Методическая статья

Простой проточной цитометрии метод измерения глюкозы и глюкозы Transporter выражение для моноцитов субпопуляциях в цельной крови

16.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54255

⸱

12 августа 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Biomedical Research, Macfarlane Burnet Institute for Medical Research and Public Health, 2Department of Infectious Diseases, Monash University, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Melbourne, 4Department of Microbiology, The University of the West Indies, 5Division of Experimental Medicine, Department of Medicine, University of California, San Francisco, 6Department of Medicine, Monash University

В этой статье

Краткое содержание

Моноциты являются неотъемлемыми компонентами врожденной иммунной системы человека, которые при активации зависят от гликолитического метаболизма. Мы описываем протокол проточной цитометрии для измерения экспрессии транспортера глюкозы и поглощения глюкозы общими моноцитами и субпопуляциями моноцитов в свежей цельной крови.

Аннотация

Моноциты врожденные иммунные клетки, которые могут быть активированы патогенами и воспаления, связанные с некоторыми хроническими воспалительными заболеваниями. Активация моноцитов индуцирует эффекторные функции и сопутствующий сдвиг от окислительного к гликолитического метаболизма, что сопровождается повышением экспрессии переносчика глюкозы. Этот повышенный метаболизм гликолиза наблюдается также для обученного иммунитета моноцитов, форма врожденной иммунологической памяти. Хотя пробирке протоколы изучения экспрессии переносчика глюкозы и поглощение глюкозы моноцитов были описаны, ни один не был рассмотрен многопараметрического проточной цитометрии в цельной крови. Мы опишем многопараметрических протокол проточной цитометрии для измерения флуоресцентного аналогового поглощения глюкозы 2-NBDG в цельной крови на общее число моноцитов и классической (CD14 ++ CD16 -) промежуточное соединение (CD14 ++ CD16 +) и неклассической ( CD14 + CD16 ++) моноцитовсубпопуляции. Этот метод может быть использован для изучения экспрессии глюкозы транспортерные и поглощение глюкозы для общего количества моноцитов и моноцитов субпопуляции во время гомеостаза и воспалительного заболевания, и может быть легко изменен, чтобы исследовать поглощение глюкозы для других лейкоцитов и субпопуляций лейкоцитов в пределах крови.

Введение

Моноциты являются одним из основных компонентов человеческого врожденной иммунной системы, которые быстро мобилизован к очагов инфекции и воспаления 1. Активация моноцитов имеет решающее значение для ограничения острое поражение патогенами и также играет центральную роль в патогенезе некоторых хронических заболеваний, в том числе атеросклероза , 2, 3, рака и ВИЧ 4,5.

Метаболизм отдыха и активированных моноцитов резко отличается, с покоящихся моноцитов с использованием окислительного метаболизма и активированных моноцитов с использованием гликолиза метаболизм (т.е. ферментации глюкозы в лактат) 6. Активация моноцитов индуцирует экспрессию переносчиков глюкозы , что позволяет увеличить поглощение глюкозы для гликолитического метаболизма 7. Транспортер моноцитов глюкозы 1 (GLUT1) является одним из таких Транспортер активируется во время активации и его выражение было показано, что приведет к созданию провоспалительных цитокинов в VITRO и в жировой ткани мышей с ожирением 8. Заражение клеточной линии моноцитов по саркома Капоши , связанный герпесвирусов приводит к клеточной повышающей регуляции GLUT1 9, и мы недавно показали , что при хронической ВИЧ - инфекции повышенный процент GLUT1-экспрессирующих моноцитов присутствуют во время необработанной и комбинированной антиретровирусной терапии лечение инфекции 10. Взятые вместе, эти исследования показывают, что потребление глюкозы и гликолиза метаболизм моноциты являются важными аспектами многих воспалительных заболеваний. Таким образом, простой способ для измерения экспрессии GLUT1 моноцитов и поглощение глюкозы во время гомеостаза и воспалительное заболевание, вероятно, будет полезным для широкого круга исследователей.

