Методическая статья

Наблюдение за митотического деления и динамика в живом данио Эмбрион

11.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54218

⸱

15 июля 2016 г.

 , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Alabama at Birmingham

В этой статье

Краткое содержание

Митоз имеет решающее значение для каждого живого организма, и дефекты часто приводят к раку и нарушениям развития. Используя этот протокол визуализации и рыбок данио в качестве модельной системы, исследователи могут визуализировать митоз в живом позвоночном организме и множество дефектов, которые возникают при дефектных митотических процессах.

Аннотация

Митоз имеет решающее значение для роста и дифференцировки организменном. Процесс является очень динамичным и требует упорядоченный событий для достижения надлежащего конденсацию хроматина, микротрубочек кинетохор привязанность, расхождение хромосом и цитокинез в небольшой промежуток времени. Ошибки в деликатном процессе может привести к болезни человека, в том числе врожденных дефектов и рака. Традиционные подходы, расследующие болезненных состояний митотический человека часто полагаются на системах клеточных культур, которые испытывают недостаток естественной физиологии и развития / контекст тканеспецифичную выгодный при изучении болезней человека. Этот протокол позволяет преодолеть многие препятствия, предоставляя способ визуализации с высоким разрешением, динамики хромосом в системе позвоночных, данио. Этот протокол будет подробно подход , который может быть использован для получения динамических изображений делящихся клеток, которые включают в себя: в пробирке транскрипции, данио разведения / сбора, эмбрион вложения и покадровой обработки изображений. Оптимизация и MODIFications этого протокола также исследуются. Использование H2A.F / Z-EGFP (маркирует хроматин) и mCherry-CAAX (метки клеточных мембран) мРНК-впрыскивается эмбрионов, митоз в АВ дикого типа, auroraB hi1045 и esco2 hi2865 мутанта данио визуализируется. Высокое разрешение изображения в прямом эфире в данио позволяет наблюдать множественные митозы статистически количественно митотические дефекты и сроки митоза. Кроме того, наблюдается наблюдение качественных аспектов , которые определяют неправильные процессы митоза (т.е. congression дефекты, missegregation хромосом и т.д.) и результаты неправильного хромосомные (т.е. анеуплоидии, полиплоидия, микроядер и т.д.). Этот анализ может быть применен к наблюдению тканевой дифференцировки / развития и поддается использованию мутанта данио рерио и фармакологических агентов. Визуализация как дефекты в митозе привести к раку расстройствами и нарушениями развития будет в значительной степениспособствовать более глубокому пониманию патогенеза заболевания.

Введение

Митоз является критическим ячеистый основной процесс роста, дифференцировки и регенерации в живом организме. После точной подготовки и репликации ДНК в интерфазе, клетка грунтуется разделить. Первая фаза митоза, профазы, инициируется активацией циклин B / Cdk1. Профаза характеризуется конденсацией хроматина материала в хромосомы. пробой ядерной оболочки происходит при переходе между профазе и прометафазе. В прометафазе, Центросомы, Нуклеирующий центр для формирования веретена, начинают мигрировать к противоположным полюсам при расширении микротрубочки в поисках прикрепления кинетохор. После присоединения, преобразования к конечным прикомандирован микротрубочек и натяжной силы ориентировать хромосомы , образующие метафазного пластину 1. Если все хромосомы прикреплены правильно, узел шпинделя контрольной точки выполняется, Cohesin кольца, удерживающие сестринские хроматиды вместе расщепляются, и микротрубочки сократить тянуть сеструхроматиды к полюсам во время анафазы 2,3. На заключительном этапе, телофаза, включает в себя удлинение клетки и реформирования ядерной оболочки вокруг двух новых ядер. Цитокинез завершает процесс разделения путем разделения цитоплазмы двух новых дочерних клеток 4-6. Изменение ключевых митотических путей (т.е. шпинделя сборки контрольно - пропускном пункте, центросомы дублирования, сестринских хроматид сцепления и др.) Может привести к метафазе аресту, missegregation хромосом и геномной нестабильности 7-10. В конечном счете, дефекты путей распространения контрольного митоза могут вызвать нарушения развития и рака, что вызывает необходимость визуализации митоза и его дефекты в живом, позвоночное, многоклеточного организма 10-16.

