Методическая статья

Разделительные Mesangiogenic клетки-предшественники (ПДК) из костного мозга человека

DOI:

10.3791/54225

⸱

15 июля 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical and Experimental Medicine, University of Pisa

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем оптимизированный, высоковоспроизводимый протокол для выделения мезодермальных клеток-предшественников (МПК) из костного мозга человека (hBM). МПК характеризовались проточной цитометрией и экспрессией нестинов. Они показали способность давать начало экспоненциально растущим МСК-подобным клеточным культурам, сохраняя при этом их ангиогенный потенциал.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В исследовании, направленном на выделение мезенхимальных стромальных клеток (МСК) костного мозга человека (МСК) для клинического применения, мы идентифицировали новую популяцию клеток, специально отобранную для роста в среде, дополненной сывороткой крови человека. Эти клетки характеризуются морфологическими, фенотипическими и молекулярными особенностями, отличными от МСК, и мы назвали их мезодермальными прогениторными клетками (МПК). ПДК круглые, с толстой сильно отражающейся областью ядра; Они демонстрируют сильную, устойчивую к трипсину адгезию к пластику. Неспособность расширить MPC напрямую показала, что они медленно цикличны. Об этом также говорит негатив Ki-67. С другой стороны, культивирование МПК в стандартной среде, предназначенной для экспансии МСК, привело к появлению популяции экспоненциально растущих МСК-подобных клеток. Помимо способности к мезенхимальной дифференцировке, МПК сохранили ангиогенный потенциал, что подтверждает их многолинейную прогениторную природу. В данной работе мы описываем оптимизированный высоковоспроизводимый протокол для выделения и характеристики hBM-MPC с помощью проточной цитометрии (CD73, CD90, CD31 и CD45), экспрессии нестина и организации F-актина. Также приведены протоколы мезенгенической и ангиогенной дифференцировки ПДК. Здесь мы также предлагаем более подходящую номенклатуру для этих клеток, которая была переименована в «Мезангиогенные клетки-предшественники».

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мезенхимальных стромальных клеток (МСК) имеют соответствующую клиническую ценность для их мульти-клонального потенциала дифференциации и их способности поддерживать кроветворение, секретировать факторы роста / цитокины, а также играть определенную роль в иммунорегуляции 1. В определении MSC на основе производства и применения терапии клетки были объектом обширных клинических и доклинических исследований 2, с особым вниманием к конкретным международного регулирования для обеспечения безопасности и эффективности лекарственного средства клетки (CBMP) лечения 3 основе. Человеческие MSCs являются широко культивируют в среде, содержащей добавки и реактивы животного происхождения, такие как эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и бычьего трипсина. Поэтому, наряду с инфекционными риски, связанные с манипуляцией клеток, пациенты также сталкиваются с прионные воздействия, а также иммунологические риски, связанные с белками, пептидами или других биомолекул животного происхождения, которые могут сохраняться после сбора клеток и transplanставление 4.

Чтобы обойти эту проблему, мы культивировали костного мозга человека (HBM) -derived MSCs в животной среде без, заменив FBS с складочный человеческого типа AB в сыворотке крови (PhABS). В этих условиях, наряду с растущими MSCs мы идентифицировали новую популяцию клеток. Эти клетки были морфологически и фенотипически отличаются от ПКЦ и показал характерный профиль экспрессии генов, а также характерные свойства выращиваемый / адгезии. Они сохранили оба mesengenic и развитие кровеносных сосудов , потенциал и , следовательно , были названы Мезодерма клетки - предшественники (ПДК) 5. Впоследствии, мы смогли определить селективные и воспроизводимые условия культивирования для создания на ПДК высокой степенью чистоты 6.

Кроме того, мы исследовали морфологические и биологические свойства MPCs. В ПДКп показали быть нестин-положительным, медленно велоспорта, Ki-67-негативных, так и с хромосом характеризуются длинными теломерами 5. Они выразили PLURipotency-ассоциированные факторы транскрипции Oct-4 и Nanog , а не мастер - регуляторы MSC RUNX2 и Sox9 7. Фенотипически ПДКп выразил эндоглина (CD105) на более низком уровне, чем MSCs пока отсутствуют мезенхимальные маркеры CD73, CD90, CD166. ПДКп также показал отличительный молекул адгезии , характеризующихся последовательным выражением РЕСАМ (CD31), интегрины сц (CD11a), аш (CD11b), αX (CD11c), а также интегрином β2 (CD18) , которые специально поддерживает podosome-подобных структур 8 , В стандартных средах расширения MSC, ПДКп быстро дифференцировались в ПКЦ через промежуточную стадию с изображением активации Wnt5 / кальмодулин ячейки сигнализации 9. ПДКп также сохранили ангиогенные свойства, о чем свидетельствует их способность прорастать из сфероидов в мышиных внеклеточного матрикса (ЕСМ) белка 3D культур. Развитие кровеносных сосудов потенциал быстро теряется после MPC дифференциации вдоль mesengenic линии.

