Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Человек Первичная трофобласта клеточной культуры модель для изучения защитных эффектов мелатонина Против Гипоксия / реоксигенация-индуцированное Срыв

15.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54228

⸱

30 июля 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1INRS-Institut Armand-Frappier

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этой рукописи представлена уникальная in vitro модель иммуноочищенных клеток ворсинчатого цитотрофобласта человека, культивируемых в условиях гипоксии/реоксигенации. Эта модель подходит для изучения защитных эффектов перспективных методов лечения, таких как мелатонин, на осложнения беременности, связанные с повышенным окислительным стрессом и изменением функции плаценты.

Аннотация

Этот протокол описывает, как ворсинчатые клетки цитотрофобласта выделяются из плаценты в срок с помощью последовательного ферментативного разложения, за которым следует центрифугирование по плотности, выделение градиента среды и иммуномагнитная очистка. Как наблюдалось in vivo, одноядерные ворсинчатые клетки цитотрофобласта в первичной культуре дифференцируются в многоядерные клетки синцитиотрофобласта через 72 часа. По сравнению с нормоксией (8%О2), ворсинчатые клетки цитотрофобласта, которые подвергаются гипоксии/реоксигенации (0,5% / 8%О2), подвергаются повышенному окислительному стрессу и внутреннему апоптозу, аналогичному тому, что наблюдается in vivo при осложнениях беременности, таких как преэклампсия, преждевременные роды и задержка внутриутробного развития. В этом контексте первичные ворсинчатые трофобласты, культивируемые в условиях гипоксии/реоксигенации, представляют собой уникальную экспериментальную систему, позволяющую лучше понять механизмы и сигнальные пути, которые изменяются в плаценте человека, и облегчить поиск эффективных препаратов, защищающих от определенных нарушений беременности. Ворсинчатые трофобласты человека продуцируют мелатонин и экспрессируют его синтезирующие ферменты и рецепторы. Мелатонин был предложен в качестве лечения преэклампсии и задержки внутриутробного развития из-за его защитного антиоксидантного действия. В описанной в данной работе модели первичной ворсинчатой клетки цитотрофобласта мелатонин не оказывает влияния на клетки трофобласта в нормоксическом состоянии, но восстанавливает окислительно-восстановительный баланс клеток синцитиотрофобласта, нарушенный гипоксией/реоксигенацией. Таким образом, клетки ворсинчатого трофобласта человека в первичной культуре являются отличным подходом к изучению механизмов защитного действия мелатонина на функцию плаценты во время гипоксии/реоксигенации.

Введение

На протяжении всей человеческой беременности, плацентарные цитотрофобласта клетки, которые Мононуклеированные стволовые клетки, быстро пролиферируют и дифференцируются в или ворсинками или extravillous цитотрофобласта клеток. Extravillous cytotrophoblasts вторгнуться и реконструируют спиральные артерии стенки матки. Ворсинчатая cytotrophoblasts, с другой стороны, продолжают пролиферировать, дифференцироваться и сливаются в форме многоядерные syncytiotrophoblast (синцитии) 1. Содержание ворсинок трофобласта гомеостаза имеет важное значение для плода благополучия и здоровой беременности. На самом деле, ворсинчатые трофобласты позволяют обмен матери плоду кислорода и питательных веществ, а также произвести необходимые гормоны для беременности. Кроме того, syncytiotrophoblast является единственной типа клеток в прямом контакте с циркуляцией крови матери и обеспечивает существенную физическую и иммунологического барьера. Таким образом, syncytiotrophoblast должны подвергаться апоптозу и замену для поддержания гомеостаза и AVOID плацентарной патологии 2-5.

Методика , разработанная Kliman и др. , 6 в 1986 году выделить первичные ворсинчатых cytotrophoblasts из человеческих плацентами вызвало революцию в плацентарной исследований, позволяя изучение молекулярных механизмов , участвующих в ворсинок трофобласта дифференциации. Эта классическая методика, основанная на последовательных ферментативных варок с трипсина и ДНКазы, с последующим выделением в плотности центрифугирование среды (частицы коллоидного кремнезема покрыты поливинилпирролидона или Перколла) в настоящее время признается в качестве золотого стандарта для выделения ворсинчатых цитотрофобласта клеток. Этот метод может быть оптимизировано с помощью магнитной иммуноочистки, процедура, которая отделяет ворсинчатых cytotrophoblasts от не трофобласта клеток на основе дифференциальной экспрессии специфических антигенов на поверхности этих клеток. Мы выбрали человеческий лейкоцитарный антиген ABC (HLA-ABC) из-за отсутствия его экспрессии на клеточной трофобластическая мембранныхе 7,8.