Эмбрионы рыбок данио служить отличным модельного организма для живого изображения благодаря прозрачной ткани, легкость микроинъекции, и быстрое развитие. Использование данио, общая цель этой рукописи являетсяописывают способ живой 5D (размеры X, Y, Z, время и длина волны) визуализации митоза 17 (рис 1C). Использование мутанта данио дефектного в различных митотических путей демонстрируют последствия таких дефектов. Для этого протокола, были выбраны Aurora B и Esco2 мутанты, чтобы проиллюстрировать эти дефекты. Aurora B является киназа, которая является частью хромосомы пассажирского комплекса (КПК), участвующих в формировании веретена и прикрепления микротрубочек. Он также необходим для формирования расщепления борозды в цитокинезе 18,19. В данио, дефицит Aurora B ведет к дефектам по бороздам индукции, цитокинеза и сегрегации хромосом 20. Esco2, с другой стороны, является ацетилтрансферазы , что имеет важное значение для сестринских хроматид когезии 21,22. Он ацетилирует Cohesin на SMC3 части кольца , таким образом , стабилизирующего Cohesin для обеспечения правильной сегрегации хромосом в метафазе-анафазе перехода 23. Потеря Esco2 в данио приводит к спromosome missegregation, преждевременные сестра разделения хроматид, геномная нестабильность и p53-зависимые и независимые апоптозом 24,25. Благодаря наличию, auroraB hi1045 и esco2 hi2865 мутанта данио (далее именуемые как aurB м / м и esco2 м / м, соответственно) будет использоваться для иллюстрации этого метода 25-27.

Муфта конфокальной микроскопии с флуоресцентно меченых клеток машин позволило исследователям визуализировать хроматина и клеточной мембраны динамика во время митоза 25,28,29. Флуоресцентные меченных гистонов исторически использовались для визуализации хроматина. Гистоны ядерные белки , состоящие из четырех различных пар (H2A, H2B, H3 и H4), которые ответственны за структуры нуклеосомы , которые сочиняет хромосомы 30. В то время как Н2В, возможно, является наиболее часто используемым гистонов для флуоресцентных белков вмышь и культура клеток, использование Гистона 2А, Семейный Z (H2A.F / Z) доказал , хорошо для использования в данио 31,32. Конканавалин А и казеин - киназы 1-гамма, например, локализовать на клеточной мембране , и как было показано ранее эффективными в визуализацией через клеточную мембрану в морских ежей и Drosophila 33,34. Другие исследования показали , что CAAX флуоресцентно меченый белок этикетки клеточную мембрану и была успешной в данио 31. CAAX является мотив, который признан посттрансляционными модифицирующих ферментов, таких как farnesyltransferases и geranylgeranyltransferases. Изменения этими ферментами вызывают белки , чтобы стать ассоциированный с мембранами, таким образом маркируя клеточную мембрану 35.

В связи с предшествующим уровнем использования в данио рерио, этот протокол решили использовать H2A.F / Z и CAAX маркировать хроматин и клеточную мембрану. Применение этого метода позволит исследователя контролировать митоза на уровне отдельных клеток, чтобы наблюдать отдельные хромосомыдинамика, а также одновременно контролировать несколько клеточных делений, которые могут повлиять на тканевой дифференцировки и развития. В данной статье основное внимание будет уделено визуализации динамики сегрегации хромосом во время митоза на уровне отдельных клеток. В этой рукописи, способность наблюдать несколько митотических делений, вычислить время деления, и расшифровать митотического фенотипы будут проиллюстрированы и обсуждены. Используя эти параметры, физиологически соответствующие данные могут быть собраны и применены к нескольким болезненных состояний, пострадавших от митотических дефектов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. In Vitro Транскрипция