Здесь мы представляем протоколы оптимизированы, чтобы изолировать и охарактеризовать высокоочищенные из НВМ ПДК образцов крови. Воспроизводимые протоколы для MPC mesengenic и развитие кровеносных сосудов дифференциации также описаны.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: После письменного согласия образцы НВМ были получены при ортопедической хирургии для замены тазобедренного сустава. Сразу же после того, как бедренной остеотомии шеи и перед бедренных рассверливание 20 мл шприц, содержащий 500 UI гепарина, был использован для аспирата свежий BM. Протокол следует рассматривать широко применимо к любому источнику БМ.

1. Выделение костного мозга человека мононуклеарных клеток (НВМ-МНК)

  1. Разведите 5 - 10 мл свежей БМ до 50 мл, применяя фосфатный буферный солевой раствор Дульбекко (D-PBS) и перемешать с помощью инверсии. В равной степени распределить 25 мл в двух новых 50 мл конические пробирки, добавляют 25 мл D-PBS в каждую пробирку и перемешать с помощью инверсии.
  2. Дайте пробирки стоять в течение 10 мин при комнатной температуре, для разделения минеральных фрагментов костей и жира из раствора.
  3. Осторожно удалите плавающий жир с помощью стерильной пипетки Пастера и фильтра клеточной суспензии через 70 мкм-фильтры, не нарушая фрагмента гранул минеральной костной массы.
  4. Установить четыре 50 мл пробирки с 15 мл среды для прерывистого центрифугирования в градиенте плотности (1,077 г / мл). Убедитесь в том, что эта среда находится при комнатной температуре.
  5. Осторожно положите 20 - 25 мл разбавленного БМ на вершине градиента плотности среды. Выполните эту операцию осторожно, позволяя клеточной суспензии струйкой на стенках трубки для предотвращения смешивания слоев.
  6. Проводят центрифугирования в градиенте плотности при 400 мкг в течение 30 мин при комнатной температуре с тормозом отключены.
  7. Соберите беловатый кольцо клеток, расположенных между двумя фазами с помощью стерильной пипетки Пастера и передать его в свежую 50 мл пробирку.
  8. Промыть клетки свежей культуральной средой: фенолового красного, низкий уровень глюкозы (1000 мг / л) Игла в модификации Дульбекко (DMEM), 10% (об / об) консервированной человеческой типа сыворотки АВ (PhABS), 2 мМ L-глутамина и антибиотики (DMEM / 10% PhABS). Центрифуга при 400 мкг в течение 5 мин.
  9. Отберите супернатант и повторно приостанавливать осадок в 5 - 10 мл свежей DMEM / 10% PhABS.
  10. Перейдем к количеству клеток.Определить количество белых кровяных клеток в соотношении 1: 1 разбавление в трипановым. Применить это к гемоцитомер, и наблюдать под фазово-контрастным микроскопом. Исключить маленькие и совершенно округлые эритроциты и синих пятнах мертвые клетки из числа клеток.
    Примечание: Настоятельно рекомендуется экран PhABS партий для их выполнения в MPC восстановления. PhABS из источников на территории США дали лучшие результаты в то время как большинство сывороток различного происхождения привело к MPC культур с большей долей MSC-подобных клеток.

2. Выделение из MPCs HBM-МНК

  1. Установить гидрофобные Т-75 колб с 15 мл свежей DMEM / 10% PhABS и пусть рН и температуры уравновешиваться путем предварительной инкубации при 37 ° С в 5% CO 2 в течение 30 мин.
  2. Семенной 4 - 6 х 10 7 НВМ-МНК на колбу и инкубируют при температуре 37 ° С в 5% CO 2 в течение 48 часов.
  3. Отберите и выбросьте среднего и не прилипшие клетки из колб. Добавьте 15 мл свежей DMEM / 10% PhABS и инкубировать при 37 ° Cв 5% CO 2. Поддержание культуры в течение 6 - 8 дней, изменение среды каждые 48 ч.
    Необязательно: Чтобы увеличить MPC выход, не прилипшие клетки от 2,3 может быть повторно высевали в новую культуру колбу и поддерживали, как описано для первичных культур.
  4. Отберите и выбросьте среды из колбы, промывают свежей DMEM и добавьте 2 мл свободной протеазы животного отсоединении раствора. Инкубируют при 37 ° С в течение 5 - 15 мин (во избежание длительной инкубации).
  5. Добавляют 10 мл свежей DMEM / 10% PhABS, аспирация суспензии клеток и центрифуге при 400 мкг в течение 5 мин
  6. Отберите и отбросить супернатант и повторно приостанавливать осадок в 1 - 2 мл свежей среды DMEM / 10% PhABS. Перейдем к количеству клеток, как описано в шаге 1.10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте трипсин / ЭДТА в качестве отсоединении реагента. ПДКп являются трипсин устойчивостью. Морфологические скрининг культур, до сбора клеток, настоятельно рекомендуется, чтобы оценить наличие веретенообразных MSC-подобных клеток. В случае значительного количества МСК-подобных клеток detected, повысить чистоту продукта клеток путем селективного удаления загрязненных клеток. Для этого, трипсин-переваривание может быть осуществлено до сбора MPC, путем добавления 2 мл трипсина / ЭДТА 0,05% в течение 2 мин. Wash культур дважды с 5 мл DMEM / 10% PhABS, а затем перейти к протеазному обработку, как описано выше.

