Роман Поведенческий Анализ по расследованию вкусовой ответов отдельных, свободно движущихся шмелей ( Шмель земляной)

Завод-опылителей взаимодействия являются сложными. Опылители посетить цветы, чтобы получить нектар и пыльцу в пищу; в свою очередь, опылители облегчают половое размножение у растений. В то время как эти отношения в основном мутуалистических, цветочный нектар и пыльца иногда содержат токсины или другие растительные соединения ^1-5 которые могут нанести вред опылителей. Экологическое обоснование присутствия таких соединений в нектара и пыльцы не ясно, во всех условиях. Один выдающийся вопрос в этой области, как опылители, такие как пчелы могут обнаружить и избежать цветки нектара, содержащих токсины.

В шмели видов пчел, шмель земляной (Linnaeus, 1758), является универсалом опылителей , который посещает цветы многих видов растений , включая тех , кто производит нектара , содержащего токсины ^6. Шмелей было показано , что во избежание потребления растворов , содержащих высокие концентрации токсинов в 24 ч два выбора анализа ^7. Этот анализпотребления продуктов питания , описанной Tiedeken и др. ⁷ показали , что пчелы могут обнаружить горькие соединения в растворах. Тем не менее, этот анализ не смог отличить вкус от пост-ingestive процессов , таких как общее недомогание , которые также могут влиять на пищевое поведение в течение этого интервала времени ^8-10.

Пчелы обладают вкусовыми сенсиллы на их усиков, ротовые и лапок для обнаружения соединений ^11-13. Расширение хоботок рефлекс (PER) эксперименты включают сдерживая отдельных пчел в жгуте , а затем стимулируя усиков сенсиллы пчелы производить кормление рефлекс ^14-17. Пчелы могут быть ограничены в отдельных жгутов и затем стимулировали производить рефлекс кормления как тест их способности вкус соединения ^18,19. Другие изменили анализ PER для изучения чувствительности антенны или ротовых токсинов ^9,20. Тем не менее, пчелы подвергаются стрессу во время обуздывать. Это может повлиять какони реагируют на соединения ^21.

Здесь новый анализ описан для оценки поведенческой реакции вкуса свободно движущихся шмелей сахарозы и хинин, алкалоид , который ранее сообщалось, что сдерживающим фактором ⁹ и токсичным ¹⁰ для медоносных пчел (Apis MELLIFERA) и шмели (Bombus стелющиеся) ^{7, 22.} Хотя хинин не был найден в растительном нектара, этот алкалоид часто используется в качестве аверсивного стимула в поведенческих и физиологических исследований у пчел ^{7,9,12,13,22.} Способ включает видеозапись ротовые шмелей "на большой размер во время первоначального хобота контакта с испытуемыми растворами. В частности, тонкая структура ответа подачи проверяется непрерывно забив поведение над интервалом в 2 мин. Объем раствора потребляются измеряется в течение периода кормления и поэтому количество съеденной пищи может быть соотнесена с микроструктуройПищевое поведение. Кроме того скорость хоботной втягивания измеряется, как показатель активного избегания, и поэтому заранее ingestive обнаружения.

1. Захват Пчелы из колонии и голоданием период

Примечание: Эксперименты , описанные здесь , были проведены в Университете Ньюкасла, Великобритания с шмель земляной Audax. Несколько (2-3) коммерчески приобретены колонии были использованы на курс лечения. Колонии были сохранены на скамейке в лабораторных условиях (25 ± 2 ° С и 28 ± 2% RH) в постоянной темноте и кормили мед пчелы собирают пыльцу и растворы сахара вволю.

1. Сбор отдельных рабочих шмелей с помощью пластикового флакона (7 см длиной, 2,8 см внутренний диаметр) с перфорированной пластиковой пробкой, после того, как открыли ворота в колонию только достаточно долго для одной пчелы, чтобы выйти и оказаться в ловушке.
2. До начала эксперимента, по отдельности голодать все шмелей в течение 2-4 ч в пластиковых флаконах и хранить при комнатной температуре в полной темноте.