  1. Линеаризуем шт.2-H2A.F / Z-EGFP и / или векторы шт.2-mCherry-CAAX ограничением NotI фермента переварить 31. Использование РНК в пробирке транскрипции набора, генерировать 5 'блокированы мРНК продуктов из каждого шаблона, в соответствии с протоколом производителя.
  2. Очищают блокированы мРНК с использованием набора для очистки. Следуйте инструкциям производителя. Элюции с РНКазы H 2 O.
  3. Определить концентрацию РНК по оптической плотности при длине волны 260 нм с использованием спектрофотометра. (OD 260 х разбавление х 40 мкг / мл).
  4. Развести РНК до 100 нг / мкл для каждого H2A.F / Z-EGFP и mCherry-CAAX с РНКазы H 2 O. Если концентрация РНК является слишком низкой, флуоресценция будет уменьшена или отсутствует. Ярче образцы будут уменьшить беспокойство по поводу фототоксичности и фотообесцвечивания. С другой стороны, слишком много РНК могут быть токсичными и / или вызывают от целевых эффектов.
    Примечание: Храните оставшиесяочищенной мРНК в -80 ° C морозильнике.

2. рерио Разведение, эмбрионов и мРНК Инъекции 36-38

  1. Собрать селекционных резервуары с барьером для отделения танка на две области и заполнить каждую племенную бак с системой аквакультура воды, используемой в данио объекте.
  2. Для того, чтобы предотвратить преждевременную размножение, место два мужских рыбы с одной стороны барьера и двух женщин рыбы на другой стороне ночь перед разведением.
  3. На следующий день, растопить предварительно приготовленной смеси мРНК на льду. Замените воду в селекционных резервуарах со свежей водой системы аквакультуры и устранения барьеров. Сразу после того, как барьеры, вытягиваются, согреть инъекции плесени до 28,5 ° C и установить оборудование для микроинъекции.
    Примечание: Для получения информации о шприцформ, пожалуйста , обратитесь к Герлах 36.
  4. Собирать яйца каждые 10 - 15 мин, используя ситечко и промыть яйца в чистую 100 х 15 мм чашки Петри с E3 Синий (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl 2, 0,33 мМ MgSO 4, 10 -5% Метиленовый синий). E3 Синий используется для предотвращения роста грибов и обеспечить надлежащее развитие личинок рыб. Для получения дополнительной информации о спаривании и сбора эмбрионов, относятся к Герлах 36 и Porazinkski 37.
  5. Вставить одноклеточный поставил эмбрионов в подогретом литьевой пресс - формы и инъекции РНК в желток в необходимом количестве эмбрионов (Рис . 1А) Счет для естественного эмбриональной смерти и неоплодотворенных эмбрионов, выполняя эмбриональные инъекции на 15% больше, чем эмбрионов, необходимых для проведения эксперимента. Для получения дополнительной информации о микроинъекции эмбрионов данио, пожалуйста , обратитесь к Герлах 36 и Porazinkski 37.
    Примечание: При первом использовании мРНК, провести анализ доза-кривой для определения оптимальной дозы для флуоресценции и жизнеспособности (определяется как отсутствие грубых пороков развития до 5 DPF) перед выполнением обработки изображений 5D. 150 - 200 нг / мклвводили в эмбрионы часто оптимальная концентрация, поэтому она является хорошей отправной точкой для конечной концентрации.
  6. Осторожно извлечь инъецированные эмбрионы из пресс-формы с использованием модифицированного 9 "стеклянной пипетки Пастера. Чтобы изменить пипетку, растопить конец, используя горелку, пока она не образует шар.
  7. Поместите инъекционные эмбрионов в 100 х 15 мм чашки Петри в Е3 Синий и дом в 28,5 ° С инкубатор.
  8. Шесть часов после инъекции, удалить любые мертвые или неоплодотворенные эмбрионов из пластин и добавить чистую E3 Blue. Дом эмбрионы при 28,5 ° C.