3. Характеристика Cell

  1. Проточной цитометрии
    1. Настройка дублирующие образцы 10 5 свеже отдельных клеток в моющем растворе D-PBS , дополненной 0,5% (объем / объем) бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,02% (вес / объем) азида натрия. Центрифуга при 400 мкг в течение 5 мин.
      ВНИМАНИЕ: азид натрия является токсичным.
    2. Повторное приостановить гранул в 200 мкл промывочного раствора и добавить анти-CD90, анти-CD45, анти-CD73 и анти-CD31 антитела, конъюгированные с флуоресцентными красителями ( "Test"); параллельно настроить изотипа управления ( "Ctrl").
      Примечание: Суммы окрашивания антител должны быть определены путем титрования или Accorдинь с инструкциями производителя.
    3. Инкубируйте образцы при температуре 4 ° С в течение 30 мин.
    4. Центрифуга при 400 мкг в течение 5 мин. Повторное приостановить клеток в 500 мкл промывочного раствора и получают по меньшей мере 5 × 10 4 событий на потоке многоцветной цитометра 7 9 10.
    5. Анализ результатов по дот-графиков и использовать "Ctrl" записанные события, чтобы установить квадранта.
      Примечание: Для того , чтобы определить культуру как MPC культуры процент CD73 нег CD90 нег CD45 + CD31 + клеток должно быть более 95%. Для некоторых конкретных применений, например, анализ экспрессии генов, восстановление отсечка должна быть увеличена до 97 - 98%.
  2. Nestin обнаружение и анализ F-актин организация
    1. Пластинчатые свежевыделенные ПДКп на культуре камеры горками (20000 / см 2). Разрешить клетки придерживаться путем инкубации в течение ночи при 37 ° С в 5% CO 2.
    2. Вымойте клеток в моющем растворе и Ф.И.х в 4% (вес / объем) пара-формальдегидом при комнатной температуре в течение 15 мин. Чтобы удалить закрепляющий добавить моющий раствор, инкубировать в течение 2 мин и разлить.
    3. Повторите промывку дважды.
    4. Проницаемыми клетки в D-PBS с добавлением 0,05% (об / об) Тритона X-100 в течение 15 мин при комнатной температуре.
    5. Остановить реакцию белка свободного энхансер сигнала (30 мин при комнатной температуре) или стандартным блокирующим раствором (D-PBS с добавлением 3% (вес / объем) БСА).
    6. Удалить сигнал энхансер / блокирующего раствора.
    7. Добавить 7 мкг / мл (вес / об) античеловеческой нестина первичного антитела и инкубировать при температуре 4 ° С в течение ночи во влажной камере. Параллельно с этим, использовать изотипные контрольные антитела оценить не специфические сигналы флуоресценции.
    8. Вымойте слайдов путем добавления D-PBS, оставьте в течение 2 мин и разлить. Повторите дважды.
    9. Добавить 2 мкг / мл (вес / объем) флуоресцентных красителей конъюгированного вторичного антитела и инкубируют при 4 ° С в течение 1 ч в темноте.
    10. Вымойте слайды, как указано выше.
    11. Добавить флуоресцентный фаллоидином (5 МЕ / мл), оставьте при комнатной температуре в течение 30 мв в темное время суток и промыть 3 раза в D-PBS.
    12. Удалите стенки камеры и крепления слайдов в водной среде, дополненной монтажном с antifade реагентом и 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) для обнаружения ядер. Перейдите к визуализации 7 9 10.

