Method Article

Наблюдение и Количественная теломер и повторяющихся последовательностей с помощью флуоресцентной В Ситу Гибридизация (FISH) с зондами PNA Caenorhabditis Элеганс

DOI:

10.3791/54224

⸱

August 4th, 2016

 , 
1Institute of Molecular Biology and Genetics (IMBG), Seoul National University, 2Department of Biological Sciences, Seoul National University, 3Department of Biophysics and Chemical Biology, Seoul National University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы сообщаем о краткой процедуре флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) в гонадах и эмбрионах Caenorhabditis elegans для наблюдения и количественной оценки повторяющихся последовательностей. Мы успешно наблюдали и количественно оценили две различные повторяющиеся последовательности: теломерные повторы и матрицу альтернативного удлинения теломер (TALT).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Теломера — это рибонуклеопротеиновая структура, которая защищает хромосомные концы от аберрантного слияния и деградации. Длина теломер поддерживается теломеразой или альтернативным путем, известным как альтернативное удлинение теломер (АЛТ)1. В последнее время C. elegans стал многоклеточным модельным организмом для изучения теломер и АЛТ2. Визуализация повторяющихся последовательностей в геноме имеет решающее значение для понимания биологии теломер. В то время как длина теломер может быть измерена с помощью анализа фрагментов рестрикции теломер или количественной ПЦР, эти методы позволяют получить только усредненную длину теломер. Напротив, флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) может предоставить информацию об отдельных теломерах в клетках. Здесь мы приводим протоколы и репрезентативные результаты метода определения длины теломер C. elegans методом флуоресцентной гибридизации in situ. Этот метод обеспечивает простую, но мощную процедуру in situ, которая не наносит заметного ущерба морфологии. Используя флуоресцентно меченую пептидную нуклеиновую кислоту (ПНК) и зонд, меченный дигоксигенин-dUTP, мы смогли визуализировать две различные повторяющиеся последовательности: теломерные повторы и матрицу АЛТ (TALT) в эмбрионах и гонадах C. elegans.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Теломер защищает хромосомные концы от аномальным слияния и деградации. Млекопитающим теломер состоит из G-богатых гексамерных повторами, TTAGGG и shelterin комплексов. Последовательность теломер повторение нематода аналогичны млекопитающих (TTAGGC). Большинство эукариоты используют теломеразы, чтобы добавить теломер повторы к их хромосомными концами. Тем не менее, 10 - 15% раковых клеток используют теломеразы независимый механизм, известный как альтернативной удлинению теломер (ALT) 3. Ранее мы сообщали , что теломер повторы и связанные с ней последовательности, названные в качестве Talt, были усилены в теломер теломераза мутантных линий , которые пережили критический стерильность 2.

Длина теломер была измерена с помощью количественной ПЦР или с помощью саузерн - блоттинга, что обеспечивает среднюю длину теломер общего 4,5,6,7. Прочитайте подсчет теломер повтора в целом данных секвенирования генома также является индикатором общего содержания теломер 8. Хотя Sinгле длину теломер Анализ (STELA) может обеспечить длину одной теломеры, она не может обеспечить пространственную информацию теломер 9. В то время как ПНТ-1 :: mCherry репортер белка обеспечивает пространственную информацию теломер в естественных условиях, он не может представлять длину двухцепочечных теломер, как и ПНТ-1 является одноцепочечной теломер - связывающего белка 10.

В то время как вышеупомянутые методы дают усредненную информацию повторяющихся последовательностей, флуоресцентная гибридизация (FISH) в позволяет наблюдать количество и пространственное распределение отдельных последовательностей , представляющих интерес на хромосомном уровне. Вместо очистки ДНК, ткани или клетки закрепляются, чтобы сохранить нативную пространственную информацию в рыбе. Таким образом, рыба является как количественный и качественный инструмент для наблюдения отдельных последовательностей повторов, таких как теломер повторяется.

Этот протокол обеспечивает эффективный способ для одновременного обнаружения как Teloпростые и другие повторы на основе улучшения из ранее описанных методов 11,12. C. личинки Элеганс или взрослые многоклеточный организм с высоко дифференцированных клеток. Неоднородность клеток препятствует на количественном анализе большого числа теломер пятен. Для того, чтобы максимально увеличить количество клеток, проанализированных, эмбрионы изолированы и распространяются на полилизиновых покрытые слайдами для рыб. Кроме того, этот протокол также может быть объединен с иммунофлюоресценции.