Плацента является органом, который претерпевает значительные изменения в уровнях кислорода во время беременности. В первом триместре, отношение оксигенации является физиологически очень низкой (2% O 2) , но возрастает до умеренных уровней оксигенации (8% O 2) во втором и третьем триместре. Tuuli и др. 9 описано , что размножение в пробирке трофобласта среды внутри плацентарной ворсинок является проблемой и изменения в уровнях насыщения воды кислородом может даже привести к фенотипическим изменениям. Поэтому, предлагается принять 8% кислорода , как нормоксии , чтобы имитировать напряжение кислорода найденный в плацентарной ворсинок в третьем триместре беременности 8,9. Чен и др. 10 широко изучены несколько переменных , связанных с напряжением кислорода в культуре клеток трофобласта и продемонстрировали важность определения уровня кислорода в околоклеточном среде. Уровни кислорода в ворсинках имеют тенденцию к увеличениюиз-за васкулогенезе. Кровоток в плацентарных увеличивается ворсинок постоянно и уровень перекиси водорода (распространен по активные формы кислорода) является важным сигналом , который управляет васкулогенез 11,12. В осложнений во время беременности, отсутствие васкулогенезе порождает гипоксию, и что более важно, прерывистые вариации оксигенации (называемую гипоксию / реоксигенация). Эти условия приводят к ненормальному увеличению окислительного стресса, который ставит под угрозу плацентарного и жизнеспособности плода 13,14. Изменения , которые клетки трофобласта подвергаются в естественных условиях во время эпизодов гипоксии / реоксигенация может быть передразнил в пробирке следующим образом : ворсинчатые cytotrophoblasts поддерживаются при нормоксических условиях (8% O 2) , пока они не дифференцируются в syncytiotrophoblast. Они затем подвергаются гипоксических условиях (0,5% O 2) в течение 4 ч, а затем еще в течение 18 ч от нормоксии (реоксигенации). Используя эту гипоксия / реоксигенация подход, трофобласта ехHiBit дерегулированы окислительно - восстановительный статус и повышенные уровни внутреннего апоптоза 8, как было отмечено в некоторых осложнений во время беременности. Следовательно, это полезно в модели пробирке для оценки новых профилактических и терапевтических подходов для борьбы с осложнениями беременности , связанных с плацентарной гипоксия / реоксигенация.

Плацентарные клетки производят мелатонин, который имеет несколько важных функций, таких как способность устранени окислительного стресса и плацентарной дисфункции 15. Здесь мы приводим экспериментальные модели подход и клеточные , используемые для демонстрации защитных эффектов мелатонина в плацентарных клеток трофобласта на молекулярном, клеточном и функциональном уровне 8.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Плаценте были получены сразу после спонтанных вагинальных родов с неосложненной беременности на CHUM-St Luc-Hospital, Монреаль, Квебек, Канада, с информированного согласия и одобрения этических комитетов (CHUM-St-Luc больницы и INRS-Institut Armand-Frappier пациента, Лаваль, QC, Canada).