4. Mesengenic Дифференциация MPCs

  1. Пластина 2 х 10 4 / см 2 свежевыделенные ПДКп в ТК-обработанных культуральных флаконах Т75 и пусть клетки прилипать в течение ночи в среде DMEM / 10% PhABS при 37 ° С в 5% CO 2.
  2. Заменить DMEM / 10% PhABS со стандартным снижением сыворотки среды, около 200 мкл / см 2, предназначенный для расширения мезенхимальных стромальных клеток (MSC-RS среды). Рост клеток до слияния (P1-MSCs), как правило, от 7 до 10 дней от индукции. Обновить средний каждые 2 дня.
  3. Отберите и выбросьте среды из колбы, промывают свежей средой MSC-RS и добавляют 2 мл свободной протеазы животного отсоединении раствора. Инкубировать при температуре 3776 ° С в течение 5 - 15 мин (во избежание длительной инкубации).
  4. Добавьте 10 мл свежей среды MSC-RS, аспирация суспензии клеток и центрифуге при 400 мкг в течение 5 мин
  5. Отберите супернатант и повторно приостанавливать осадок в 1 - 2 мл свежей среды MSC-RS. Перейдем к количеству клеток, как описано в шаге 1.10
  6. Перейдите к субкультуре их посевом 3 - 5 х 10 3 клеток / см 2. Рост клеток до слияния (P2-MSCs).
  7. Урожай клеток путем протеазы пищеварения, как описано со стадии 4.3 к шагу 4.5 и перейти к характеристике, как описано в разделе 3.
    Примечание: Процент CD73 + CD90 + CD45 нег CD31 нег клеток ниже 95% будет означать лишь частичную дифференциацию и требуют дальнейшего культивирования проход.
  8. Пластина P2-MSCs при 2 х 10 4 / см 2 в шести хорошо TC обработанных пластин и расти до слияния в МСЦ-RS среде.
  9. Марк две скважины, как "No Diff" и обновить MSC-RS среды.
  10. Марк два хорошоs как "Osteo" и заменить среду с 200 мкл / см 2 стандартного остеогенной среды, специально разработанной для MSC дифференциации.
  11. Марк две скважины , как "ADIPO" и заменить среду с 200 мкл / см 2 стандартного адипогенной среды, специально разработанной для MSC дифференциации.
  12. Поддержание культуры при 37 ° С в 5% СО 2 при условии изменения всей массовой информации каждые 48 ч.
    Примечание: Настоятельно рекомендуется использовать стандартные коммерчески доступные дифференцирующие носители для воспроизводимости результатов испытания. Через 2/3 недель условиях дифференцировки, отложения кальция появляются в остеогенных индуцированных культур, в то время как накопление внутриклеточные липидные капли проявляется в адипогенных индуцированных клеток.
  13. Отберите и выбросьте питательные среды затем промыть D-PBS.
  14. Закрепить культур путем добавления 1 мл 4% (вес / объем) пара-формальдегидом в течение 15 мин при комнатной температуре.
  15. Чтобы удалить закрепляющий добавить D-PBS, инкубировать в течение 2 мин и разлить. Повторите промываниедважды.
  16. Пятно один "No Diff" вместе с двумя "костно" отмечены скважины в гидроксиапатита конкретного флуоресцентного раствора и один "No Diff" вместе с двумя "Adipo" отмечены скважины в 200 нМ нильский красный раствор. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре 11,12.
  17. Удалить окрашивания растворов и мыть в D-PBS дважды.
  18. Удалить D-PBS, добавить D-PBS с добавлением 50% (об / об) глицерине и перейти к визуализации 7 9 10.

5. MPC Сфероид Проращивание Анализ

  1. Для создания 3D сфероидов, лежали 20 мкл капель свежевыделенными MPC суспензии (1,5 × 10 4 клеток / капли) на внутренней поверхности крышки тарелки Петри.
    Примечание: В качестве обработки капель может привести к их разрыву, то настоятельно рекомендуется укладывать их в избытке.
  2. Осторожно использовать крышку, чтобы резюмировать чашку Петри, содержащую D-PBS, чтобы предотвратить испарение висячей капли. Инкубировать при 37 ° С в 5% CO 2ночь, чтобы клетки агрегировать в 3D сфероидов.
  3. Установить густой гель мышиных внеклеточного матрикса (ECM) белков путем добавления 300 мкл аликвоты стандартных белков ЕСМ в предварительно охлажденный 24-луночный планшет для культивирования, и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 30 мин.
  4. Тщательно опрокинуться блюдо крышкой Петри и осторожно подобрать сфероиды с помощью стерильной пипетки Пастера.
  5. Lay сфероиды на гель белка ЕСМ, добавляют 700 мкл аликвоты стандартного VEGF-обогащенной среде роста эндотелиальных клеток и инкубируют при температуре 37 ° С в 5% CO 2.
  6. Через 24 часа и через 7 дней культивирования, сфотографировать 3D культур при увеличении мощности 4X. Оценка отростков сфероидов, претендующих программного обеспечения для анализа изображений путем измерения радиального расстояния между последней ячейкой и вторгающегося сфероида края. Повторные меры вдоль, по меньшей мере, 20 различных направлений. Среднее расстояние считается положительным, когда 50 мкм или более.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Селективные условия культивирования , описанные здесь , позволили выделение нового прилипший и почти мономорфный клеточной популяции , как 1,0% от НВМ-МНК (0,5 - 2,0 х 10 6 НВМ-МНК от 5 - 10 мл свежих образцов БМ) 5,6 , Мы определили эти большие (40 - 60 мкм в диаметре), округлые, покоящиеся, Ki-67-негативных клеток в качестве MPCs 5. Морфологически они характеризуются отличительным яичницы-образной формы с толстым области сердцевины , окруженной плоской тонкой периферии показывая много филоподий при большем увеличении мощности (белые стрелки на рисунке 1 А.1). Полярный удлинение границы внешней клеточной часто наблюдается (черные стрелки на рисунке 1 А.1). Такая морфология явно отличается от типичного веретенообразной мезенхимального появления стромальных клеток указаны в стандартных культурах MSC. Проточная цитометрия показали более 95% свежеизолированных MPCs выразить CD31 и CD45 а тesenchymal связанные маркеры CD90 и CD73 13 не были обнаружены (рис 1 А.2). Мы рассматриваем этот ограниченный набор из четырех антигенов в качестве ориентировочных для MPCs. Далее отличительные признаки MPCs усеяны распределение F-актин обнажив ряд podosome-подобных структур (красный на рисунке 1 А.3) и интенсивная экспрессия нестина (зеленый на рисунке 1 А.3), который не обнаруживается в клетках окрашивали изотипическим контрольным антителом (данные не показаны).

