Представлен протокол для клеточной культуры макрофагальных колониестимулирующих факторов (M-CSF) дифференцированных моноцитарных макрофагов человека. В протоколе используется криоконсервация моноцитов в сочетании с их объемной дифференцировкой в макрофаги. Затем собранные макрофаги могут быть высажены в культуральные лунки с необходимой плотностью клеток для проведения экспериментов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Культура макрофагальный колониестимулирующий фактор Дифференцированный человеческого моноцитов макрофаги
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Представлен протокол для клеточной культуры макрофагальных колониестимулирующих факторов (M-CSF) дифференцированных моноцитарных макрофагов человека. Для начала экспериментов свежие или замороженные моноциты культивируют в колбах в течение 1 недели с М-КСФ, чтобы индуцировать их дифференцировку в макрофаги. Затем макрофаги могут быть собраны и высажены в культуральные лунки при необходимой плотности клеток для проведения экспериментов. Использование определенного числа макрофагов, а не определенного числа моноцитов для инициации макрофагальных культур для экспериментов, дает макрофагальные культуры, в которых желаемая плотность клеток может быть достигнута более последовательно. Использование криоконсервированных моноцитов снижает зависимость от доступности доноров и позволяет получать более однородные макрофагальные культуры.
Введение
Изучение культивируемых макрофагов является полезной моделью для понимания функции этих клеток при воспалении, подобном тому, которое происходит при атеросклеротических бляшках. Когда исследования сосредоточены на заболеваниях человека, связанных с макрофагами, полезно изучать первичные человеческие макрофаги, а не нечеловеческие макрофаги, чтобы избежать видовых различий. Кроме того, эффектов клеточной трансформации можно избежать, используя первичные макрофаги, а не клеточные линии макрофагов. Для этого в качестве средства получения первичных макрофагов человека служат макрофаги, дифференцированные из моноцитов, выделенных из крови человека.
Тканевые макрофаги могут быть либо резидентными в тканях, либо могут быть получены из моноцитов, которые мигрируют в ткань и дифференцируются в макрофаги 1. Были определены два типа моноцитарных макрофагов человека, которые различаются не только по морфологии, но и по экспрессии генов и функции клеток. Эти два типа получают из моноцитов, которые дифференцируются в макрофаги в присутствии M-CSF + фетальная бычья сыворотка (FBS) и моноцитов, которые дифференцируются в макрофаги в присутствии гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) + FBS 2-6. По нашему опыту (неопубликованному наблюдению), использование сыворотки крови человека, а не FBS, генерирует тип GM-CSF независимо от того, включен ли M-CSF или GM-CSF в среду для дифференцировки. Макрофаги типа M-CSF имеют тенденцию быть более удлиненными, чем макрофаги типа GM-CSF, которые по своей морфологии напоминают яичницу. Исследователи должны признать, что моноцитарные макрофаги человека M-CSF и GM-CSF не являются тем же самым, что так называемые макрофаги, полученные из костного мозга мышей M1 и M2 6.
Во время исследований с использованием дифференцированных макрофагов M-CSF, полученных из моноцитов человека, мы столкнулись с трудностями, связанными с доступностью моноцитов для проведения экспериментов и изменением полученных клеточных плотностей макрофагов во время дифференцировки моноцитов в макрофаги. Чтобы преодолеть эти проблемы, мы разработали следующий протокол, в соответствии с которым моноциты замораживаются до тех пор, пока они не потребуются для использования, а моноциты дифференцируются в больших количествах в макрофаги, которые затем могут быть извлечены из колб для культур и покрыты при желаемой плотности клеток для получения более однородных культур от эксперимента к эксперименту.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Лейкаферез был проведен в соответствии с протоколом исследования человеческого субъекта, одобренного Национальным институтом здравоохранения совета организационного обзора.
1. Выделение и криоконсервации моноцитов
- Получение мононуклеарных клеток путем лейкаферезом человеческих доноров, и обогащают моноциты путем непрерывного противотока центрифугирование отмучивани мононуклеарных клеток , как описано в ссылках 7,8. Получают примерно 100 х 10 6 клеток отмученного (приблизительно 80 - 90% моноциты) в буфере сепарации , указанного изготовителем. Граф клеток с использованием гемоцитометра.
- Центрифуга моноциты в 15 мл полипропиленовую трубку при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Удалить супернатант и осторожно ресуспендируют клетки в FBS с последующим диметилсульфоксида для достижения конечной концентрации 90% FBS / 10% диметилсульфоксиде и 50 х 10 6 клеток / мл.