3. Подготовка и внедрение Живого эмбрионов данио рерио для визуализации (рис 1B)

  1. Два часа до того изображения, экран инъекционные эмбрионов для GFP с помощью флуоресцентного микроскопа рассекает. Поместите ярко-зеленые GFP-экспрессирующих эмбрионов в новом 100 х 15 мм чашки Петри с E3 Blue.
  2. Кипение в исходный раствор 1% агарозном низкой расплава путем добавления 1 г низкой расплава агарозы в 100 мл E3 синий, После того, как с использованием агарозы, покрывают колбу с алюминиевой фольгой. Исходный раствор остается полезным в течение одного месяца.
  3. Аликвоты 3 мл расплавленным агаром в культуральную пробирку 17 х 100 мм. Хранить агарозы в тепле не помещая в культуральную пробирку С водяной бане при 42 ° до готовности к использованию. Готовят 15 мМ раствора Tricaine в деионизированной воде , чтобы обезболить данио эмбрионов 36.
    Примечание: Если в визуализации более ранних моментов времени желательно, концентрация агара может быть уменьшена по цене от 0,3% 39.
  4. Принесите 15 мМ Tricaine, экранированных эмбрионов, низкий агарозы расплава, E3 синего и 35 мм стекло покровное дном культуры блюдо к рассечение световым микроскопом. Осторожно удалите хориона эмбриона с # 5 пинцетом. Делайте это в течение трех эмбрионов.
  5. Поместите dechorionated эмбрионов в отдельном контейнере, чтобы быть под наркозом. Крышка покровное нижней тарелки часто используется для этой цели. С помощью пипетки передачи, добавить три капли (примерно 150 мкл)15 мМ Tricaine к блюду 5 мл E3 синего (если не используя крышку покровного нижней тарелки), или до тех пор, эмбрионы были достаточно наркозом. Кроме того, добавьте 3-4 капли (около 150 - 200 мкл) 15 мМ раствора Tricaine в 1% агарозном расплавленным трубки.
  6. Использование P200 пипетки с 1 см кончика пипетки отрезан; передать наркозом эмбрионов на покровное дном блюдо. Удалите излишки E3 Синий: решение Tricaine.
  7. Медленно добавляют 5 - 10 мкл легкоплавкой агарозы: Tricaine раствора над эмбрионами, сохраняя каждую каплю отдельного, чтобы гарантировать, что эмбрионы не случайно дрейфовать близко друг к другу.
    Предупреждение: Если агарозном слишком тепло, это может повредить зародыш. Хорошая температура для поддержания агаре при 42 ° С.
  8. Использование 21 G 1 ½ иглы, мягко ориентировать эмбриона в агарозном в нужное положение. При использовании инвертированного микроскопа для покадровой обработки изображений, сориентировать область интереса (ROI) как можно ближе к покровным как possibле.
    Примечание: Для общего назначения, хвостовой области предлагает легкость ориентации и ясности в связи с относительно тонкой ткани (фиг.1А). Другие ткани, такие как эпителиальный слой , окружающий желток и заусениц складками, могут быть использованы 28,29. Эти ткани предлагают большую ясность, однако эти регионы имеют толщину всего несколько слоев клеток. Для целей настоящего протокола, полезно для образа хвостовой области, чтобы приобрести как можно больше клеточных делений, как это возможно.
  9. Разрешить несколько минут для частичного затвердевания агара. Используйте иглу распадаться небольшой кусочек агара, чтобы проверить его затвердевание. Когда часть агара может быть отстранилась от падения, переходите к следующему шагу.
  10. Покройте всю покровное с низким агара расплава образуя купол над вложенными эмбрионов. Дайте агар затвердеть перед перемещением антенны для конфокальной микроскопии (рис 1А).
  11. Во время агара затвердевание процесс (занимает около 10 мин), подготовить 3 мл ое E3 синий раствор с пятью каплями (примерно 250 мкл) 15 мМ Tricaine необходимо установить над вложенными эмбрионов во время формирования изображения.

4. 5D конфокальной микроскопии в реальном маштабе времени эмбрионов данио рерио 40,41

ПРИМЕЧАНИЕ: См Ariga 40 и О'Брайен 41 Подробную информацию о том , как выполнить визуализацию 5D с использованием других систем конфокальной. Для Z-интервала, Z-стек, Z-глубины, интервал времени, и определения 5D рис 1С.