2. Перенос Пчелы в холдинг трубы и Habituation Фаза

1. После периода голодания, передачи шмель непосредственно из пластикового флакона в накопительную трубку. Удерживающая трубка представляет собой модифицированный 15 мл центрифужные пробирки (длина: 119 мм; диаметр 17 мм), с 4-мм отверстие, просверленное на наконечнике и кусок стальной сетки (основание: 8 мм, высота 30 мм), закрепленный внутри плавлением пластик трубки с рассечения стальной иглой с подогревом.
2. Закрепите крепежную трубу, содержащую шмель на держателе полистирола с зубной воск. Закрепить два куска картона с обеих сторон удерживающей трубы. Это, чтобы защитить пчел от зрительных стимулов, которые могли бы помешать с экспериментом.
3. Установите цифровой микроскопическую камеру на 5 см выше кончика трубки и удерживающей подключить камеру к совместимому ноутбук.
4. Отрегулировать удерживающее трубу таким образом, чтобы по крайней мере, первые 18 мм жала поддерживающа труба находится в пределах видеокадра. До начала эксперимента, начать 3 мин периода привыкания.

3.Предварительное испытание фазы: Представление капля Сахароза

1. Подключение шприц к охватывающему адаптер, содержащий капельку раствора сахарозы (~ 3,5 мкл, 500 мМ сахарозы, растворенного в деионизированной воде). Представить сахарозу внутри наконечника трубки холдинг, чтобы мотивировать расширение хоботка.
2. Дайте шмель до 5 мин, чтобы потреблять капельку сахарозы. Если капелька не потребляется, удалите шмель из эксперимента.
3. Начните запись видео после периода привыкания. В этом исследовании, активность хоботок был записан в 26,7 кадров / сек ^-1 с увеличением скорости 25X.

4. Тестовая фаза: Представление испытуемый раствор

1. Заполните 100 мкл микрокапиллярной трубку с испытуемым раствором. Подключите его к куску силиконовой трубки (длиной 6 см, 1 мм внутренний диаметр) и закрепить его на микро-манипулятором.
   1. Подключите трубку к другой силиконовой трубки через штырем (6 см длиной, 4 мм внутренний диаметр), бееч действует как пипетка лампочки.
   2. Поместите микрокапиллярных трубки 5-10 мм от кончика трубки холдинга. Слегка сожмите трубки для поддержания питательного раствора на кончик микрокапиллярной трубки.
2. После того, как шмель потребляет капельку сахарозы, немедленно удалите шприц, содержащий раствор 500 мМ сахарозы.
3. Начало фазы тест 2 мин, когда шмель в Хоботковых контакты раствора внутри микрокапиллярной трубки.
   1. Для контроля возможного испарения, заполнить два дополнительных микрокапиллярной трубы с сахарозой или водой и манипулировать ею точно так, как во время фазы тестирования.
4. До и после каждого испытания сканирования уровни жидкости внутри микрокапиллярной трубки с помощью сканера на 600 точек на дюйм для измерения количества потребляемой пищи (фиг.4А).

5. Анализ изображений

1. Определить объем потребления раствора с использованием ImageJ (версия 1.48), изображение Procэссинга программного обеспечения.
   1. Загрузить файл изображения и увеличивать или уменьшать масштаб изображения (~ 400%). Для того, чтобы установить базовый масштаб, выберите инструмент прямой линии и провести линию между двумя концами микрокапиллярной трубки. Выберите 'Анализ', затем 'Set Scale'. Ввод общая длина трубы под «Известное расстояние» и соответствующего блока в разделе "Единицы длины".
   2. Выберите инструмент прямой линии снова и проведите линию между двумя концами уровня жидкости. Выберите "Анализ", затем "Мера". В окне результатов длина жидкости дается в столбце "Длина".
2. Рассчитать объем потребления раствора, используя формулу:
   