- Добавьте каждый мл суспензии клеток то индивидуальной криопробирку.
- Поместите криопробирки в контейнере морозильную клеток и перенести в -80 ° C морозильнике в течение 24 ч перед переносом в охлаждаемой жидким азотом криопробирку резервуар для хранения для длительного хранения.
2. Дифференциация моноцитов в макрофаги
- Растаяйте криопробирку клеток путем быстрого перехода на C водяной бане при 37 °, а затем сразу же удаление, когда суспензию клеток оттаивает около 70%.
- Сразу же после полного оттаивания при комнатной температуре, передача 1 мл криопробирку содержимое в 50 мл 37 ° C нагретый институт Roswell Park Memorial (RPMI) 1640 с 2 мМ L-глутамина, 50 нг / мл M-CSF, 25 нг / мл интерлейкин-10 (ИЛ-10), и 10% FBS (полная среда).
- Перенесите 25 мл моноцитов суспензии в каждый из двух 75 см 2 пластиковых колбах для культивирования клеток.
- Инкубируйте культур в культуре клеток С - инкубаторе 37 ° с 5% CO 2/95% воздуха в течение 48 часов.
- Ополосните у.е.ltures 3 раза с помощью 10 мл среды RPMI 1640 (предварительно нагретом до 37 ° С), осторожно удаления культуральной среды, чтобы избежать каких-либо выбивании слабо прикрепленные клетки.
- После ополаскивания добавьте свежую полную среду, изменяя среду каждые 2 дня до тех пор, пока моноциты дифференцируются и пролиферируют в достаточной степени, чтобы стать вырожденная. Для этого требуется около одной недели культуры.
3. Сбор Макрофаги инициировать эксперименты
- Промыть дифференцированные макрофаги в колбу 3 раза с помощью 10 мл подогретого фосфатно-буферном солевом растворе 37 ° C В Дульбекко без Са 2+ и Mg 2+ , перед добавлением 10 мл подогретого 37 ° С 0,25% раствора трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).
- Поместите колбу в культуре клеток инкубаторе в течение 10 - 15 минут, после чего примерно 90% макрофагов, должны иметь закругленные и отсоединяются. Проверьте это микроскопическое исследование колбы.
- Добавьте 10 мл RMPI 1640, содержащей 10% FBS до sсверху трипсинизации.
- Перенести макрофагальной клеточной суспензии из колбы в 50 мл полипропиленовую пробирку, центрифуга 300 мкг в течение 5 мин, и отбросить супернатант.
- Аккуратно ресуспендирования макрофаги в 1 мл полной среды.
- Смешайте 10 мкл макрофагальной клеточной суспензии с 10 мкл раствора трипанового синего и определяют количество клеток макрофагальной и жизнеспособность (обычно> 95%) с помощью гемоцитометра.
- На основе числа клеток (обычно около 15 - 18 х 10 5 макрофаги), добавить дополнительную полную среду для достижения желаемой плотности высева клеток. Примечание: 1 х 10 5 макрофаги в 1,5 мл среды на лунку 12-луночного планшета , будет производить около-сливающийся культуры.