1. Выделение и очистка ворсинок цитотрофобласта клеток

  1. Решения и средства массовой информации
    1. Подготовка транспортной среды путем дополнения модифицированную Dilbecco орла Средний высокого уровня глюкозы (DMEM-HG) с 1% об / об антибиотиком (10000 единиц / мл пенициллина G, 100 мг / мл стрептомицина сульфата) и хранят при температуре 4 ° С.
    2. Подготовка первичной медиакультуру дополнив DMEM-HG с 10% об / об эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 25 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES), 1% об / об антибиотик (10000 единиц / мл пенициллина G, 100 мг / мл стрептомицина сульфата) и хранят при температуре 4 ° С. Теплые средства массовой информации до 37 ° C доиспользование.
    3. Приготовьте 4 л солевого раствора (0,9% вес / объем хлорида натрия).
    4. Готовят модифицированный Хэнка сбалансированный солевой раствор (HBSS) добавлением 25 мМ HEPES до 1х HBSS (рН 7,4).
    5. Подготовить свежие, четыре бутылки переваривания раствора с модифицированной HBSS (полученного в 1.1.4), сульфат магния (MgSO 4), хлорид кальция (CaCl 2), трипсин, дизоксирибонуклеаза IV (ДНКазы IV), и 1% объем / объем антибиотика ( 10000 единиц / мл пенициллина G, 100 мг / мл стрептомицина сульфата) , как показано в таблице 1.
    6. Приготовьте плотности Центрифугирование медиа градиент
      1. Приготовьте плотность центрифугирование раствора носителя путем дополнения плотности центрифугирование среды с 10% об / об HBSS 10x.
      2. Приготовьте 14 Пробирки с плотностью раствора центрифугирования медиа и модифицированного HBSS, как описано в таблице 2.
      3. Смешайте каждого решения плотности (этап 1.1.6.2) энергично, прежде чем добавлять его содержимое градиента. нежнодобавить растворов плотностью до 50 мл стекл центрифужные пробирки с помощью перистальтического насоса (1 мл / мин), начиная с самой высокой концентрации (70%). Избегайте капель путем слива растворов к стенке трубки, чтобы поддерживать надлежащее разделение каждого слоя градиента.
        1. При отсутствии перистальтического насоса, применять слои очень осторожно с пипетки Пастера.
    7. Подготовка окончательного рабочего буфера путем добавления к рабочим буфером (см таблицу материалов) с 2% об / об антибиотик / противогрибковым (10000 ед / мл пенициллина G, 100 мг / мл стрептомицина сульфата). Хранить при температуре 4 ° С.
  2. Ворсинок цитотрофобласта изоляция
    Примечание: Используйте стерильный хирургическое оборудование, изделия из стекла, пипеток, фляги и т.д.
    1. В день ворсинок изоляции цитотрофобласта, в C водяной бане при 37 °, согревать пищеварений решения (со стадии 1.1.5) и 70 мл ФБС. Примечание: Используйте 50 мл FBS, чтобы прервать варок и томуОставшиеся 20 мл на стадии замерзания (1.2.22), которые могут быть помещены на лед один раз размораживали.
    2. После родов, принесите плаценту в лабораторию в ледяном транспортной среде (со стадии 1.1.1) как можно быстрее (менее чем за 1 час).
    3. Отбросить транспортная среда и плацентарной крови в жидком помойку. Взвесьте плаценту и погружают в холодную солевом растворе.
    4. Измерять и анализировать следующие особенности: пупочной длина шнура; локализация пуповины; плацентарного длина, ширина, форма (овальная, дискоидная); Мембрана цвет; структура семядолей патологиях. Примечание: Данные приведены в разделе результатов.
    5. Перерезать пуповину , наряду со своей плацентарной вставки (т.е., на его базе с дополнительным 1 см радиус окружности вокруг шнура). Погружают в 300 мл раствора гистологического ткани закрепителя (формалина 10%) для последующего гистологического анализа.
    6. Вырезать всю плаценту на кубики 5 х 5 х 5 см. Тщательно промыть водой (4 раза х ~ 1 мин) в солевом золесоциологическое загрязнение (0,9%) для удаления клеток крови, пока физиологический раствор не станет прозрачным. Откажитесь промывочной жидкостью.
    7. В часовом стекле, удалите плацентарных мембран и тканей фарша для удаления кровеносных сосудов и обызвествления. Держите кровеносные сосуды крепко пинцетом и удалить тканей с использованием задней части Metzenbaum ножниц.
      1. Поместите рубленый плаценту в воронку Бюхнера. Полоскание с приблизительно 100 мл солевого буфера. Продолжить мясорубки до 30 - 35 г измельченной ткани не получают (используйте пластиковые взвешенную лодочку и масштаб). В случае необходимости, пропустить через мясорубку оставшуюся часть плаценты, чтобы получить до трех дополнительных 30 - 35 г препаратов. В это время, накройте измельченной ткани в взвешенную лодочку на льду.
        Примечание: Этот шаг займет около 45 мин до 1 ч.
    8. Добавьте 30 - 35 г рубленого плацентарной ткани в trypsinizing колбу. Передача 150 мл приготовленного раствора пищеварения 1 (таблица 1) в trypsinizing колбу и хорошо перемешать.
    9. Поместите trypsinizing колбу втрясущейся водяной бане в течение 30 мин со скоростью не более 50 циклов / мин и вручную смешать trypsinizing колбу каждые 5 мин для однородного пищеварения.
    10. В конце первого переваривания, удалите trypsinizing колбу из водяной бани и наклонить его (45 °) в течение 1 мин для осаждения плацентарной ткани. С помощью 10 мл стерильной пипетки, удалить и выбросить примерно 80 мл надосадочной жидкости. Избегайте аспирационных ткани.
    11. Передача 100 мл раствора 2 пищеварения (Таблица 1) в trypsinizing колбу; хорошо перемешать и повторить шаг 1.2.9.
    12. В конце второго переваривания, удалите trypsinizing колбу из водяной бани и наклонить его на 45 ° в течение 1 мин. С помощью 10 мл стерильной пипетки, удалить 80 мл надосадочной жидкости и осторожно переносят в центрифужную пробирку с сотовым сетчатого фильтра (меш 100 мкм). Перенести отфильтрованный супернатант в химический стакан, содержащий 2 мл ФБС каждый раз, когда центрифуга трубка заполнена.
    13. Выполнение третьего перевариванию, как описано длявторое пищеварение (1.2.11 и 1.2.12) с использованием 75 мл раствора переваривание 3. Параллельно, выполните шаги 1.2.15 к 1.2.16.1 для пищеварения 2.
