9958 (2014).
  40. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , University of California San Diego. San Diego, CA. Available at http://ncmir.ucsd.edu/sbfsem-protocol.pdf (2010).
  41. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of Ranvier. J Neurosci. 31, 7249-7258 (2011).
  42. Hammer, S., Monavarfeshani, A., Lemon, T., Su, J., Fox, M. A. Multiple Retinal Axons Converge onto Relay Cells in the Adult Mouse Thalamus. Cell Rep. 12, 1575-1583 (2015).
  43. Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162, 648-661 (2015).
  44. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, 920-931 (2005).
  45. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  46. Bohorquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J Vis Exp. , e52918(2015).
  47. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. J Microsc. 218, 52-61 (2005).
  48. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7, e38011(2012).
  49. Helmstaedter, M., Mitra, P. P. Computational methods and challenges for large-scale circuit mapping. Curr Opin Neurobiol. 22, 162-169 (2012).
  50. Helmstaedter, M., Briggman, K. L., Denk, W. High-accuracy neurite reconstruction for high-throughput neuroanatomy. Nat Neurosci. 14, 1081-1088 (2011).
  51. Saalfeld, S., Cardona, A., Hartenstein, V., Tomancak, P. CATMAID: collaborative annotation toolkit for massive amounts of image data. Bioinformatics. 25, 1984-1986 (2009).
  52. Giuly, R. J., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Method: automatic segmentation of mitochondria utilizing patch classification, contour pair classification, and automatically seeded level sets. BMC Bioinformatics. 13, 29(2012).
  53. Jakobs, S., Wurm, C. A. Super-resolution microscopy of mitochondria. Curr Opin Chem Biol. 20, 9-15 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Serial Block Face Scanning Electron MicroscopyMitochondrial Morphology AnalysisBrain Mitochondria ImagingElectron Microscopy TechniqueMitochondria Volume MeasurementMitochondria Distribution StudyMitochondria Number QuantificationRodent Brain Tissue PreparationUltrastructural Characteristics AnalysisMitochondria Compartment Classification

Related Articles