Адаптивные методы эволюции и изоляции описаны и продемонстрированы с получением производных Scheffersomyces stipitis штамма NRRL Y-7124, которые способны быстро потреблять гексозы и пентозы смешанных сахаров в фермента осахаривают undetoxified гидролизатов и аккумулировать более 40 г / л этанола.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Методы эволюции Robust пентозы брожения дрожжей для биоконверсии лигноцеллюлозы к этанолу
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Лигноцеллюлозная биомасса является обильным, возобновляемым сырьем, пригодным для производства топливного этанола и других биопродуктов. Процессы предварительной обработки и осахаривания ферментов высвобождают сахара, которые могут ферментироваться дрожжами. Традиционные промышленные дрожжи не ферментируют ксилозу (составляющую до 40% растительных сахаров) и не способны функционировать в концентрированных гидролизатах. Концентрированные гидролизаты необходимы для поддержания экономичного извлечения этанола, но они содержат токсичные побочные продукты, образующиеся во время предварительной обработки. Несмотря на то, что методы детоксикации могут сделать гидролизаты ферментируемыми, они являются дорогостоящими и приводят к утилизации отходов. В данной работе описаны и продемонстрированы методы адаптивной эволюции и выделения, позволяющие получить производные нативного штамма Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124, которые способны эффективно преобразовывать гидролизаты в экономически восстанавливаемый этанол, несмотря на неблагоприятные условия культивирования. Улучшенные особи обогащаются в развивающейся популяции с использованием давления множественного отбора, основанного на естественном генетическом разнообразии популяции S. stipitis и мутациях, вызванных воздействием двух различных гидролизатов, этанола или ультрафиолетового излучения. Культуры окончательной эволюции разбавляются для получения преобладающих изолятов, в то время как промежуточные популяции, замороженные в глицерине на различных стадиях эволюции, обогащаются на селективных средах с использованием соответствующих градиентов напряжения для восстановления наиболее перспективных изолятов путем разбавления. Изоляты проверяют на различные типы гидролизатов и ранжируют с использованием новой процедуры, включающей безразмерные преобразования индекса относительной эффективности (RPI) скорости поглощения ксилозы и данных о выходе этанола. Используя статистический параметр RPI, рассчитывается общее среднее относительное значение производительности для ранжирования изолятов на основе множества факторов, включая условия культивирования (различающиеся по питательным веществам и ингибиторам) и кинетические характеристики. Благодаря применению этих методов, производные исходного штамма имели следующие улучшенные свойства фермента осахаренных гидролизатов при рН 5-6: уменьшение начальной фазы лага, предшествующей росту, уменьшение диавспомогательного лага при переходе глюкоза-ксилоза, значительное увеличение скорости ферментации, улучшение толерантности к этанолу и накопление до 40 г/л.
Введение
По оценкам , ежегодные 1,3 млрд сухих тонн биомассы лигноцеллюлозы может поддержать производство этанола и позволит США сократить потребление нефти на 30%. 1 Хотя биомасса растений урожайность гидролиза сахара смеси , богатые глюкозы и ксилозы, ингибиторы брожения генерируются предварительной химической обработки , необходимой чтобы сломать гемицеллюлозы и подвергать целлюлозу ферментной атаке. Уксусная кислота, фурфурол и оксиметилфурфурола (HMF), как полагают, являются ключевыми компонентами среди многих ингибиторов, которые формируют во время предварительной обработки. Для того чтобы переместить лигноцеллюлозного производство этанола вперед, исследовани....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка исходных материалов и оборудования для Assays
- Подготовка гидролизатов с использованием 18 до 20% исходной биомассы сухого веса в реакции предварительной обработки для использования в процессе эволюции, изоляции и процедур ранжирования. См Slininger и др. 2015 18 для детальных методов подготовки Afex CSH, PSGHL и SGH с азотными добавками N1 или N2 , используемых в процессе эволюции, выделения или ранжирования. Таблицу 1 для композиции каждого гидролизата типа.
Примечание: Азотные Укрепления SGH были назначены в качестве SGH-N1 или SGH-N2 определяется следующим образом: SGH-N1 = SGH укреплен до 42: 1 ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
С. stipitis выработалось с использованием комбинаций трех культур отбора, которые включали Afex CSH, PSGHL и этанол-вызов ксилозы офсетные непрерывную культуру. На рисунке 1 показана принципиальная схема экспериментов эволюции , выполненных вместе с изолятов найти либо выполнить наиболее эффективно в целом, или наиболее эффективно на одном из гидролизатов протестированных. в таблице 3 приведены номера NRRL о присоединении этих улучшенных изолятов и обобщает адаптационных напряж.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Несколько шагов имеют решающее значение для успеха процесса эволюции. Во-первых, она является ключом, чтобы выбрать соответствующие давления отбора, чтобы вести эволюцию населения в сторону желаемых фенотипов, которые необходимы для успешного применения. Следующие селективные напряжения были выбраны для S. stipitis развитие и применяются в соответствующие моменты времени , чтобы направлять по обогащению для желательных фенотипов: повышение прочности на 12% глюкана AFEX CSH (вынуждающих роста и ферментации разли.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы хотели бы выразить нашу искреннюю признательность докторам Кеннету Фогелю, Роберту Митчеллу и Гаутаму Сарату, Исследовательскому отделу зерна, фуража и биоэнергетики, Служба сельскохозяйственных исследований, Линкольн, Небраска, за их любезную поставку просо для этого проекта. Мы также благодарим Министерство энергетики США за финансирование VB в рамках гранта DE-FC02-07ER64494 Биоэнергетического исследовательского центра Великих озер (GLBRC) Министерства энергетики США.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Cellic Ctec, Содержит ксиланазу (эндо-1,4-) | Новозимы | Нет продукта | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Cellic Htec, Содержит целлюлазу и ксиланазу | Новозимы | Нет продукта | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Поджаренная питательная мука | Archer Daniels Midland Co. (ADM) | 63160 | ADM, 4666 Faries Parkway, Декейтер, Иллинойс; 1800-37-5843 |