Культивирование ПДКп в стандартных RS среда предназначена для расширения результатов MSC в быстрой дифференциации в экспоненциально растущих MSC-подобных клеток (рисунок 1 B.1). После двух пассажей клетки , наконец , переключить их фенотип от CD73 нег CD90 нег CD45 + CD31 + CD73 + к CD90 + CD45 нег CD31 нег (рис 1 В.2). В процессе, ПДКп повторно органиределить F-актина в стрессовых волокон в то время как нестин экспрессия становится ограничивается редкими клетками (рис 1 В.3). MPC mesengenic дифференциации в определенный MSC-подобный фенотип происходит через две различные стадии, выявленные различными морфологией клеток. После одной недели в среде MSC RS остаточная популяция MPC-подобных клеток по - прежнему обнаруживается в пределах вырожденного слоя плоских, полигональных многозабойных клеток (P1-MSCs на рисунке 2 А). Дальнейшее прохождение требуется получить почти мономорфический культуру веретенообразных MSC-подобные клетки (P2-MSCs на рисунке 2 А). Эти экспоненциально растущие клетки могут легко дифференцироваться в остеобласты или адипоцитов при передаче в селективной среде в течение по крайней мере 2-х недель, таким образом подтверждая их MSC характер. В остеогенных индуцированных культур, отложения кальция могут быть обнаружены с помощью либо колориметрическим ализарин-S окрашивать или специфических флуоресцентных красителей (зеленый на рисунке 2 , B). После того, как адипогенных индукционных клетокпоказывают накопление липидов капель , как показали либо колориметрическим Oil Red или флуоресцентный Нила Красное пятно (красный на рисунке 2 B).

МРС типирование было подтверждено прорастание ангиогенеза анализа. ПДКп показали свою способность вторгнуться (более 50 мкм) гель белка мышиного ECM от 3D сфероидов после 24 ч VEGF-раздражитель (рис 2 C). Через неделю вторгшиеся клетки были обнаружены при 300 - 600 мкм на расстоянии. С другой стороны , емкость вторжение было потеряно в Р2-ПКЦ после mesengenic дифференцировки (рис 2 D).

figure-results-1
Рисунок 1. свежеизолированных ПДКп имеют отличительные особенности. Культивирование HBM-МНК в DMEM / 10% PhABS в течение семи дней приводит к популяции покоящихся MPCs (А) легко отличить от ПКЦ (B) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2. ПДКп дифференцироваться в стандартных MSCs и Show ангиогенеза побегов пробирке. Замена DMEM / PhABS с коммерчески доступными RS средой , предназначенных для расширения MSC запускает mesengenic индукции MPCs. Через одну неделю в культуре мало остаточных ПДКп все еще ​​наблюдается (Р1-МСК) в то время как дальнейшее прохождение в ЦКМ-RS среде приводит к популяции сливающихся ЦКМ-подобных клеток (Р2-ПКЦ, шкале полоски = 100 мкм). п2-терминально MSCs дифференцироваться в остеоциты или адипоцитов при надлежащих стимулов , как показали отложение кальция (зеленый в B) и накоплением липидов капельным (красный в B, окалины полоски = 200 мкм), соответственно. ПДКп показывают последовательное отростков сфероидов в мышиной ECM белка геля (С) при разнице с P2-ПКЦ (D, масштаб баров = 1,0 мм). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последние десятилетия МСК были тщательно исследованы и доклинически оценены на предмет возможного применения в лечении различных костных/суставных, иммунологических, неврологических, сердечно-сосудистых, желудочно-кишечных и гематологических расстройств14,15. Простое и недорогое выделение мультипотентных МСК из многих различных тканей, а также отсутствие у них значительной иммуногенности16 делают эти клетки одной из наиболее интересных клеточных популяций для применения в клеточной терапии. Тем не менее, очень низкая частота в исходной ткани представляет собой серьезное ограничение для применения МСК в клиниках, вызывая экспансию этих клеток in vitro перед инфузией или трансплантацией.