  1. Откройте программу обработки изображений и установите микроскоп на 60X NA 1.4 объектива. Нанесите иммерсионное масло на объектив и место культуры блюдо в держатель слайдов на столик микроскопа. С помощью контроллера оси, центр зародыш интерес выше объектива и принести объектив вверх, чтобы встретить культуры блюдо.
  2. Нажмите на иконку глаза кусок и перейти к GFP фильтр на микроскопе. Фокус на ROI. Сосредоточив внимание на ткани ближе всего к покровным будет Offer лучших результатов визуализации.
  3. Снять блокировку. Выберите каналы и GFP mCherry (предустановленные длины волн в программном обеспечении) и установить линию усреднения вариант к нормальному.
  4. Используйте "Элементы управления View / Приобретение / A1 Scan Area" команду, чтобы открыть инструмент A1 Scan Area.
  5. Начать сканирование. С помощью оси-контроллера, установите эмбрион так, чтобы область сканирования заполнена, как большая часть данио, насколько это возможно. Мощность лазера не должна быть оптимальной в данный момент. Опустите мощность лазера, чтобы избежать ненужных фотообесцвечивания.
  6. С помощью "Элементы управления View / Приобретение / приобретение ND" команду, чтобы открыть панель управления приобретением ND.
  7. Начать сканирование, чтобы установить параметры Z-стека. Установите Z-стека верхний предел, когда клетки не в фокусе, и нижний предел, где клетки больше не будут видны. Разрешить для пространства 3 мкм над образцом для роста и движения клеток, который может расширяться в области визуализации. Z-стек для фигуры, показанные в этом протокол охватывали Z-глубину 40 мкм в зародышевом хвоста.
  8. Установите Z-интервал размера шага до 2 мкм. В среднем, клетка диаметром 10 мкм; поэтому 2 мкм будет производить пять интервалов данных изображений, которые будут проанализированы для каждой ячейки.
    Примечание: Глубина изображения, которые могут быть приобретены в зависимости от Z интервала. Разрешение Z приносится в жертву, чтобы получить общую глубину в Z размерности, чтобы изображения, как много клеток, подвергающихся митоза, насколько это возможно (большой Z-глубина). Обратное верно, то в том, что за счет уменьшения размера шага, разрешение Z достигается, в то время как глубина Z приносится в жертву (небольшой Z-глубина).
  9. Регулировка мощности лазера изображения, HV, и смещение уровней. Для экспериментов продемонстрировали в этом протоколе, используйте следующую мощность лазера, HV, и смещение уровней, установленных на соответствующих уровнях, соответственно, для канала GFP; 2 - 5, 120 - 140, и от -9 до -11. Для канала mCherry используйте следующую мощность лазера, HV, и смещение уровней, соответственно; 3 - 6, 120 - 140, и от -3 до-8. После того как параметры установлены, отключите сканирование, чтобы предотвратить ненужное лазерное воздействие, которое может вызвать фототоксичности и фотообесцвечивания образца.
  10. Выберите значок усреднения 2x линии. "Нет усреднения" не производит зернистое изображение в то время как "4x линия усреднения" резко увеличивает время сканирования. Использование 2х линейного усреднения обеспечивает наилучшее качество изображения и время сканирования быстро.
  11. Выберите нужное значение длительности временной интервал, и время, необходимое для эксперимента. Для подклассов дикого типа, два-минутные интервалы времени в течение 2 часов лучше всего подходит для определения митотического длительности (на рисунках 1, 2, 3А и 3В). Дивизион, активирующие сборки шпинделя контрольной точки в течение более 30 мин являются более подходящими в течение пяти - минутными интервалами на четыре часа, чтобы сохранить флуоресценцию , как показано на рисунке 3C.
  12. Установите флажок "Сохранить в файл" и введите имя файла для автоматического сохранения файла, как он приобретается. Двойная проверка все рараметры установлены правильно и нажмите кнопку "начать бег".