| Плуроновый F-68 (поверхностно-активное вещество) | Sigma-Aldrich | P1300 | Sigma-Aldrich |
| Difco Витаминный анализ Casamino Acids | Becton Dickinson and Company | 228830 | Множественные поставщики: например, Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| D,L-триптофан | Sigma-Aldrich | T3300 | несколько поставщиков: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | несколько поставщиков: e., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich |
| Bacto Agar | Becton Dickinson and Company | 214010 | несколько поставщиков: e., Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Malt Extract | Becton Dickinson and Company | 218630 | несколько поставщиков: например, Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Дрожжевой экстракт | Becton Dickinson and Company | 212750 | множественные поставщики: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Peptone Type IV из сои | Fluka | P0521-500g | множественные поставщики: e., Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Adenine, >99% порошок | Sigma-Aldrich | A8626 | CAS 73-24-5. Можно было бы использовать и другие бренды. Несколько поставщиков: например, Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Cytosine, >99% | Sigma-Aldrich | C3506 | CAS 71-30-7. Можно было бы использовать и другие бренды. Несколько поставщиков: например, Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Guanine, SigmaUltra | Sigma-Aldrich | G6779 | CAS 73-40-5. Можно было бы использовать и другие бренды. Несколько поставщиков: например, Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC Thymine |
| , 99% | Sigma-Aldrich | T0376 | CAS 65-71-4. Можно было бы использовать и другие бренды. Несколько поставщиков: e., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Uracil, 99% | Sigma-Aldrich | U0750 | CAS 66-22-8. Можно было бы использовать и другие бренды. Несколько поставщиков: например, Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Dextrose (D-Glucose), безводный, сертифицированный ACS | Fisher Chemical | D16-500 | CAS 50-99-7. Можно было бы использовать и другие бренды. Несколько поставщиков: например, Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| D-Xylose, анализ >99% | Sigma-Aldrich | X1500 | CAS 58-86-6. Можно было бы использовать и другие бренды. Несколько поставщиков: например, Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| 96-луночные, плоскодонные пластины | Becton Dickinson Falcon | 351172 | несколько поставщиков: например, Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Wypall L40 Wiper | Kimberly-Clark | полотенце в коробках с микропластинами для поглощения воды для увлажнения; несколько поставщиков например, Thermo-Fisher, улин, Daigger | |
| Колба из градуированного пирекса, 125 мл, узкое отверстие (пробка #5) | Стекло Corning Life Science Glass | 4980-125 | несколько поставщиков: например, Thermo-Fisher, VWR, шейкер / инкубатор Daigger |
| Innova 42R, вращение 2,5 см (1") | Нью-Брансуик Scientific (1-800-631-5417) | M1335-0016 | Несколько поставщиков: например, Eppendorf, Thermo-Fisher. Можно использовать другие шейкеры/инкубаторы с пледом 2,5 см (1 дюйм). |
| Duetz Cover Clamp для 4 глубоких луночных пластин MTP | Applikon Biotechnology | Z365001700 | applikon-biotechnology.com (США), 1-650-578-1396 |
| Duetz System многослойный чехол для 96 глубоких луночных пластин | Applikon Biotechnology | Z365001296 | applikon-biotechnology.com (США), 1-650-578-1396 |
| Duetz System силиконовый уплотнитель (0,8 мм черный с низким испарением) для 96 глубоких луночных пластин | Applikon Biotechnology | V0W1040027 | applikon-biotechnology.com (США), 1-650-578-1396 |
| Синий слой микрофибры для сэндвич-чехла системы Duetz | Applikon Biotechnology | V0W1040001 applikon-biotechnology.com (США), 1-650-578-1396 | |
| 96 лунок, 2 мл квадратные луночные пирамидальные донные пластины, натуральный попипропилен | Applikon Biotechnology | ZC3DXP0240 | applikon-biotechnology.com (США), 1-650-578-1396 |
| Колпаки Bellco 32 мм силиконовые губчатые пробки, шт. 25 для колб 125 мл | Bellco | 1924-00032 | Thomas Scientific, их каталожный номер 1203K27 |
| Bellco Spinner Flask, 1968-Стеклянный купол, герметичный фланцевый тип, рабочий объем 100 мл. Данная конструкция больше не производилась. | Bellco | 1968-00100 (оригинальная кат. Нет.) | Сосуды с рубашкой имеют нижние входные и верхние выпускные отверстия для регулирования температуры с циркуляционной водяной баней. Сосуды имеют 75 мм в наружном диаметре и 200 мм в высоту. Есть четыре боковых порта на ~45° уголки и один верхний порт. Отверстия для отверстий соответствуют размеру неопреновых пробок размера 0 (внутренний диаметр 21-22 мм на портах). |
| Инфракрасная сушильная печь Mathis Labomat | MathisAg | Typ-NBR BFA12 215307 | Werner Mathis США Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157 |
| Двухканальный биохимический анализатор | YSI Life Sciences | 2900D-UP | www.ysi.com, роботизированная система для быстрого анализа сахаров в формате 96-луночных микропланшетов |
| PowerWave XS Microplate Spectrophotometer | Bio-Tek Instruments, Inc | MQX200R | www.biotek.com |
Ссылки
- Perlack, R. D., Stokes, B. J. US Department of Energy. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , Department of Energy. Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN. (2011).
- Prior, B. A., Kilian, S. G., duPreez, J. C. Fermentation of D-xylose by the yeas....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