В качестве доказательства того, что работает протокол, мы покажем, что можно наблюдать и количественно две различные повторяющиеся последовательности. ДНК-зонд против TALT1 был сгенерирован с помощью простых ПЦР включения дигоксигенином дУТФ. Затем этот TALT1 зонд и флуоресцентно-меченного теломер ПНА зонд гибридизировали одновременно. Впоследствии дигоксигенина обнаружен каноническим методами иммунофлюоресценции. Мы представляем здесь репрезентативные изображения , где TALT1 локализуется с теломер в ТРТ-1 выжившие.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. этикетировочные Зонды с дигоксигенином дУТФ методом ПЦР

  1. Выполните ПЦР - мечение с 10x дНТФ смесь , содержащая дигоксигенином дУТФ , как описано выше 13.
  2. Очищают ПЦР-продукта с очисткой спин-колонки в соответствии с инструкцией изготовителя.
    1. Если зонд короче, чем 200 пар оснований, удалить свободный дигоксигенином дУТФ со спин-хроматографии на колонке из реакционной смеси, а не очистки спин-колонки.

2. Подготовка Polylysine Покрытые Слайды

Примечание: Вся процедура занимает около 2 ч. Большинство шагов выполняются при комнатной температуре за исключением стадии сушки.

  1. Очистка слайдов
    1. Поместите слайды в пластиковый контейнер и промойте слайды кратко дистиллированной водой (DW). Удалить воду и заполнить контейнер с DW, содержащим 1% средство для мытья стекол.
    2. Перемешивают слайды в течение 15 мин при 50 оборотах в минуту при комнатной температуре (RT). Вымойте слайды с DW 3раз в течение 5 мин каждый раз при комнатной температуре.
    3. Вымойте слайды с 70% этанола в течение 15 мин при перемешивании. Откажитесь 70% этанола и поместить слайды на сухой блок 65 ° C и воздушно-сухом состоянии в течение 15 мин.
  2. Полилизин покрытие многолуночных стеклах
    Примечание: Polylysine покрытие предметное стекло является важным шагом, поскольку он обеспечивает адгезию образца в течение всей процедуры окрашивания. Плохо слайд с покрытием приведет к потере образца.
    1. Развести полилизиновый маточного раствора до 0,01% (вес / объем) в дистиллированной воде. Добавьте 20 мкл разбавленного 0,01% (вес / объем) полилизина в лунки чистой предметное стекло.
    2. Инкубируйте предметное стекло в течение 5 мин при комнатной температуре.
    3. Поместите слайды на 65 ° C сухой блок и воздушно-сухом состоянии в течение 1 часа.
    4. Храните Полилизиновые слайды в свободном пылесборника.

3. Закрепление Worms на предметном стекле (Рисунок 1)