    14. Выполнение четвертого переваривание точно в качестве третьего переваривания с использованием раствора переваривание 4 (75 мл), но собирают максимальное количество супернатанта. Выполните шаги 1.2.15 для 1.2.16.1 параллельно для переваривания 3, и, наконец, для пищеварения 4.
    15. Алиготе супернатант (от переваривания 2, 3 и 4) в 13,5 мл частей, каждая часть в одну центрифужную пробирку 15 мл. С длинной 22,8 см стекло пипетки Пастера, очень осторожно и медленно поместите 1,5 мл ФБС в нижней части каждой трубки, чтобы создать отдельный слой. Не следует смешивать FBS и супернатант. Центрифуга трубки без тормоза в течение 20 мин при 1250 х г при комнатной температуре.
      Примечание: После центрифугирования 4 -х слоев видимы в трубе, как показано на рисунке 1 Разделение трипсина и клеток трофобласта позволяет избежать чрезмерного клеточного пищеварения..
    16. С помощью вакуумного насоса, Aspirели и отбросить супернатант (переваривание раствор) и FBS слоев, в том числе беловатой пленки между двумя слоями. Ресуспендируют осадок (в трофобласта и красных слоев клеток крови) с 1 мл теплой среды для культивирования клеток (этап 1.1.2 программного обеспечения, без FBS и не HEPES).
      1. Собирают ресуспендировали клетки из всех трубок и объединить их в 1 трубе. Пусть труба не выдерживают при комнатной температуре до конца всех варок. Примечание: После всех варок, обычный выход 3 трубы ресуспендировали клеток (по одному на пищеварение).
    17. Составляют объем до 15 мл теплой среде для культивирования клеток. Центрифуга при 1250 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалить супернатант с помощью вакуумного насоса. Избегайте аспирационных гранул.
    18. Аккуратно ресуспендируют осадок, полученный из 3-х пробирки с 1 мл теплой среды для культивирования клеток. Бассейн их содержание в 1 тубы. Для получения 8 мл, полный объем теплой среде для культивирования клеток.
    19. Очень нежно слой клеточной суспензии на граде разделениянике, с помощью пипетки Пастера. Центрифуга без тормоза в течение 30 мин при 507 мкг при комнатной температуре.
    20. После центрифугирования идентифицировать различные слои клеток в градиенте с фоновой подсветки. Найдите слои, содержащие трофобласт и загрязняющие клетки от 40 - 50% от плотности среды центрифугирования. С помощью вакуумного насоса, удалить верхние слои (> 50%).
    21. Сбор клеток, расположенных в слоях, представляющих интерес с пипеткой Пастера и передавать их в центрифужную пробирку на 50 мл. Составляют объем до 50 мл клеточной культуральной среды. Центрифуга в течение 10 мин при 1250 х г при комнатной температуре.
    22. В стерильных условиях, отбросить супернатант, ресуспендируют осадок с помощью 20 мл ФБС и подсчитывают количество клеток с помощью гемоцитометра. На льду, добавляют 2,22 мл стерильного диметилсульфоксиде (ДМСО) и осторожно перемешать, переворачивая. Аликвоты 1,5 мл суспензии клеток в криогенных флаконах, замораживание в течение ночи при -80 ° С и переносят в баке жидкого азота.
    3. <литий> очистка трофобласта
    1. Установите промывку и эксплуатационные буферы и новый столбец фильтра на магнитном инструменте очистки в соответствии с инструкциями изготовителя. Выполните "чистую" программу, чтобы очистить отрицательные порты 1, положительный 1 и положительный 2, а затем ввести 50 мл пробирки по каждому порту в соответствии с инструкциями изготовителя.
    2. Оттепель клетки, которые были заморожены на стадии 1.2.22 быстро в C водяной бане при 37 °. Передача клеток в 50 мл пробирку и ресуспендируют клетки осторожно 20 мл холодного раствора. Проточном буфере Отцентрифугировать пробирку в течение 5 мин при 450 х г и 4 ° С.
    3. Удалите супернатант. Повторите шаг стирки с холодной проточной буфера. Граф клеток с помощью гемоцитометра для определения жизнеспособности. Повторите центрифугирования (в течение 5 мин, 450 мкг при 4 ° С). Осторожно удалите супернатант. Добавить 1 мл холодной проточной буфера , содержащего 1% об / об мышиных анти-HLA-ABC антител. Инкубируют при температуре 4 ° С в течение 30 мин, Миксинг нежно каждые 5 мин.
    4. Добавить 6 мл холодной проточной буфера. Центрифуга в течение 5 мин при 450 х г и 4 ° С. Удалите супернатант и повторите этот шаг. Ресуспендируют клеток в 1 мл холодной проточной буфера , содержащего 10% об / об анти-мышиных вторичными антителами связью магнитных шариков. Инкубируют при температуре 4 ° С в течение 15 мин, перемешивание осторожно каждые 5 мин.
    5. Добавить 6 мл холодной проточной буфера. Центрифуга в течение 5 мин при 450 х г и 4 ° С. Удалите супернатант и ресуспендируют в 5 мл холодной проточной буфера.
    6. Отдельные клетки трофобласта с помощью магнитного инструмента очистки. Собирают клетки в отрицательном порту и добавьте 20 мл холодной проточной буфера.
      Примечание: клетки трофобласта не содержат комплекс HLA-ABC, и, таким образом, отделены от других типов клеток, и направлен в сторону отрицательного 1 порта.
    7. Центрифуга в течение 5 мин при 450 х г и 4 ° С. Жидкость над осадком сливают и осторожно ресуспендирования клеток в 20 мл теплой первичной культуральной среды. Граф клеток USINга гемоцитометр для определения жизнеспособности.
    8. Пластина клетки на следующих плотностей: 0,15 х 10 6 клеток / лунку в 96-луночные планшеты, 1,6 х 10 6 клеток / лунку в 24-луночные планшеты и 4,5 х 10 6 клеток / лунку в 6-луночные планшеты. Инкубируйте пластин при 37 ° С и 5% CO 2.
    9. Подтверждение чистоты трофобласта клеток методом проточной цитометрии 16,17 и / или иммуноцитохимически 18.
      Примечание: Чистота иммунологически клеток определяли с использованием FITC-конъюгированных моноклональных антител против цитокератина-7 и виментина 17-19. Этот протокол также подробно описаны в Lanoix и др., 2008 7.
    10. После того, как по меньшей мере 4 ч, промыть клетки дважды теплой культуральной среды , чтобы удалить клетки неприкрепленные , а затем передать пластины в нормоксии камеру, которая состоит из 8% O 2 (см рисунок 2 и раздел 2).