  13. После завершения приобретения, чтобы просмотреть файл в трехмерном формате, нажмите на иконку порога громкости.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рисунок 2 демонстрирует способность наблюдать множество клеточных делений , используя широкий вид поля АВ дикого типа данио хвоста. Более семи митоза клетки изображаются в срок 14 мин (Movie 1). В течение двух час времени, конечно, были захвачены в плен более 40 митотических событий. В среднем, наблюдались 50 делящиеся клетки в АВ и 30 делящиеся клетки в Aur В м / м эмбрионов (рис 2В). Для учета количества кл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Использование этого метода позволяет сделать вывод о разбивку ядерной оболочки, образование метафазы пластины микротрубочек-кинетохора вложения и сегрегации сестринских хроматид с образованием двух новых клеток в естественных условиях и в зависимости от времени способом. Способность наблюдать митоза в данио имеет преимущество по сравнению фиксированных образцов и систем культивирования клеток, поскольку клетки изображаемого в естественной физиологии, ткани является прозрачной, которая позволяет флуоресцентные б...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Кристен Кван за векторы pCS2-H2A.F/Z-EGFP и pCS2-mCherry-CAAX. Мы благодарим Криса Родеша за обучение нас визуализации рыбок данио в реальном времени. Мы благодарим Шона Уильямса, Эрика Маларки и Брэда Йодера за помощь в проведении конфокальной визуализации в UAB и в Центре визуализации высокого разрешения в UAB. Центр визуализации высокого разрешения поддерживается грантом UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) и Core Center Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. поддерживается Национальным институтом неврологических заболеваний и инсульта (NIH R21 NS092105) и пилотными грантами Американского онкологического общества (ACS IRG-60-001-53-IRG) и Комплексного онкологического центра UAB (P30CA013148). S.M.P. поддерживается грантом на обучение в области клеточной и молекулярной биологии T32 (5T32GM008111-28).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Векторы pCS2Подарок от K. KwanДля интересующей плазмиды
NotI-HF рестрикционный ферментNew England BioLabsR3189SДля рестрикционного дайджеста плазмиды
mMessage SP6 kitLife TechnologiesAM1340Для транскрипции in vitro
RNeasy Mini kitQiagen74104Для очистки мРНК
100 x 15 мм чашки ПетриFisher ScientificFB0875712Для размещения эмбрионов
микроинъекционная формадомашнего приготовленияДля удержания эмбрионов во время микроинъекции
Agarose IIAmresco0815-25GДля встраивания эмбрионов
ТрикаинSigma-AldrichE10521-10GДля обезболивания эмбрионов
Хлорид натрияSigma-AldrichS9888Для эмбриональной воды (E3 Blue), растворенной в UltraPure H2O
Potassium ChlorideSigma-AldrichP3911Для эмбриональной воды (E3 Blue), растворенной в UltraPure H2O
Кальция хлорида дигидратаSigma-AldrichC8106Для зародышевой воды (E3 Blue), растворенной в UltraPure H2O
Magnesium SulfateFisher ScientificM7506Для зародышевой воды (E3 Blue), растворенной в UltraPure H2O
Methylene Blue HydrateSigma-AldrichMB1Для зародышевой воды (E3 Blue), растворенной в UltraPure H2O
100 мм культуральная пробиркаFisher Scientific50-819-812Для расплавленного агара
35 мм стеклянная покровная чашка для культурыMatTek CorpP35G-0-20-C No 0, стекло 20 мм, Для заделки эмбрионов
#5 пинцетDumont72701-DДля дехорионирования эмбрионов
21 G 1 1/2 калибр иглаBecton Dickinson305167Для позиционирования эмбрионов в агар
Препарирующий микроскопNikon AZ100Для скрининга и встраивания эмбрионов подойдет любой дискоританционный микроскоп
Nikon A1+Для покадровой съемки
Конфокальный программныйNIS Elements AR 4.13.00Для получения и обработки изображений