  1. Подготовка эмбрионов для рыб
    Примечание: Урожай червей, прежде чем все тон бактериальная пища потребляется, наблюдая СМИ роста под микроскопом. Голодание уменьшает производство яиц взрослых червей и увеличивает яйца штриховки. Подробные методы описаны в 14,15.
    1. Grow червей в 50 мм чашки Петри в соответствии со стандартными методами 14.
    2. Ведь бактериальная пища потребляется, разрезать агаре в квартале с лопаточкой. Стерилизовать лопаточку перед нарезкой для предотвращения загрязнения.
    3. Положите все кусочек агара на 100 мм ростовой среде нематода (NGM) пластины. Поверните агар кусок вверх дном для червей, чтобы достигнуть свежей бактериальной пищи.
    4. После того, как от 48 до 72 ч, собирают червей с буфером M9. Добавить 3 - 5 мл буфера M9 на пластине NGM. Пипетка M9 буфер на поверхности NGM мыть червей.
    5. Соберите жидкость с червями и добавляют к 15 мл трубки.
      Примечание: Если есть агар мусор после уборки урожая, центрифуге червей в 30% растворе сахарозы. В то время как мусор осаждали, черви плавают наповерхность.
    6. Добавить M9 буфер, чтобы компенсировать объем до 15 мл. Гранул червей центрифугированием при 300 х г в течение 3 мин и удалить большую часть буфера M9. Повторите этот шаг еще 2 раза.
      Примечание: Если черви еще плавает после центрифугирования, установите уровень тормозной центрифуги, чтобы значение = 1.
    7. Отберите M9 буфера. Добавить отбеливающий раствор для червей. За 0,5 мл червей, добавляют 6,5 мл DW 2 мл гипохлорита, 1 мл 5 М KOH.
    8. Инкубируйте червей при встряхивании при комнатной температуре в течение 3 мин при 50 оборотах в минуту. Вихревые червей в течение 15 секунд, чтобы механически сдвига червей и подвергать яйца.
    9. Обратите внимание на трубку под микроскопом рассечение во время отбеливания. Убедитесь, что черви разрезать пополам и яйца будут освобождены. Когда большая часть взрослого тела растворится, добавляют M9 буфер, чтобы компенсировать объем до 15 мл.
    10. Центрифуга при 300 мкг в течение 3 мин. Отберите большую часть М9 и добавить свежий буфер М9, чтобы компенсировать объем до 15 мл. Повторите шаг промывки 3 раза.
      Заметка:Избегайте использования чрезмерного количества червей, так как они мешают процессу отбеливания. Держите общее время реакции менее 8 мин до мытья. Более беленой яйца производят сильное аутофлюоресценция.
    11. Добавить забуференный фосфатом физиологический раствор с полисорбат-20 (PBST) до 200 мкл и 200 мкл 4% параформальдегида (PFA), чтобы сделать 2% PFA.
      Внимание: Поскольку PFA является канцерогенным, носить защитную одежду, перчатки и щит глаз перед использованием PFA.
    12. Добавьте 40 мкл яйца в 2% PFA на лунку полилизиновым покрытием слайда.
    13. Поместите слайды во влажной камере и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре. Закройте влажной камере сразу после того, слайды должны быть размещены внутри.
      Примечание: Яйца оседают на дно ползуна в то время как фиксированы.
  2. Подготовка расчлененный гонады для рыб
    1. Урожай взрослых червей, выращенных на 50 мм NGM пластины пипеткой 1 мл буфера M9. Урожай червей перед бактериальной пищи истощены.
    2. Вымойте червей от любых бактерий остроумияч буфера M9, 2 раза.
      Примечание: Остаточные бактерии могут мешать рассеченных гонад от прилипания к полилизиновых покрытием горками.
    3. Гранул червей центрифугированием при 300 х г. Удалить M9 и передачи червей в пустую тарелку NGM с помощью микропипетки.
    4. Добавьте 30 мкл буфера М9, содержащей 2 мМ левамизол на лунку полилизиновым лечение ползуна.
    5. Добавьте 500 мкл буфера M9 в 1 мл пробирку. Используйте этот буфер для передачи червей рот пипеткой.
    6. Заполните кончик рта пипетки с буфером M9, поместив капилляр в 1 мл пробирку, содержащую буфер М9.
    7. Под микроскопом рассекает, поместите кончик рта пипеткой только в передней части головы взрослого червя и перетащить рот пипеткой так, чтобы голова червей попадает в рот пипеткой. После того, как глава червей входит наконечник, все тело червя будет нарисована в наконечник.
    8. Передача червей на полилизиновым покрытием слайд, используя рот пипеткой.
    9. С помощью бритвы, вырезать изе головы или кончика хвоста червей на слайде. Когда червь режется, гонады высунется. Половые будет прилипать к слайдам.
      1. Подготовьте по крайней мере 30 червей в одной скважине. Дополнительные скважины могут быть использованы в течение еще 30 червей.
    10. Поместите слайд в влажной камере и аспирация от буфера M9 с рот пипеткой.
    11. Закрепить образец путем добавления 20 мкл 2% PFA при комнатной температуре в течение 15 мин во влажной камере.