2. In Vitro Inductioп нормоксии и гипоксия / реоксигенация

  1. Инкубатор операции камеры (рис 2A для настройки).
    1. В ламинарном потоке, поместите чашку Петри, содержащую стерильную воду на дно инкубатора камеры, чтобы избежать сухости; затем поместите предварительно подготовленные культуры клеток пластин или колб (этап 1.3.10) на улучшенных полок камеры.
    2. Вне капот, прикрепить камеру (входное отверстие) в газовый шланг (Рисунок 2А: 5а, б, в) , чтобы достичь трубки газа (8% O 2 , или 0,5% O 2) (рис 2А: 7). Откройте оба впускных и выпускных портов камеры. В этот момент, газовый регулятор (рис 2А: 4) должен оставаться закрытым.
    3. Осторожно откройте газовый регулятор клапана (рис 2A: 4). Промывка в течение 4 мин со скоростью потока воздуха 25 л / мин, чтобы полностью заменить воздух внутри камеры.
    4. После продувки камеры, закройте газовый регулятор, то входное отверстие и НУtlet порты камеры.
    5. Отсоедините выпускной шланг расходомер (фиг.2А: 5с) от впускного отверстия камеры и помещают в камеру в культуре клеток инкубаторе при температуре 37 ° С.
    6. Заменить воздух в настоящее время, присутствующий в виде пластин, колб и растворенное в культуральной среде путем заполнения камеры газом 1 часа после того, как шаг 2.1.3.
    7. Повторите шаги 2.1.1 2.1.6 для других газовых составов (например, 2% O 2 для первого триместра трофобласта культуры 9).
  2. Confirm процентное содержание кислорода (Фигура 2В-С)
    1. Подтверждения концентрации кислорода в среде для культивирования клеток (без клеток) внутри камеры, используют кислородный электрод, подключенный к адаптеру кислорода. Подключите электрод кислорода к вольтметру.
    2. Создание калибровочной кривой в том же растворе (то есть среда культуры клеток) путем воздействия на решение газов с известным содержанием кислорода (например, 0% и21% кислорода). После того, как показания стабилизируются для каждой концентрации, вводится электрод в среду в камере.
      Примечание: Принять все измерения на той же глубине , с тем , чтобы избежать какой - либо уклон в концентрации кислорода 10.
  3. Индукция нормоксии и гипоксией / реоксигенация в трофобласта.
    1. После добавления первичных клеток трофобласта в соответствующие колбы для культивирования клеток, тарелки или чашки Петри, выполнить процедуры по мере необходимости.
    2. Параллельно с этим , внутри камеры, подвергать клетки к желаемой газовой смеси , чтобы воспроизвести определенное условие каждые 24 ч (рисунок 3).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Выделение и иммуноочистки из ворсинок цитотрофобласта клеток из нормального срока плаценты , полученных при вагинальных родах дали 1 х 10 8 жизнеспособных клеток. Плацента весил 350 г, был 19 см в диаметре, 4 см высотой с дискообразной формой и прозрачной мембраны. Не обнаружено семядолей уродства. Пуповина была парацентральная локализацию и длину 56 см. Чистоту оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием виментин и Цитокератин-7 маркеров. Более 98% клеток были о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