Расширенные культуры МСК показали высокие степени гетерогенности и изменчивости17-19 , что затрудняет достижение консенсуса по протоколам производства и характеризации МСК. Более того, недавние исследования показали наличие множественных предков МСК in vivo в широком спектре тканей, которые вносят свой вклад в гетерогенность культуры10,20. На самом деле, было высказано предположение, что определенные условия культивирования могут отбирать или просто способствовать появлению определенных субпопуляций предшественников МСК, присутствующих в различных процентах в «сырых» и необработанных образцах, таких как костный мозг (hBM-MNCs) или жировые ткани (стромальная васкулярная фракция)2. Таким образом, вариабельность популяций клеток, инициирующих МСК, вместе с большим количеством применяемых протоколов обогащения/изоляции и культивирования, представляет собой большое препятствие для определения возможных методов лечения на основе МСК.

Решающим фактором, влияющим на гетерогенность культур МСК, является прием добавок сыворотки21. В наших руках замена FBS на PhABS в первичных культурах из hBM-MNC в сочетании с высокой плотностью посева на гидрофобные пластики привела к выделению новой высокоадгезионной клеточной популяции с отчетливыми биологическими особенностями, названными MPC5,6. Мы обнаружили, что добавление небольшого процента PhABS к первичным культурам FBS также позволило выделить MPC, что свидетельствует о присутствии агентов, индуцирующих MPC, в сыворотке кровичеловека 6. На данный момент протокол выделения/характеризации ПДК является уникальным методом, доступным для получения практически чистых ПДК. Протокол был тщательно отрегулирован и обладает высокой воспроизводимостью для качественного скрининга препаратов МПК перед дальнейшим применением.

ПДК могут быть использованы в качестве источника для производства МСК, что ограничивает вариативность, вносимую использованием нефракционированного исходного материала. Точное определение нескольких стадий, характеризующих мезенгеническую дифференцировку ПДК, о котором сообщается9 , позволило бы синхронизировать экспансию мезенхимальных клеток. Тем не менее, это последнее условие может быть реализовано исключительно с использованием высокоочищенной популяции ПДК, как следствие характеристики клеточных продуктов, полученных по описанному здесь протоколу, что имеет решающее значение. Сообщалось, что этот метод изоляции позволяет извлекать ПДК с чистотой в целом около 95%. Тем не менее, вариабельность донор/пациент вместе с вариабельностью, связанной с различными партиями применяемой объединенной сыворотки человека, может привести к значительному проценту МСК-подобных клеток, коизолированных вместе с МПК, в условиях селекции.

Неясно, могли ли эти «загрязняющие» МСК-подобные клетки возникать от других предшественников in vivo , описанных в костном мозге22 , или от неконтролируемой и спонтанной дифференцировки МПК. В любом случае, постоянный процент МСК-подобных клеток в продуктах МПК сводит на нет возможность применения этих клеток в качестве однородного исходного материала для экспансии МСК. Таким образом, здесь был предложен простой и недорогой способ, основанный на устойчивости МПК к расщеплению трипсина, повышающий чистоту продуктов ПДК. Аналогичные или даже лучшие результаты в очистке культур ПДК могут быть достигнуты путем флуоресцентной или магнитной сортировки клеток, выполняющей истощение CD73 и/или CD90, но значительно продлевающей время процесса и увеличивающей затраты.

Кроме того, МПК показали экспрессию плюрипотент-ассоциированных маркеров и нестина, которые быстро терялись во время мезенгенической дифференцировки7. Анализ проращивания показал способность МПК проникать в мышиный белковый гель ECM. В совокупности эти результаты указывают на то, что МПК следует рассматривать как более незрелых предшественников, сохраняющих ангиогенный потенциал. Тем не менее, первоначальный энтузиазм по поводу мезодермального дифференцировочного потенциала МПК на самом деле ослабевает. Фактически, после более чем 7 лет исследований МПК мезенгенный и ангиогенный потенциал был подробно описан5-9, но дифференцировка в сторону любых других клеток мезодермального происхождения до сих пор отсутствует. Таким образом, здесь мы предлагаем новое, и более строгое, определение этих клеток как «мезангиогенных клеток-предшественников», сохраняя аббревиатуру MPC.

Мы также считаем, что большинство споров об ангиогенном потенциале МСК может быть связано с гетерогенным составом расширенных культур, состоящих из субпопуляций МПК и МСК в переменных процентах23.

Наконец, МПК также могут играть решающую роль в реализации ММП, применимых для реконструкции тканей, поскольку эти клетки также могут поддерживать неоваскуляризацию. На самом деле, будущие исследования регенерации должны учитывать тот факт, что рост вновь образованной ткани должен поддерживаться сопутствующим неоангиогенезом. Сосуществование мезенгенного и ангиогенного потенциала в МПК может значительно улучшить потенциал регенерации новых терапевтических подходов, которые включают эти интересные клетки.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов или иного конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы особенно поблагодарить д-ра Паоло Parchi, отделение хирургической, медицинской и молекулярной патологии и реаниматологии, Университет Пизы, для предоставления образцов костного мозга и его экспертизу в человеческих костно-предшественниках