Ссылки

  1. Musacchio, A., Hardwick, K. G. The spindle checkpoint: structural insights into dynamic signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 731-741 (2002).
  2. Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
  3. Rieder, C. L., Cole, R. W., Khodjakov, A., Sluder, G. The checkpoint delaying anaphase in response to chromosome monoorientation is mediated by an inhibitory signal produced by unattached kinetochores. J Cell Biol. 130 (4), 941-948 (1995).
  4. Hayles, J., Nurse, P. A review of mitosis in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Exp Cell Res. 184 (2), 273-286 (1989).
  5. Pederson, T. Historical review: an energy reservoir for mitosis, and its productive wake. Trends Biochem Sci. 28 (3), 125-129 (2003).
  6. Sobel, S. G. Mini review: mitosis and the spindle pole body in Saccharomyces cerevisiae. J Exp Zool. 277 (2), 120-138 (1997).
  7. Thompson, S. L., Compton, D. A. Chromosome missegregation in human cells arises through specific types of kinetochore-microtubule attachment errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (44), 17974-17978 (2011).
  8. Duijf, P. H., Benezra, R. The cancer biology of whole-chromosome instability. Oncogene. 32 (40), 4727-4736 (2013).
  9. Lara-Gonzalez, P., Taylor, S. S. Cohesion fatigue explains why pharmacological inhibition of the APC/C induces a spindle checkpoint-dependent mitotic arrest. PLoS One. 7 (11), 49041(2012).
  10. Araujo, A., Baum, B., Bentley, P. The role of chromosome missegregation in cancer development: a theoretical approach using agent-based modelling. PLoS One. 8 (8), 72206(2013).
  11. Deardorff, M. A., et al. HDAC8 mutations in Cornelia de Lange syndrome affect the cohesin acetylation cycle. Nature. 489 (7415), 313-317 (2012).
  12. Chetaille, P., et al. Mutations in SGOL1 cause a novel cohesinopathy affecting heart and gut rhythm. Nat Genet. 46 (11), 1245-1249 (2014).
  13. Kaiser, F. J., et al. Loss-of-function HDAC8 mutations cause a phenotypic spectrum of Cornelia de Lange syndrome-like features, ocular hypertelorism, large fontanelle and X-linked inheritance. Hum Mol Genet. 23 (11), 2888-2900 (2014).
  14. Snape, K., et al. Mutations in CEP57 cause mosaic variegated aneuploidy syndrome. Nat Genet. 43 (6), 527-529 (2011).
  15. Suijkerbuijk, S. J., et al. Molecular causes for BUBR1 dysfunction in the human cancer predisposition syndrome mosaic variegated aneuploidy. Cancer Res. 70 (12), 4891-4900 (2010).
  16. Vega, H., et al. Roberts syndrome is caused by mutations in ESCO2, a human homolog of yeast ECO1 that is essential for the establishment of sister chromatid cohesion. Nat Genet. 37 (5), 468-470 (2005).
  17. Andrews, P. D., Harper, I. S., Swedlow, J. R. To 5D and beyond: quantitative fluorescence microscopy in the postgenomic era. Traffic. 3 (1), 29-36 (2002).
  18. Nigg, E. A. Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (1), 21-32 (2001).
  19. Carlton, J. G., Caballe, A., Agromayor, M., Kloc, M., Martin-Serrano, J. ESCRT-III governs the Aurora B-mediated abscission checkpoint through CHMP4C. Science. 336 (6078), 220-225 (2012).
  20. Yabe, T., et al. The maternal-effect gene cellular island encodes aurora B kinase and is essential for furrow formation in the early zebrafish embryo. PLoS Genet. 5 (6), 1000518(2009).
  21. Hou, F., Zou, H. Two human orthologues of Eco1/Ctf7 acetyltransferases are both required for proper sister-chromatid cohesion. Mol Biol Cell. 16 (8), 3908-3918 (2005).
  22. Ivanov, D., et al. Eco1 is a novel acetyltransferase that can acetylate proteins involved in cohesion. Curr Biol. 12 (4), 323-328 (2002).
  23. Beckouet, F., et al. An Smc3 acetylation cycle is essential for establishment of sister chromatid cohesion. Mol Cell. 39 (5), 689-699 (2010).
  24. Monnich, M., Kuriger, Z., Print, C. G., Horsfield, J. A. A zebrafish model of Roberts syndrome reveals that Esco2 depletion interferes with development by disrupting the cell cycle. PLoS One. 6 (5), 20051(2011).