У млекопитающих, развитие плода напрямую зависит от адекватной плацентарной функции. Истоки развития нарушений здоровья основаны на гипотезе о том , что причиной заболеваний проявляются позже в жизни может быть прослежено к раннему развитию и что плацента имеет механистической роль в программировании плода 30-32. Плацента является ключевым медиатором роста и развития плода: он регулирует передачу питательных веществ, защищает от вредных воздействий, а также имеет серьезные эндокринные функции. Разработка Klim...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Поддержано грантами от Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) (No 262011-2009) для CV и грантом March of Dimes Social and Behavioral Sciences Research (#12-FY12-179) для CV и JTS; студенческими стипендиями для LSF от Ministère de l'éducation, de l'Enseignement supérieurs et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Québec (FRQ)-Nature et technologies (NT) и Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS, в HC от Réseau Québécois en Reproduction-NSERC-CREATE, в AAHT от Канадских институтов исследований в области здравоохранения (CIHR) и FRQ-Santé, а также в JBP от NSERC; стипендией EMAS от Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientìfico e Tecnològico (CNPq) и Programme de bourses d'excellence pour étudiants étrangers MEESR-FRQNT.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Изогнутые ножницы МетценбаумаShandon9212хирургическое оборудование (изоляция клеток) (2 единицы)
Щипцы для осколков Fine 41/2 вFisherbrand13-812-42хирургическое оборудование (изоляция клеток) (2 единицы)
Ножницы 4,5 Str DissectionFisherbrand08-940хирургическое оборудование (изоляция клеток) (2 единицы)
Губка марлевая 10 см x 10 смCardinal Health
Продолговатая стеклянная форма для выпечкиPyrex1105397Стеклянная посуда (2,8 л)
Воронка BuchnerCoorstek Inc10-356E(диаметр 114 мм)
Часовое стекло pyrex9985100EMDСтеклянная посуда
Раствор формалина, нейтральный буферный, 10%Sigma-AldrichHT501128-4LГистологический тканевый фиксирующий раствор
Трипсинизирующие колбыWheaton355395Стеклянная посуда (1 шт.)
Одноразовые пробирки для культивированияKimble73750-13100Стеклянная посуда
Боросиликатное стекло Пастер Пипетка (22,8 см)FisherbrandK63B1367820CСтеклянная посуда
250 мл Стеклянные стаканыFisherbrandKFS14005250Стеклянная посуда
Стеклянные бутылки с крышкойFisherbrandKFS14395250Стеклянная посуда (8 шт.)
50 мл Corex Tube Corning8422-A(1 шт.)
15 мл Полистирольная центрифужная пробиркаCorning430791
50 мл Полистирольная центрифужная пробиркаCorning430829
10 мл Серологическая пипеткаCorning11415038
Клеточное сетчатое фильтр 100 μ m НейлоноваяCorning431752
абсорбирующая подкладкаScienceware1199918
500  мл Флаконы Верхний фильтрОроговевшиепоры: 0,22  &микро; м/мид и HBSS препарат
2 мл Криогенные флаконыCorning430488
Морозильный контейнер, Nalgene Mr. FrostySigma-AldrichC1562-1EA
Перистальтический насосАптека Fine ChemicalsP3 модель
Встряхивание водяной баниFisherМодель 127
Вакуумный насосABM4EKFS6CX-4
Хлорид натрияFisherbrandEC231-598-3 Физиологическийраствор 0,9%
Hank' s Буферизованный раствор соли (Hbss)Sigma-AldrichH2387Количество: 9.25 (один флакон) на 1 л раствора для сбраживания
Гидроксипиперазинеэтансульфоновая кислота (Hepes)Life Technologies15630-08025 мл (1 М) на 1 л раствора для сбраживания
Трипсин Тип ISigma-AldrichT80039,888 U
Дезоксирибонуклеаза Тип IVRoche10-104-159-001402,000 U
Хлорид кальцияSigma-AldrichC4901100 мМ
Сульфат магнияBaker2500-01800 мМ
Дульбекко s Модифицированный Eagle Medium High Glucose (DMEM)Life Technologies10564-045
Пенициллин/стрептомицин сульфатгиклонSV30010
фетальной сыворотке крупного рогатого скотаCorning35-010-CV
PercollSigma-AldrichP1644Плотность центрифугирования медиа. Объем: 36 мл
ИзопропанолAcros42383-001050 мл
ДиметилсульфоксидSigma-Aldrich472301
Магнитный сепаратор Automacs Miltenyi BiotecModel 003
Automacs  Колонки Miltenyi Biotec130-021-101
Автоматический рабочий буфер Miltenyi Biotec130-091-221http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1
Раствор для ополаскивания Automacs Miltenyi Biotec130-091-222http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx
Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32Affymetrix eBioscience14-9983-82Антитела к мышам Anti-mouse
Igg MicrobeadsMiltenyi Biotec130048401
многолуночный планшет -  6 лунок с КрышкаCorning3335Cell Bind surface
Многолуночная пластина -  24 лунки с крышкойCorning3337Cell Bind поверхность
многолуночной пластины -  96 лунок с крышкойCorning3300Cell Bind поверхность
модульной камеры инкубатора Биллапс-РотенбергМИК-101Набор из двух необходим для одновременной генерации условий нормоксии и гипоксии/реоксигенации
ОднорасходомерБиллапс-РотенбергSFM3001
50 мм Линейный фильтрВатман6721-5010ПТФЭ, поры: 1,0 & микро; m
Газовый регуляторPro StarPRS301233Комплект из двух необходим для одновременного создания условий нормоксии и гипоксии/реоксигенации
Газовый шланг класса Vi Clear 5/16 Parker100-050701023 шт. с ~ 0,5 м
17 мм Регулируемый хомут для газовогошланга СтяжкиTHCSS-16
Газовый баллон Normoxia PraxairNI CDOXR1U-KРазмер K (3rd триместровый состав: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2)
Газовый баллон Normoxia PraxairNI CDOXR1U-KРазмер K (3rd триместровый состав: 5% CO2, 0,5% O2, Bal. N2)
Кислородный микроэлектрод Mi-730Микроэлектроды INC84477
Кислородный адаптерМикроэлектроды INC3572
Реагент для обнаружения АФК: СМ-H2DCFDA InvitrogenC-400
 DRG internatinalEIA-4115
Anti-Vimentin очищенное антителоeBioscience14-9897Хозяин: мышиное
антитело к анти-цитокератину 7 (FITC)  Abcamab119697Хозяин: мышь
Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H& Антитело LLife TechnologiesA-11029
361020733 подкладка Набор для иммуноферментного анализа