- После засева, инкубировать макрофаги в течение ночи в 37 ° C для культивирования клеток инкубаторе с 5% CO 2/95% воздуха , чтобы позволить прикрепление клеток. Затем начинают требующихся экспериментов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Жизнеспособность свежих или криосохранены моноцитов было больше , чем 95% , как определено с окрашивания трипановым синим 9. На рисунке 1 и 2 сравнить при более низких и более высоких увеличениях, соответственно, прогресс свежих и криоконсервированных (т.е. замороженные) моноцитов дифференциации в макрофаги. Обратите внимание, что свежий по сравнению с криоконсервированных моноциты демонстрируют субпо...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Создание определенных типов макрофаги могут прояснить некоторые противоречивые результаты, полученные исследователями при изучении биологии макрофагами. Использование различных условий культивирования и дифференциации факторов для формирования первичных макрофагах человека может привести к очень разным типам макрофагами, а тот факт, что не может быть оценена исследователем. Например, макрофаги иногда генерируются из человеческих моноцитов, не используя сыворотки, по отдельности человеческая сыворотка, сыворотка крови че...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Отделение трансфузионной медицины, Клинический центр, Национальные институты здоровья, предоставило элютриированные моноциты. Эта работа была поддержана Программой внутренних исследований, Национальным институтом сердца, легких и крови, Национальными институтами здравоохранения.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Cellbind 12-луночный культуральный планшет | Corning | 3336 | |
| CELLSTAR, колба T-75, тканевая культура обработана | Greiner Bio-One North America | 658157 | |
| RPMI 1640 питательная среда | Cellgro Mediatech | 15-040-CM | подогретая до 37 градусов; C |
| L-глютамин | Cellgro Mediatech | 25-005-CI | |
| Фетальная бычья сыворотка | Gibco | 16000-036 | |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cryovial | Термо Научный | ||
| DPBS без Ca2+ и Mg2+ | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0,25% трипсин-ЭДТА | Gibco | 25200-056 | |
| 50 мл полипропиленовая коническая трубка | Falcon | 352070 | |
| Trypan Blue | Lonza | 17-942E | |
| Neubauer-улучшенный ярко-световой гемоцитометр | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 610031 | http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html |
| CoolCell LX для заморозки клеток контейнер | BioCision | BCS-405 | другие морозильные контейнеры также должны быть адекватными для этого этапа |
| Система хранения жидкого азота, CryoPlus 1 | Thermo Scientific | 7400 | любой бак с жидким азотом должен быть адекватным |
Ссылки
- Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Front. Immunol. 5, 683(2014).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
- Akagawa, K. S. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Int. J. Hematol. 76, 27-34 (2002).
- Akagawa, K. S., et al. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Respirology. 11 Suppl, S32-S36 (2006).
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J. Immunol. 178, 5245-5252 (2007).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. J. Immunol. 188, 5752-5765 (2012).
- Strasser, E. F., Eckstein, R. Optimization of leukocyte collection and monocyte isolation for dendritic cell culture. Transfus. Med. Rev. 24, 130-139 (2010).
- Kim, S., et al. Monocyte enrichment from leukapheresis products by using the Elutra cell separator. Transfusion (Paris). 47, 2290-2296 (2007).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Anzinger, J. J., et al. Native low-density lipoprotein uptake by macrophage colony-stimulating factor-differentiated human macrophages is mediated by macropinocytosis and micropinocytosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, 2022-2031 (2010).
- Zhao, B., et al. Constitutive receptor-independent low density lipoprotein uptake and cholesterol accumulation by macrophages differentiated from human monocytes with macrophage-colony-stimulating factor (M-CSF). J. Biol. Chem. 281, 15757-15762 (2006).
- Freeman, S. R., et al. ABCG1-mediated generation of extracellular cholesterol microdomains. J. Lipid Res. 55, 115-127 (2014).
- Kruth, H. S. Receptor-independent fluid-phase pinocytosis mechanisms for induction of foam cell formation with native low-density lipoprotein particles. Curr. Opin. Lipidol. 22, 386-393 (2011).
- Jin, X., et al. ABCA1 contributes to macrophage deposition of extracellular cholesterol. J. Lipid Res. 56, 1720-1726 (2015).
- Ong, D. S., et al. Extracellular cholesterol-rich microdomains generated by human macrophages and their potential function in reverse cholesterol transport. J. Lipid Res. 51, 2303-2313 (2010).
- Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10. Blood. 89, 315-321 (1997).
- Hashimoto, S. I., Komuro, I., Yamada, M., Akagawa, K. S. IL-10 inhibits granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent human monocyte survival at the early stage of the culture and inhibits the generation of macrophages. J. Immunol. 167, 3619-3625 (2001).
- Lund, P. K., Joo, G. B., Westvik, A. B., Ovstebo, R., Kierulf, P. Isolation of monocytes from whole blood by density gradient centrifugation and counter-current elutriation followed by cryopreservation: six years' experience. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 60, 357-365 (2000).
- Weiner, R. S., Normann, S. J. Functional integrity of cryopreserved human monocytes. J. Natl. Cancer Inst. 66, 255-260 (1981).
- Hansen, J. B., et al. Retention of phagocytic functions in cryopreserved human monocytes. J. Leukoc. Biol. 57, 235-241 (1995).
- Seager Danciger, J., et al. Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation. J. Immunol. Methods. 288, 123-134 (2004).
- Jin, X., Xu, Q., Champion, K., Kruth, H. S. Endotoxin contamination of apolipoprotein A-I: effect on macrophage proliferation--a cautionary tale. Atherosclerosis. 240, 121-124 (2015).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