4. Закрепление и пермеабилизирующего

  1. Поместите алюминиевый блок на сухом льду и хранить его в морозильной камере глубокой (-80 ° C). Хранить метанол и ацетон в -20 & deg; С.
  2. После PFA фиксации стадии 3.1.15 или 3.2.11, удалите закрепитель с помощью микропипетки оставляя ~ 5 мкл закрепителя.
  3. Другими полилизиновых покрытием слайд на образце слайда. Удалите закрепитель с бумажным полотенцем, если решение является чрезмерным. Не перемещайте слайды, как только они склеились.
  4. Замораживание слайдына алюминиевом блоке, по крайней мере, 15 мин.
    Примечание: Образцы могут храниться в течение по крайней мере 2 - 3 дней.
  5. В то время как слайды были заморожены, поместите банки, содержащие холодный метанол и ацетон на льду.
  6. Возьмите слайды, и крутить их замораживанием взломать образец. Выбросить верхний слайд. Немедленно погрузите слайд в ледяной метанола в течение 5 мин.
  7. Передача слайдов ледяным ацетона в течение 5 мин.
  8. Вымойте слайды 3 раза PBST в течение 5 мин для удаления остаточного закрепитель. Перейдите к следующему шагу или хранить слайды в 100% этанола при 4 ° С.
    Примечание: Образцы могут храниться в течение по крайней мере 2 - 3 дней.

5. Гибридизация Фиксированные клетки

  1. Добавьте 20 мкл раствора РНКазы (PBST, содержащие 10 мкг / мл РНКазы А). Выдержите слайд в увлажненной камере при 37 ° С в течение 1 часа.
  2. Вымойте слайд дважды в 2 раза солевым раствором и цитрат натрия с полисорбат-20 (2x SSCT) в течение 15 минут каждый.
  3. Добавить 20мкл раствора гибридизации и положить влажную камеру в 37 ° С инкубатор. Через 1 ч удаления раствора гибридизации пипетированием.
  4. Перед удалением раствора гибридизации, подготовить зонд. Если зонд двухцепочечной ДНК, денатурации зонды путем нагревания при 95 ° С в течение 5 мин в расчете на сухое блоке. После нагревания, охлаждения зонда на льду кратко.
  5. Добавьте 10 мкл гибридизационного раствора, содержащего зондов к образцу. Для PNA зонда, используемой концентрации в соотношении 1: 2000, а также для DIG-меченным зондом, используемой концентрации в соотношении 1: 200. Накройте образец с защитным стеклом.
  6. Поместите бумажное полотенце, пропитанный водой на тепловом блоке (80 ° C). Поместите пластиковую крышку коробки на тепловом блоке для сохранения влажности и температуры.
  7. После того, как температура теплового блока стабилизируется (до 80 & deg; C), поместить образец слайд на бумажное полотенце, нагреваемой и покрывают образцы с пластиковой крышкой коробки. Денатурации образца в течение 3 мин.
  8. IncУбате слайды во влажной камере в течение ночи при температуре 37 ° С.

6. Моет и Иммунофлуоресценции

  1. Нагреть гибридизация промывочный раствор (2 x SSC, 50% формамиде) до 37 ° С.
  2. Промывают образец в PBST в два раза при комнатной температуре в течение 5 мин. Снимите крышку стекла.
  3. Отмывки образца в растворе для гибридизации стирка при температуре 37 ° С в течение 30 мин.
  4. Вымойте слайд образца в PBST 3 раза при комнатной температуре. Примечание: Выполнить все последующие шаги в влажной камере при комнатной температуре.
  5. Добавьте 20 мкл блокирующего раствора и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре во влажной камере.
  6. Удалить блокирующий раствор и добавляют FITC конъюгированной анти-дигоксигенином раствора антител (1: 200) в течение 3 ч при комнатной температуре или в течение ночи при температуре 4 ° С.

7. Монтаж и наблюдение

  1. Промыть образец слайдов с PBST 2 раза в течение 15 минут каждый.
  2. Добавляют 10 мкл раствора монтажа с DAPI. Поместите крышку стекла и слегка нажмите. Удалите излишки растворас бумажным полотенцем.
  3. Для предотвращения испарения монтажного раствора, запечатать края покровного стекла с лаком для ногтей.
  4. Соблюдайте под конфокальной микроскопии. Исключить эмбрионов с высоким фоном. Фокус на поле с 4 - 20 ядер.
  5. Возьмите изображения в соответствии с инструкцией завода-изготовителя с 100X объективом.
    Примечание: Excite образца с 405 нм лазер для DAPI, с 555 нм лазер для Cy3, с 488 нм лазер для FITC.

8. Количественное теломер сигнала

Примечание: Количественное было сделано , как описано ранее 16. Все изображения, которые должны быть сравнены должны быть приняты с той же установкой, включая время экспонирования и источника света.