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Matrigel Basement Membrane MatrixBD Bioscience (Сан-Хосе, Калифорния-США)354230Мышиные белки ECM
Исходная концентрация: 100% (9 - 12 мг/мл)
Конечная концентрация: 100%
фосфатно-солевой буфер Дульбекко (D-PBS)Sigma (Сент-Луис, Миссури, США)D8537
70 μ m FiltersMiltenyi Biotec (БергишГладбах, Германия)130-095-823
Ficoll-Paque PREMIUM GE Healthcare (Уппсала, Швеция)17-5442-03среда для прерывистого центрифугирования градиента плотности
Объединенная человеческая сыворотка типа AB (PhABS)LONZA (Walkersville MD-США)14-490EКонечная концентрация: 10%
Glutamax-IThermoFisher (Waltham,  MA США)35050-038Стабилизированный L-глутамин
Концентрация: 100x
Конечная концентрация: 2 мМ
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Sigma (Сент-Луис, Миссури, США)A8412Концентрация: 7,5%
Конечная концентрация: 0,5%
Азид натрияSigma (Сент-Луис, Миссури, США)S8032Конечная концентрация: 0,02%
Пенициллин/стрептомицин (Pen Strepp)Gibco ( Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США)15070-063Антибиотики
Концентрация в запасе: 5,000 UI/мл пенициллина, 5,000 μ г/мл стрептомицина
Конечная концентрация: 50 МКС/мл пенициллина, 50 μ г/мл Стрептомицин
Т-75 культуральная колба для суспензии культурGreiner Bio-one  (Фрикенхаузен, Германия)658 190
Колба для культуры T-75 обработанная TCGreiner Bio-one  (Фрикенхаузен, Германия)658170
TrypLE SelectThermoFisher (Waltham,  MA США)12563-011Отслаивающий раствор протеаз животного происхождения
Исходная концентрация: 1x
Конечная концентрация: 1x
Trypsin/EDTAThermoFisher (Waltham,  MA США)15400-054Фенол красный свободный
Концентрация: 0,5%
Конечная концентрация: 0,25%
антитела к CD90 APC  (КД90)MiltenyiBiotec (БергишГладбах, Германия)130-095-402Конечная концентрация: 1:40
антитело против CD45 APC-Vio770 (CD45)MiltenyiBiotec (БергишГладбах, Германия)130-096-609Конечная концентрация: 1:40
антитело против CD73 PE (CD73)MiltenyiBiotec (БергишГладбах, Германия)130-095-182Конечная концентрация: 1:40
антитело против CD31 PE Vio-770 (CD31)MiltenyiBiotec (БергишГладбах, Германия)130-105-260Конечная концентрация: 1:40
Мышиное антитело IgG1 APCMiltenyiBiotec (Бергиш-Гладбах, Германия)130-098-846Конечная концентрация: 1:40
мышиное антитело IgG2a APC Vio770MiltenyiBiotec (Бергиш-Гладбах, Германия)130-096-637Конечная концентрация: 1:40
мышиное антитело IgG1 PEMiltenyiBiotec ( BergischGladbach, Германия)130-098-845Конечная концентрация: 1:40
Мышиное антитело IgG1 PE Vio-770MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Германия)130-098-563Конечная концентрация: 1:40
Модифицированная среда Eagle от Dulbecco  (ДМЭМ)ThermoFisher (Waltham,  MA США)13-1331-82Фенол без красных минимальных незаменимых сред
Концентрация: 1,000 мг/л
глюкозы Фетальная бычья сыворотка  (ФБС)ThermoFisher (Waltham,  MA США)10500Стоковая концентрация: 0,2 мг/мл<бр/> Конечная концентрация: 2 мкм; г/мл
Пролонгированный реагент Gold antifade с 4',6-диамидино-2-фенилиндоломInvitrogen (Waltham, MA,  США)P-36931Водная монтажная среда + DAPI
Конечная концентрация: 1x
ПараформальдегидSigma (Сент-Луис, Миссури, США)P6148Фиксатор
Конечная концентрация: 4%
LAB-TEK двухлуночные камерные слайдыSigma (Сент-Луис, Миссури, США)C6682
Антитело против нестина [клон 10C2]Abcam (Кембридж, Великобритания)ab2035Исходная концентрация: 1 мг/мл<бр/> Конечная концентрация: 7 мкм; г/мл
Alexa Fluor 555 ФаллоидинThermoFisher (Waltham,  MA США)A34055Концентрация в запасе: 200 UI/мл
Конечная концентрация: 5 UI/мл
Triton X-100Euroclone (Милан, Италия)EMR237500Конечная концентрация: 0,05%
MesenPRO RS Medium  (Среда MSC-RS)ThermoFisher (Waltham,  MA США)12746-012
Alexa Fluor 488 антимышиный SFX комплектThermoFisher (Waltham,  MA США)A31619Козье вторичное антитело против мышей + усилитель сигнала
Стоковая концентрация: 2 мг/мл
Конечная концентрация: 2 мкм; г/мл
Пастеровская пипеткаKartell Labware  (Новильо (MI), ИТАЛИЯ )329
StemMACS AdipoDiff  MediaMiltenyiBiotec (BergischGladbach, Германия)130-091-679
StemMACS OsteoDiff  MediaMiltenyiBiotec (BergischGladbach, Германия)130-091-678
Osteoimage Анализ костной минерализацииLONZA (Walkersville MD-США)PA-1503Гидроксиапатит специфический раствор флуоресцентного окрашивания
50 мл Полистирольная коническая трубкаGreiner bio-one (Kremsmü nster
Австрия)		227261
Nile RedThermoFisher (Waltham,  MA США)N1142Раствор флуоресцентного окрашивания для липидов
Концентрация: 100 мМ<бр/> Конечная концентрация: 200 нм
глицеринаSigma (Сент-Луис, Миссури, США)G2289Конечная концентрация: 50%
Полистирол Чашки Петри Sigma(Сент-Луис, Миссури, США)P5606
24-луночные планшеты TC-обработанныеGreiner Bio-one GmbH (Фрикенхаузен, Германия)662160
Эндотелиальная питательная среда, EGM-2 BulletKit  (ЭГМ-2)LONZA (Уокерсвилль, штат Мэриленд, США)CC-3162VEGF-обогащенная среда для роста эндотелиальных клеток
Leica Qwin Программное обеспечение для анализа изображенийLeica (Вецлар, Германия)Программное обеспечение для анализа изображений