  25. Percival, S. M., et al. Variations in dysfunction of sister chromatid cohesion in esco2 mutant zebrafish reflect the phenotypic diversity of Roberts syndrome. Dis Model Mech. 8 (8), 941-955 (2015).
  26. Amsterdam, A., Hopkins, N. Retroviral-mediated insertional mutagenesis in zebrafish. Methods Cell Biol. 77, 3-20 (2004).
  27. Amsterdam, A., et al. Identification of 315 genes essential for early zebrafish development. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).
  28. Jeon, H. Y., Lee, H. Depletion of Aurora-A in zebrafish causes growth retardation due to mitotic delay and p53-dependent cell death. FEBS J. 280 (6), 1518-1530 (2013).
  29. Jeong, K., Jeong, J. Y., Lee, H. O., Choi, E., Lee, H. Inhibition of Plk1 induces mitotic infidelity and embryonic growth defects in developing zebrafish embryos. Dev Biol. 345 (1), 34-48 (2010).
  30. Bonenfant, D., Coulot, M., Towbin, H., Schindler, P., van Oostrum, J. Characterization of histone H2A and H2B variants and their post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 5 (3), 541-552 (2006).
  31. Kwan, K. M., et al. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
  32. Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
  33. Davidson, G., et al. Casein kinase 1 gamma couples Wnt receptor activation to cytoplasmic signal transduction. Nature. 438 (7069), 867-872 (2005).
  34. Smith, R. M., et al. Exocytotic insertion of calcium channels constrains compensatory endocytosis to sites of exocytosis. J Cell Biol. 148 (4), 755-767 (2000).
  35. Reid, T. S., Terry, K. L., Casey, P. J., Beese, L. S. Crystallographic analysis of CaaX prenyltransferases complexed with substrates defines rules of protein substrate selectivity. J Mol Biol. 343 (2), 417-433 (2004).
  36. Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. J Vis Exp. (101), e52943(2015).
  37. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J Vis Exp. (46), (2010).
  38. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  39. Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20812-20817 (2009).
  40. Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation. J Vis Exp. (43), (2010).
  41. O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
  42. Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nat Cell Biol. 16 (5), 386-394 (2014).
  43. Gorbsky, G. J. Cohesion fatigue. Curr Biol. 23 (22), 986-988 (2013).
  44. Daum, J. R., et al. Cohesion fatigue induces chromatid separation in cells delayed at metaphase. Curr Biol. 21 (12), 1018-1024 (2011).
  45. Germann, S. M., et al. TopBP1/Dpb11 binds DNA anaphase bridges to prevent genome instability. J Cell Biol. 204 (1), 45-59 (2014).
  46. Chan, K. L., North, P. S., Hickson, I. D. BLM is required for faithful chromosome segregation and its localization defines a class of ultrafine anaphase bridges. EMBO J. 26 (14), 3397-3409 (2007).
  47. Wuhr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W., Mitchison 3rd,, J, T. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
  48. Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).
  49. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. CDK-dependent phosphorylation and nuclear exclusion coordinately control kinetochore assembly state. J Cell Biol. 201 (1), 23-32 (2013).
  50. Scott, E. S., O'Hare, P. Fate of the inner nuclear membrane protein lamin B receptor and nuclear lamins in herpes simplex virus type 1 infection. J Virol. 75 (18), 8818-8830 (2001).
  51. Shankaran, S. S., Mackay, D. R., Ullman, K. S. A time-lapse imaging assay to study nuclear envelope breakdown. Methods Mol Biol. 931, 111-122 (2013).
  52. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  53. Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
  54. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  55. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  56. Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9 (12), 114632(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

H2A F Z EGFPmCherry CAAXAurora BEsco2

Похожие статьи