  1. Экспорт изображения в формате .tif.
  2. Скачать и установить программное обеспечение для анализа изображений.
  3. Выполнить программное обеспечение для анализа изображений и нажмите кнопку Согласен.
  4. Нажмите кнопку Открыть. Откройте изображение с теломер FISH, дважды щелкнув файл изображения.
  5. Нажмите[Править] - [выберите область обработки], выберите область интереса левой кнопкой мыши и перетаскиванием. Исключить все неспецифического окрашивания.
  6. Нажмите [меры] - [спот оптических плотностей], выберите канал с сигналом теломер и введите имя файла для сохранения результатов в текстовом файле.
    Примечание: В столбце результатов в следующем порядке: флуоресценция пятна, фон интенсивность пятна и площади пятна.
  7. Скопируйте значения и вычесть фон интенсивность пятна от флуоресценции пятна. Значения теперь могут быть статистически проанализированы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ранее сообщалось , что ALT выживших может выйти из теломераза-дефицитных мутантов, ТРТ-1 (ok410), на низкой частоте Реплицируя внутренне локализован 'Шаблон ALT' (Talt) последовательности для поддержания теломер 2. Использование ПНК зонда, мы смогли визуализировать теломеры в расчлененных гонад (рис 2А). Слабый сигнал теломер был обнаружен как в ТРТ-1 (ok410) и ALT оставшегося в живых. Нечеткий сигнал перекрывается только с DAPI, предполагая,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основным преимуществом нашего протокола является простота процедуры без заметного ущерба морфологии клеточной структуры. Несколько шагов были оптимизированы для C. Элеганс FISH в этом протоколе. Критические шаги для успешного рыбы включают маркировку зондов, фиксация эмбрионов и проникновения. Дигоксигенин-дУТФ метод маркировки обеспечивает простой в использовании метод маркировки с помощью ПЦР или ник-трансляции. Для того, чтобы обозначить длинную последовательность-мишень, предпочтительно, ник-перевод. В этом...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мутантные штаммы червей были любезно предоставлены Генетическим центром Caenorhabditis. Это исследование было поддержано грантом Корейского проекта исследований и разработок в области технологий здравоохранения через Корейский институт развития индустрии здравоохранения (KHIDI), финансируемым Министерством здравоохранения и социального обеспечения Республики Корея (номер гранта: HI14C1277).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ПНК зондPANAGENEпо индивидуальному заказу
Анти-Дигоксигенин-Флуоресцеин, Fab фрагментыRoche11207741910использовать 1:200 Разведенный в PBST
Digoxigenin-dUTPRoche11573152910
Бычий сывороточный альбуминSIGMA-ALDRICHA-7906
ПараформальдегидSIGMA-ALDRICHP-6148приготовить 4% параформальдегид путем нагревания в DW с несколькими каплями NaOH. Добавьте 0,1 объема 10x PBS.
VectashieldVector LaboratoriesH-1200
Гибридизайтон раствор3x SSC, 50% формамид, 10% (w/v) сульфат декстрана, 50 μ г/мл гепарина, 100 μ г/мл тРНК дрожжей , 100 μ г/мл ультразвуковая сперма лосося ДНК
Гибридизация раствор для промывки2x SSC, 50% формамид
ФормамидBIONEERC-9012токсичный
метанолCarlo Erba
АцетонCarlo Erba
ГепаринSIGMA-ALDRICHH3393сделать 10 мг/мл для стокового раствора
Декстрана сульфатSIGMA-ALDRICH67578
10x PBSдля 1 л DW: 80 г NaCl, 2,0 г KCl, 27 г Na2HPO4• 7H2O, 2,4 г KH2PO
PBST1x PBS, 0,1% твин-20
Полисорбат 20SIGMA-ALDRICHP-2287Коммерческое название Tween-20
Раствор поли-L-лизина (0,1% w/v)SIGMA-ALDRICHP-8920приготовить свежий 0,01% w/v раствор перед использованием
M93 г KH2PO4, 6 г Na2HPO4, 5 г NaCl, 1 мл 1 M MgSO4, H2O до 1 л
Отбеливающий раствор20% гипохлорита натрия, 0,5 М KOH
Буфер1x PBST, 1 мМ ЭДТА, 0,1% BSA, 0,05% азид натрия (токсичный)
Блокирующий растворБуфер антител с 5% бычьим сывороточным альбумином (BSA)
illustra Microspin G-50GE healthcare27-53310-01
20x SSCДля изготовления 1 л, 175,3 г NaCl, 88,2 г цитрата натрия, H2O до 1 л, отрегулировать pH до 7,0
2x SSCT2x SSC, 0,1% tween-20
10x дигоксигенин-dUTP смесь1 мМ dATP, 1 мМ dGTP, 1 мМ dCTP, 0,65 мМ dTTP, 0,35 мМ DIG-11-dUTP
колонки для очистки ПЦРCosmo genetechCMR0112
Средство для мытья стекол / ULTRA CLEANDukssan чистые химикаты8AV721
Многолуночный стеклянный слайдMP биомедицинские
Нематоду питательную средуВнести 1 л, 3 г NaCl, 17 г агара, 2,5 г пептона, H2O до 974 мл. Автоклав и охладить колбу. Добавьте 1 мл 1 М CaCl2, 1 мл 4 мг/мл холестерина в этаноле, 1 мл 1 M MgSO4, 25 мл 1 M KPO4.
левамизолSIGMA-ALDRICH196142
лезвие RazorFeatherNo11
Rnase AEnzynomics
BSASIGMA-ALDRICHA7906
Confocal microsopeZeissLSM 510EC Plan-Neofluar 100X.
Влажная камераПластиковая коробка, заполненная бумажным полотенцем, пропитанным программным обеспечением для
анализа изображений DW Д-р Питер ЛандсдорпTFL-telohttp://www.flintbox.com/public/project/502
антител 96041205В качестве объектива был использован