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stoltz, J. F., et al. Stem Cells and Regenerative Medicine: Myth or Reality of the 21th Century. Stem Cells Int. 2015, 734731(2015).
  2. Pacini, S. Deterministic and stochastic approaches in the clinical application of mesenchymal stromal cells (MSCs). Front Cell Dev Biol. 2, 50(2014).
  3. Galvez, P., Clares, B., Hmadcha, A., Ruiz, A., Soria, B. Development of a cell-based medicinal product: regulatory structures in the European Union. Br Med Bull. 105, 85-105 (2013).
  4. Herberts, C. A., Kwa, M. S., Hermsen, H. P. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 9, 29(2011).
  5. Petrini, M., et al. Identification and purification of mesodermal progenitor cells from human adult bone marrow. Stem Cells Dev. 18 (6), 857-866 (2009).
  6. Trombi, L., et al. Selective culture of mesodermal progenitor cells. Stem Cells Dev. 18 (8), 1227-1234 (2009).
  7. Pacini, S., et al. Constitutive expression of pluripotency-associated genes in mesodermal progenitor cells (MPCs). PLoS One. 5 (3), 9861(2010).
  8. Pacini, S., et al. Specific integrin expression is associated with podosome-like structures on mesodermal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (12), 1830-1838 (2013).
  9. Fazzi, R., et al. Mesodermal progenitor cells (MPCs) differentiate into mesenchymal stromal cells (MSCs) by activation of Wnt5/calmodulin signalling pathway. PLoS One. 6 (9), 25600(2011).
  10. Tormin, A., et al. CD146 expression on primary nonhematopoietic bone marrow stem cells is correlated with in situ localization. Blood. 117 (19), 5067-5077 (2011).
  11. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
  12. Wang, Y. H., Liu, Y., Maye, P., Rowe, D. W. Examination of mineralized nodule formation in living osteoblastic cultures using fluorescent dyes. Biotechnol Prog. 22 (6), 1697-1701 (2006).
  13. Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7 (5), 393-395 (2005).
  14. Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19(2012).
  15. Si, Y. L., Zhao, Y. L., Hao, H. J., Fu, X. B., Han, W. D. MSCs: Biological characteristics, clinical applications and their outstanding concerns. Ageing Res Rev. 10 (1), 93-103 (2011).
  16. Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp Hematol. 31 (10), 890-896 (2003).
  17. Phinney, D. G. Biochemical heterogeneity of mesenchymal stem cell populations: clues to their therapeutic efficacy. Cell Cycle. 6 (23), 2884-2889 (2007).
  18. Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: implications for cell therapy. J Cell Biochem. 113 (9), 2806-2812 (2012).
  19. Tolar, J., Le Blanc, K., Keating, A., Blazar, B. R. Concise review: hitting the right spot with mesenchymal stromal cells. Stem Cells. 28 (8), 1446-1455 (2010).
  20. Corselli, M., et al. The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 21 (8), 1299-1308 (2012).
  21. Bieback, K., et al. Human alternatives to fetal bovine serum for the expansion of mesenchymal stromal cells from bone marrow. Stem Cells. 27 (9), 2331-2341 (2009).
  22. Watson, L., Elliman, S. J., Coleman, C. M. From isolation to implantation: a concise review of mesenchymal stem cell therapy in bone fracture repair. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 51(2014).
  23. Pacini, S., Petrini, I. Are MSCs angiogenic cells? New insights on human nestin-positive bone marrow-derived multipotent cells. Front Cell Dev Biol. 2, 20(2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CD31CD45F

Похожие статьи