   где это длина микрокапиллярной трубки и а также

6. Видео Анализы

1. Оценка поведения кормления во время фазы тестирования 2 мин каждого видео с использованием программного обеспечения ведения журнала событий (см Материалы таблицу).
   1. Во - первых, определять поведение кормления (т.е. элементов.) В меню поведенческих классов программного обеспечения для записи. Поведение кормления, как следует: (1) хоботок из / контакт: хоботок продолжается и находится в контакте с раствором внутри микрокапиллярной трубки (2) не хоботка из / нет контакта: хоботок расширяется и не находится в контакте с раствором внутри микрокапиллярной трубки, (3) хоботок уложен: хоботок не продлен, но вместо того, чтобы укладываться под головкой и (4) из виду: шмель находится вне видеокадра.
   2. Установите для каждого поведениякак «государство» и «взаимоисключающие» в меню свойств и сделать непрерывные записи для интервала 2 мин. Повторное воспроизведение видео в режиме замедленного воспроизведения (2 раза медленнее) для большей точности.
2. Измерьте скорость хобота отводом от исследуемого раствора после первого контакта между двумя последовательными кадрами (разделенных 37.5 мс в видеозаписях , показанных здесь) с использованием программного обеспечения отслеживания видео движения (См Материалы таблицу).
   1. Загрузить видео файл и перейдите к кадру, где хобот первые контакты решения.
   2. Для того, чтобы установить базовый масштаб, выберите инструмент линии и нарисуйте линию по ширине микрокапиллярной трубки в видеокадра. Щелкните правой кнопкой мыши на строке и выберите "Калибруйте меру". Ввод ширины капиллярной трубки и соответствующий блок.
   3. Выберите 'Image', а затем 'системы координат'. В новом окне нажмите на кончик хоботка и выберите9 Применить ".
   4. Выберите ручной инструмент перемещения, кликните правой кнопкой мыши на кончик хобота на видеокадра и выберите "Дорожки". Переход к следующему кадру и скорректировать точку отслеживания до кончика хобота.
3. Щелкните правой кнопкой мыши на точке отслеживания и выберите "Конфигурация". Выбрать 'Полный путь' и выберите 'Скорость' при измерении. Выберите "Применить". Затем отображается скорость.

Новый анализ используется для проверки ответов скармливания 1 М сахарозы, 1 М раствора сахарозы, плюс 1 мМ хинина и только деионизированной водой. Непосредственные реакции кормления каждой обработки определяются путем количественного определения длительности хоботка контактов с испытуемым раствором, частота схваток подачи и скорости хоботка втягивания от исследуемого раствора после первого контакта во время тестовой фазы 2 мин. Объем раствора, потребленный также измеряется после того, как на стадии испытаний. В данном исследовании мы выбрали критерий бой интервал 5 сек (Рисунок 1 см Дополнительный файл) на основе предыдущей работы французского и др. 25 , которые использовали порог в 5 сек , чтобы охарактеризовать поведение хоботок втягивания путем дрозофилы в ответ на сдерживающий фактор соединения 25. Таким образом, мы определили подающее бой как контакт между выдвинутым хоботком и решения нетт прерванный отсутствие контактов 5 сек или более.

По сравнению с сахарозой и только деионизованной воды, добавляя хинин в раствор сахарозы , очевидно , отпугивает кормление шмелей , как они будут быстро отодвигаться , если они обнаруживают отталкивающее вещество (Видео Рисунок 1).

В этом эксперименте лечение оказывают значительное влияние на совокупной длительности хоботка контактов во время тестовой фазы (ANOVA по данным журнала-трансформированных, F 2,31 = 41, р <0,001). Совокупная продолжительность времени контакта с сахарозой , содержащей хинина значительно снижается по сравнению с сахарозой в покое (р <0,001) , но не к деионизированной воде в одиночку (р = 0,219) (рисунок 2). Кроме того, лечение оказывают значительное влияние на кумулятивной продолжительности кормления приступами (ANOVA на бревне трансформированных данных, F р <0,001, рис 3А). Совокупное продолжительность кормления приступами с сахарозой, содержащей хинина значительно снижается по сравнению с сахарозой в покое (р <0,001), но не в сравнении с только деионизованной водой (р = 0,41). Лечение также имеют значительное влияние на частоту кормления приступами (Пуассона GLM с функцией связи журнала, изменения в девиации по сравнению с распределением с 2: р <0,050), в результате чего количество схваток с сахарозой , содержащей хинин значительно выше в сравнение с сахарозой (р <0,01) , но незначительно значительно отличается от обработки деионизированной воды (р = 0,055, из - за одного шмель отображения семь питающих поединки на воде, рис 3б). Аналогично, скорость хоботковом втягивания значительно отличается между обработками (дисперсионный анализ по данным в логарифмические, F 2,31 = 5,12, р <0,050). Шмелей втягивать прoboscis от испытуемого раствора значительно быстрее после первого контакта с сахарозой , содержащей хинин , чем с сахарозой или только деионизованной водой (р <0,050, рис 3C). Эти результаты свидетельствуют о том, что хинин вызывает активное поведение избегания у шмелей. Лечение также оказывают значительное влияние на общий объем раствора , потребленной (дисперсионный анализ по данным в логарифмические, F 2,32 = 62,5, р <0,001), в результате чего потребление сахарозы , содержащего хинин уменьшается по сравнению с сахарозой (р <0,001) , но не к деионизированной воде (р = 0,457) (рис 4б). Объем раствора выпаривают из капилляра в течение испытательного периода незначительна. В лабораторных условиях (25 ± 2 ° C и 28 ± 2% RH), испарение изменяется от 0,033 до 0,883 мкл, в среднем 0,276 мкл и 0,171 мкл для деионизованной воды и 1 М сахарозы соответственно.