Ссылки

  1. Vaillancourt, C., Lanoix, D., Le Bellego, F., Daoud, G., Lafond, J. Involvement of MAPK signalling in human villous trophoblast differentiation. Mini Rev Med Chem. 9 (8), 962-973 (2009).
  2. Gauster, M., Moser, G., Orendi, K., Huppertz, B. Factors involved in regulating trophoblast fusion: potential role in the development of preeclampsia. Placenta. 30, Suppl A 49-54 (2009).
  3. Huppertz, B., Kadyrov, M., Kingdom, J. C. Apoptosis and its role in the trophoblast. Am J Obstet Gynecol. 195 (1), 29-39 (2006).
  4. Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: the smart killer: the human trophoblast as a model. Mol Cell Endocrinol. 348 (1), 1-11 (2012).
  5. Huppertz, B., Frank, H. G., Reister, F., Kingdom, J., Korr, H., Kaufmann, P. Apoptosis cascade progresses during turnover of human trophoblast: analysis of villous cytotrophoblast and syncytial fragments in vitro. Lab Invest. 79 (12), 1687-1702 (1999).
  6. Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F., 3rd, Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
  7. Lanoix, D., Beghdadi, H., Lafond, J., Vaillancourt, C. Human placental trophoblasts synthesize melatonin and express its receptors. J Pineal Res. 45 (1), 50-60 (2008).
  8. Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: The watchdog of villous trophoblast homeostasis against hypoxia/reoxygenation-induced oxidative stress and apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 381 (1-2), 35-45 (2013).
  9. Tuuli, M. G., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Review: Oxygen and trophoblast biology--a source of controversy. Placenta. 32, Supple 2 109-118 (2011).
  10. Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Pericellular oxygen concentration of cultured primary human trophoblasts. Placenta. 34 (2), 106-109 (2013).
  11. Roberts, J. M., Hubel, C. A. Is oxidative stress the link in the two-stage model of pre-eclampsia. Lancet. 354 (9181), 788-789 (1999).
  12. Burton, G. J., Jauniaux, E. Oxidative stress. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 287-299 (2011).
  13. Ji, L., Brkic, J., Liu, M., Fu, G., Peng, C., Wang, Y. L. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Mol Aspects Med. 34 (5), 981-1023 (2013).
  14. Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental stress and pre-eclampsia: a revised view. Placenta. 30, Suppl A 38-42 (2009).
  15. Sagrillo-Fagundes, L., Soliman, A., Vaillancourt, C. Maternal and placental melatonin: actions and implication for successful pregnancies. Minerva Ginecol. 66 (3), 251-266 (2014).
  16. Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21 (7), 733-741 (2000).
  17. Potgens, A. J., Gaus, G., Frank, H. G., Kaufmann, P. Characterization of trophoblast cell isolations by a modified flow cytometry assay. Placenta. 22 (2-3), 251-255 (2001).
  18. Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol Med. 121, 203-217 (2006).
  19. Maldonado-Estrada, J., Menu, E., Roques, P., Barre-Sinoussi, F., Chaouat, G. Evaluation of Cytokeratin 7 as an accurate intracellular marker with which to assess the purity of human placental villous trophoblast cells by flow cytometry. J Immunol Methods. 286 (1-2), 21-34 (2004).
  20. Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol Biol. 550, 73-87 (2009).
  21. Mounier, C., Barbeau, B., Vaillancourt, C., Lafond, J. Endocrinology and cell signaling in human villous trophoblast. Methods Mol Biol. 550, 89-102 (2009).
  22. Chen, B., et al. Pomegranate juice and punicalagin attenuate oxidative stress and apoptosis in human placenta and in human placental trophoblasts. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (9), 1142-1152 (2012).
  23. Reti, N. G., et al. Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures. Cell Tissue Res. 328 (3), 607-616 (2007).
  24. Pidoux, G., et al. Biochemical characterization and modulation of LH/CG-receptor during human trophoblast differentiation. J Cell Physiol. 212 (1), 26-35 (2007).
  25. Pidoux, G., et al. ZO-1 is involved in trophoblastic cell differentiation in human placenta. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (6), 1517-1526 (2010).
  26. Williams, J. L., Fyfe, G. K., Sibley, C. P., Baker, P. N., Greenwood, S. L. K+ channel inhibition modulates the biochemical and morphological differentiation of human placental cytotrophoblast cells in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (4), 1204-1213 (2008).
  27. Schild, R. L., Schaiff, W. T., Carlson, M. G., Cronbach, E. J., Nelson, D. M., Sadovsky, Y. The activity of PPAR gamma in primary human trophoblasts is enhanced by oxidized lipids. J Clin Endocrinol Metab. 87 (3), 1105-1110 (2002).
  28. Menendez-Pelaez, A., Reiter, R. J. Distribution of melatonin in mammalian tissues: the relative importance of nuclear versus cytosolic localization. J Pineal Res. 15 (2), 59-69 (1993).
  29. Perrone, S., Stazzoni, G., Tataranno, M. L., Buonocore, G. New pharmacologic and therapeutic approaches for hypoxic-ischemic encephalopathy in the newborn. J Matern Fetal Neonatal Med. 25, Suppl 1 83-88 (2012).
  30. Nelissen, E. C., van Montfoort, A. P., Dumoulin, J. C., Evers, J. L. Epigenetics and the placenta. Hum Reprod Update. 17 (3), 397-417 (2011).