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review. Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).
  2. Seo, B., et al. Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions. Nat Commun. 6, 8189(2015).
  3. Cesare, A. J., Reddel, R. R. Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications. Nat Rev Genet. 11, 319-330 (2010).
  4. Meier, B., et al. trt-1 is the Caenorhabditis elegans catalytic subunit of telomerase. Plos Genetics. 2, 187-197 (2006).
  5. Cawthon, R. M. Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 30, 47(2002).
  6. Raices, M., Maruyama, H., Dillin, A., Karlseder, J. Uncoupling of longevity and telomere length in C. elegans. PLoS Genet. 1, 30(2005).
  7. Southern, E. M. Detection of Specific Sequences among DNA Fragments Separated by Gel-Electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98, 503(1975).
  8. Lee, M., et al. Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes. Nucleic Acids Res. 42, 1733-1746 (2014).
  9. Cheung, I., et al. Strain-specific telomere length revealed by single telomere length analysis in Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391 (2004).
  10. Shtessel, L., et al. Caenorhabditis elegans POT-1 and POT-2 repress telomere maintenance pathways. G3. 3, Bethesda. 305-313 (2013).
  11. Duerr, J. Immunohistochemistry. WormBook (The C. elegans Research Community). , (2006).
  12. Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Meiosis: Volume 2, Cytological Methods. , Springer. 171-195 (2009).
  13. Emanuel, J. R. Simple and efficient system for synthesis of non-radioactive nucleic acid hybridization probes using PCR. Nucleic acids research. 19, 2790(1991).
  14. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  15. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J Vis Exp. , e4019(2012).
  16. Poon, S. S. S., Martens, U. M., Ward, R. K., Lansdorp, P. M. Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy. Cytometry. 36, 267-278 (1999).
  17. Ferreira, H. C., Towbin, B. D., Jegou, T., Gasser, S. M. The shelterin protein POT-1 anchors Caenorhabditis elegans telomeres through SUN-1 at the nuclear periphery. J Cell Biol. 203, 727-735 (2013).
  18. Lee, M. H., Schedl, T. RNA in situ hybridization of dissected gonads. WormBook. , 1-7 (2006).
  19. Tabara, H., Motohashi, T., Kohara, Y. A multi-well version of in situ hybridization on whole mount embryos of Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 24, 2119-2124 (1996).
  20. Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Curr Protoc Cell Biol. 18, Unit 18 14(2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Telomere FISHPNA ProbesC elegansFluorescence In Situ HybridizationTelomere LengthAlternative Lengthening of TelomeresTelomere QuantificationFluorescent MicroscopyProbe HybridizationAntibody Staining

Related Articles