Прижизненные флуоресцентной микроскопии (IVFM) calvarium применяется в сочетании с генетическим животных моделей для изучения самонаведения и приживления гемопоэтических клеток в костном (БМ) ниши.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Сочетая прижизненной флуоресцентной микроскопии (IVFM) с генетической модели для изучения динамики приживления кроветворных клеток костного мозга ниши
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Все больше фактов указывает, что это нормальное кроветворение регулируется собственный microenvironmental подсказки в БМ, которые включают специализированные сотовой ниши, модулирует критических гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) функции1,2. Действительно более подробную картину гемопоэтических микроокружения теперь формируется, в котором endosteal и эндотелиальных ниши образуют функциональные единицы для регулирования обычных HSC и их потомства3,4,5 . Новые исследования показали важность периваскулярной клеток, адипоциты и нейрональные клетки в сохранении и регулировании HSC функции6,,78. Кроме того есть свидетельства того, что клетки от различных линий, т.е. миелоидного и лимфоидных клеток, дома и проживают в конкретных нишах в BM микроокружения. Однако полное картирование BM микроокружения и его обитатели все еще продолжается.
Трансгенные мыши штаммов, выражая линии конкретных флуоресцентные маркеры или мышей, генетически не хватает отдельных молекул в определенные ячейки BM нишу теперь доступны. Нокаут- и линии отслеживания модели, в сочетании с подходами, трансплантация, предоставляют возможность уточнить знания о роли конкретных «нишу» клетки для определенных гемопоэтических населения, например HSC, B-клетки, Т-клетки, миелоидных клеток и эритроидных клеток. Эта стратегия может быть далее потенцированные путем слияния использование двух Фотон микроскопии calvarium. Предоставляя в vivo изображений высокого разрешения и 3-D визуализации BM calvarium, мы теперь местоположение можно определить точно где конкретных подмножеств гемопоэтических дома в BM и оценить кинетику их расширения с течением времени. Здесь Lys-GFP трансгенных мышей (маркировка миелоидных клеток)9 и RBPJ нокаут-мышей (без канонических Notch сигнализации)10 используются в сочетании с IVFM для определения приживления миелоидных клеток к вырезка дефектных BM микроокружения.
Введение
Прижизненные multiphoton флуоресцентной микроскопии (IVFM) – это мощный изображений метод, который позволяет с высоким разрешением в реальном времени визуализации тканей с глубиной до 1 мм, в зависимости от ткани. При применении к calvarium мыши, позволяет наблюдения за поведением гемопоэтических клеток в BM неинвазивным способом до 60-100 мкм11. Этот подход используется здесь для определения кинетика приживления нормальной миелоидного прародителями мышей нокаут-БМ RBPJ, не хватает канонические Notch сигнализации.
Последние работы из нашей группы продемонстрировали, что дефектных канонические Notch сигнализации в BM ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
С разрешения животное уход и использовать Комитет по Индиана школы медицины университета были выполнены все процедуры, связанные с использованием животных. Обеспечить, чтобы придерживаться законодательства о животных экспериментов страны, где выполняется работа.
1. Подготовка Mx1CreRBPJ- / - получателей мышей
- Крест Mx1-Cre+ мышей с RBPJжидкий кислород/lox мышей10 для получения Mx1-Creположительные RBPJжидкий кислород/lox мышей12 и Mx1-Cre негативных RBPJжидкий кислород/lox однопометники для использования в к....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Когорты 2 RBPJKO и 2 RBPJWT получателей были отражаться в отдельных изображений сессии в разное время точках: 24 h и 2, 4 и 6 недель после пересадки BM Lys-GFP клеток (рабочий процесс проиллюстрирован на рисунке 1A).
В каждой мыши изображения были приобретены от 6 стандартных областей BM calvarium, определены их позиции по отношению к бифуркации центральной жилки (рисунок 2A, ) .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол описывает экспериментальный дизайн, оптимизированный для изучения кинетики приживления гемопоэтических клеток с флуоресцентными прижизненной микроскопии. В этом исследовании расширение клеток миелоидного progenitor в WT BM или в зазубрине сигнализации дефектных BM был отслеживается в кости calvarium следующих Lys-GFP позитивные миелоидных клеток после ТКМ в RBPJWT или RBPJKO получателей. Этот подход предлагается как модель, которая может применяться для решения подобных вопросов, например: я) для определени.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Визуализация была проведена в центре Индиана для биологических микроскопии в университете Индианы, режиссер доктор Кен Dunn. Стереотаксическая устройство является прототипом разработана и изготовлена, Марк Soonpaa, центр Уэллс педиатрических исследований. Эта работа была поддержана NIH/R01DK097837-09 (NC), NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (Размыкающих), MPN исследовательский фонд (NC) и CTSI совместных проектов IUSM/Нотр Дам (NC).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Кетаминовый коктейль | IU School of Medicine | Кетамин 90-100 мг/кг, Ксилазин 2,5-5,0 мг/кг, Ацепромазин 1,0-2,5 мг/кг | |
| TRITC dextan Tdb | Consultancy | TD150-100 мг | Можно использовать декстран другого цвета. |
| Триммер для волос | Andis Braintree Scientific | CLP-323 75 | |
| Марлевая губка | Med Vet International | PK224 | 4-слойный, 2 x 2 |
| Nair крем для депиляции | Коммерческий магазин | ||
| Солевой раствор | Med Vet International | RXSAL-POD1LT | 0,9% Хлорид натрия поли флакон |
| Инсулиновый шприц | Fisher Scientific | 14-826-79 | 28 г, 1/2 куб. см |
| Тонкие щипцы | Fine Science Tools | 00108-11, 00109-11 | прямой щипец, угловой щипец |
| Ножницы | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| иглодержатель | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| 5-0 шелковый шов | Fisher Scientific | MV-682 | Другие нерассасывающиеся шовные материалы могут быть использованы |
| WillCo- стеклянное дно тарелки | WillCo | GWSt-5040 | |
| Масло для оптического микроскопа | Leica | ||
| Вставка для стереотаксического стола | Медицинский факультет IU | Индивидуальный дизайн | |
| системы конфокального микроскопа Olympus FV1000 | Olympus | ||
| Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 объектив | Olympus | ||
| Маленькая грелка | Коммерческий магазин | Zoo Med грелка для рептилий | |
| Imaris 8.1 программное обеспечение для визуализации | Bitplane | 3/4 D Image Визуализация и анализ программного обеспечения |
Ссылки
- Carlesso, N., Cardoso, A. A. Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124 (PT 21), 35....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