  31. Barker, D. J. Intrauterine programming of adult disease. Mol Med Today. 1 (9), 418-423 (1995).
  32. Barker, J. R., Thomas, C. F., Behan, M. Serotonergic projections from the caudal raphe nuclei to the hypoglossal nucleus in male and female rats. Respir Physiol Neurobiol. 165 (2-3), 175-184 (2009).
  33. Yui, J., et al. Functional, long-term cultures of human term trophoblasts purified by column-elimination of CD9 expressing cells. Placenta. 15 (3), 231-246 (1994).
  34. Kilani, R. T., Chang, L. J., Garcia-Lloret, M. I., Hemmings, D., Winkler-Lowen, B., Guilbert, L. J. Placental trophoblasts resist infection by multiple human immunodeficiency virus (HIV) type 1 variants even with cytomegalovirus coinfection but support HIV replication after provirus transfection. J Virol. 71 (9), 6359-6372 (1997).
  35. Knofler, M., Stenzel, M., Husslein, P. Shedding of tumour necrosis factor receptors from purified villous term trophoblasts and cytotrophoblastic BeWo cells. Hum Reprod. 13 (8), 2308-2316 (1998).
  36. Douglas, G. C., King, B. F. Isolation of pure villous cytotrophoblast from term human placenta using immunomagnetic microspheres. J Immunol Methods. 119 (2), 259-268 (1989).
  37. Li, L., Schust, D. J. Isolation, purification and in vitro differentiation of cytotrophoblast cells from human term placenta. Reprod Biol Endocrinol. 13, 71(2015).
  38. Stenqvist, A. C., et al. An efficient optimized method for isolation of villous trophoblast cells from human early pregnancy placenta suitable for functional and molecular studies. Am J Reprod Immunol. 60 (1), 33-42 (2008).
  39. Potgens, A. J., Kataoka, H., Ferstl, S., Frank, H. G., Kaufmann, P. A positive immunoselection method to isolate villous cytotrophoblast cells from first trimester and term placenta to high purity. Placenta. 24 (4), 412-423 (2003).
  40. Lanoix, D., Vaillancourt, C. Cell culture media formulation and supplementation affect villous trophoblast HCG release. Placenta. 31 (6), 558-559 (2010).
  41. Vaillancourt, C., Lafond, J. Human embryogenesis: overview. Methods Mol Biol. 550, 3-7 (2009).
  42. Armant, D. R., et al. Human trophoblast survival at low oxygen concentrations requires metalloproteinase-mediated shedding of heparin-binding EGF-like growth factor. Development. 133 (4), 751-759 (2006).
  43. McCaig, D., Lyall, F. Hypoxia upregulates GCM1 in human placenta explants. Hypertens Pregnancy. 28 (4), 457-472 (2009).
  44. Burton, G. J., et al. Optimising sample collection for placental research. Placenta. 35 (1), 9-22 (2014).
  45. Lanoix, D., et al. Quantitative PCR pitfalls: the case of the human placenta. Mol Biotechnol. 52 (3), 234-243 (2012).
  46. Bilban, M., et al. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31 (11), 989-996 (2010).
  47. Novakovic, B., et al. Wide-ranging DNA methylation differences of primary trophoblast cell populations and derived cell lines: implications and opportunities for understanding trophoblast function. Mol Hum Reprod. 17 (6), 344-353 (2011).
  48. Burleigh, D. W., et al. Microarray analysis of BeWo and JEG3 trophoblast cell lines: identification of differentially expressed transcripts. Placenta. 28 (5-6), 383-389 (2007).
  49. Hung, T. H., Skepper, J. N., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J. Hypoxia-reoxygenation: a potent inducer of apoptotic changes in the human placenta and possible etiological factor in preeclampsia. Circ Res. 90 (12), 1274-1281 (2002).
  50. Heazell, A. E., Moll, S. J., Jones, C. J., Baker, P. N., Crocker, I. P. Formation of syncytial knots is increased by hyperoxia, hypoxia and reactive oxygen species. Placenta. 28, Suppl A 33-40 (2007).
  51. Heazell, A. E., Lacey, H. A., Jones, C. J., Huppertz, B., Baker, P. N., Crocker, I. P. Effects of oxygen on cell turnover and expression of regulators of apoptosis in human placental trophoblast. Placenta. 29 (2), 175-186 (2008).
  52. Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Hypoxia induces autophagy in primary human trophoblasts. Endocrinology. 153 (10), 4946-4954 (2012).
  53. Lanoix, D., Guerin, P., Vaillancourt, C. Placental melatonin production and melatonin receptor expression are altered in preeclampsia: new insights into the role of this hormone in pregnancy. J Pineal Res. 53 (4), 417-425 (2012).
  54. Galano, A., Tan, D. X., Reiter, R. J. Melatonin as a natural ally against oxidative stress: a physicochemical examination. J Pineal Res. 51 (1), 1-16 (2011).
  55. Alers, N. O., Jenkin, G., Miller, S. L., Wallace, E. M. Antenatal melatonin as an antioxidant in human pregnancies complicated by fetal growth restriction--a phase I pilot clinical trial: study protocol. BMJ Open. 3 (12), 004141(2013).
  56. Hobson, S. R., Lim, R., Gardiner, E. E., Alers, N. O., Wallace, E. M. Phase I pilot clinical trial of antenatal maternally administered melatonin to decrease the level of oxidative stress in human pregnancies affected by pre-eclampsia (PAMPR): study protocol. BMJ Open. 3 (9), 003788(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Человек Первичная трофобласта клеточной культуры модель для изучения защитных эффектов мелатонина Против Гипоксия / реоксигенация-индуцированное Срыв
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.