C 2: р = 0,450). Отсутствие эффекта от лечения не обнаружено на латентности между первым усиков контактами и испытуемый раствор и первых контактов хобота (медиана: 2,67 сек для сахарозы, 1,10 сек сахарозы плюс хинин; 0,80 сек для деионизованной воды, дисперсионный анализ на логарифмирована данные, F 2,13 = 0,620, р = 0,550). Кроме того, процент шмелями, простирающихся хобот по вкусу испытуемый раствор остается постоянным во обработок (сахарозы: 66,7%, сахарозы плюс хинин: 50.0%; деионизованной воды: 52,2%; биномиальное GLM, изменение в девиации по сравнению с распределением C 2: р = 0,840). Вместе эти результаты свидетельствуют о том, что усики играют незначительную роль в обнаружении токсинов в этом анализе.

Отдельный эксперимент проверяет, является ли это необходимо испытать пчел в течение периода времени, большего, чем за 2 мин. Количество пищи, потребляемой пчелами тестируется с 1 М сахарозы или 1 мМ хинина в 1 М растворах сахарозы в двух состояниях: в течение испытательного 2 мин и испытательного периода 10 мин. Для обоих методов лечения, общее потребление пищи не отличается для тестовых периодов , и каких - либо существенных взаимодействий не происходят между периода испытаний и обработки (N = 6 - 13, дисперсионный анализ на бревне преобразованных данных; Влияние лечения: F = 1,31 54,8, р <0,001; влияние испытательного периода: F 1,31 = 0, р = 0,979; эффект взаимодействия: F = 0,1, р = 0,457). В резюме,2 мин испытательный период достаточен, чтобы оценить влияние раствора на общую сумму потребляемой пищи шмелями и сдерживающего воздействия токсичных веществ, отпугивающих или в этом анализе. Таким образом, путем измерения потребления пищи и опробование пищевого поведения, можно соотнести общее потребление пищи в тонкой структуре кормления во время теста.

Рисунок 1: Задержка периоды между хоботком Контакты в течение первых 2 мин после кормления Пробирной плотности участков периодов времени ожидания , отделяющими каждый хоботка контакт с раствором сахарозы в 1 М раствор хинина 1 М сахарозы + 1 мМ и вода.. Совокупные данные из 13, 10 и 11 пчел представлены соответственно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этого рисунка. </ Р>

Рисунок 2: хоботком Контакт Durations в течение первых 2 мин после кормления Пробирной плотности участков хобота контактных длительностей шмелями , питающихся 1 М сахарозы, 1 М сахарозы + 1 мМ хинина или воды.. Размер выборки как показано на рисунке 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Хобот активность шмелей Кормление 1 М сахарозу, 1 М сахарозе + 1 мМ хинин или воды (A) кумулятивная продолжительность кормления приступами во время тестовой фазы (В) частотой кормления приступами и (С) скорости. хобота ретяги после первого контакта. Маркировочного указывает на существенное различие: лечение с различными буквами указывают на р <0,05. Box участки представляют собой медиану (черные полосы), самый низкий и самый высокий точек данных по-прежнему в пределах 1,5 диапазона межквартильного (пунктир) и останцы (кружки). Размер выборки как показано на рисунке 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рис . 4: Хинин подавляет кормления шмелей (А) Отсканированные образы микрокапиллярных трубок , показывающих уровень 1 М сахарозы или 1 М сахарозы плюс 1 мМ раствор хинина (обозначенный черной линией) до и после фазы тестирования соответственно. (В) Потребление 1 М сахарозы, 1 М сахарозы плюс 1 мМ хинин или деионизированная вода в одиночку с помощью шмелей после фазы тестирования. Маркировочного указывает на существенное различие: лечение с различными буквами указывают на р <0,001. Box участки представляют собой медиану (черные полосы), самый низкий и самый высокий точек данных по-прежнему в пределах 1,5 диапазона межквартильного (пунктир) и останцы (кружки). Размер выборки как показано на рисунке 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Видео Рисунок 1: Видео Записи хобота по направлению деятельности (А) 1 М сахарозе , (B) 1 М сахарозу плюс 1 мМ хинин и (С)d / 54233 / Video_figure_1C_Water.m4v "целевых =" _blank "> Деионизированная вода во время фазы испытаний.

Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.