Человеческие моноциты являются гетерогенными, которые состоят из трех различных подмножеств , которые могут быть исследованы с помощью дифференциальной экспрессии CD14 маркеров клеточной поверхности и CD16 11,12. Классические моноциты экспрессируют высокий уровень CD14, но не экспрессируют CD16 (CD14 ++ CD16 -), промежуточные моноциты экспрессируют высокий уровень CD14 и промежуточный уровень CD16 (CD14 ++ CD16 +), и неклассический моноциты экспрессируют низкий уровень CD14 и высокий уровень CD16 (CD14 + CD16 ++). Моноциты , которые выражают CD16 называются CD16 + моноциты, которые по сравнению с CD16 - моноциты имеют высокую экспрессию воспалительных цитокинов и способность более эффективно представляют антигены 13,14. Примерно 10% моноциты экспрессируют CD16 в течение гомеостаза с более высокими процентами , наблюдаемых во время воспаления 15. Моноцитов субпопуляции связаны с определенными болезненными состояниями и могут быть полезными биологическими маркерами прогрессирования заболевания и заболевания 16.

Наша цель состояла в том, чтобы определить метод, который может измерять глюкозы экспрессию транспортеров и поглощение глюкозы человеческих моноцитов и моноцитов субпопуляций в условиях, близких к PHYsiological условия, как это возможно. Предыдущие исследования измеряли экспрессию переносчика глюкозы моноцитов и поглощение глюкозы 17,18, хотя эти методы рассмотрены отдельные моноциты , которые могут иметь измененную экспрессию белка по сравнению с физиологических условиях 19, и никакое предыдущее исследование не исследовал субпопуляции моноцитов человека. Использование многопараметрических проточной цитометрии, мы опишем метод для изучения глюкозы выражение транспортерные и поглощение флуоресцентного аналога глюкозы 2-NBDG по общему объему моноцитов и моноцитов субпопуляций (на основе CD14 и CD16 экспрессии) в течение всей unmanipulated крови.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: ВИЧ-инфицированных и ВИЧ-неинфицированных субъекты были набраны из группы инфекционных заболеваний на Альфреда больницы в Мельбурне, VIC, Австралия, и от местного сообщества, соответственно. Информированное согласие было получено от всех участников, и исследование было одобрено Научно-исследовательский и Комитета по этике Альфреда больницы.

1. GLUT1 поверхности клеток Обнаружение на моноцитах и ​​моноцитов субпопуляциях

  1. Собрать кровь в цитрата ДСА-B антикоагулянтов трубок и начать эксперименты в кабинете биологической безопасности в течение 1 ч сбора.
  2. Добавьте 100 мкл крови в полипропиленовые пробирки. Добавляют 2 мл 1x лизирующий раствор (см Материалы таблицу) в пробирки , в то время как на льду, пипеткой осторожно перемешать. Выдержите в течение 15 мин на льду. Центрифуга при 220 мкг в течение 5 мин.
  3. Декантируют и мыть два раза путем добавления приблизительно 2-4 мл промывочного раствора (0,5% БСА в PBS 1x) и центрифугирование при 220 х г в течение 5 мин.
  4. Используйте трубуTTE тщательно удалить как можно больше промывочного раствора, как это возможно. Место труб на льду и вновь приостановить в 100 мкл промывочного раствора.
  5. Для того, чтобы определить конкретные моноцитов субпопуляции окрасить клетки со следующим объемом антител на 100 мкл клеточной суспензии, приготовленной на стадии 1,4: 5 мкл анти-CD3-PE, 5 мкл анти-CD14-APC, 5 мкл анти-CD16-PECy7, 5 мкл GLUT1 -FITC или IgG2b-FITC (управляющая трубка изотипа).
  6. Место на льду в течение 30 мин в темноте. Промыть 2 раза промывочным раствором. Закрепить с 200-300 мкл 0,5% формальдегида, сделанные в 1x PBS.
  7. Анализ на проточном цитометре позволяет обнаруживать 4 цвета в течение 24 часов в течение следующего возбуждения и эмиссии длины волны: FITC (488, 530), ПЭ (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660) 10.

2. Глюкоза Усвоение моноцитами

  1. Пипеток 90 мкл крови собирали на стадии 1.1 в полипропиленовые пробирки. Добавьте 10 мкл рабочего раствора 14,60 мкМ 2-NBDG в90-мкл крови (1,46 мМ конечная концентрация) и вылить осторожно перемешать. Крайне важно, чтобы ограничить 2-NBDG воздействия света путем покрытия труб с алюминиевой фольгой.
  2. Инкубируют при 37 ° С в темноте в течение 15-30 мин, а затем сразу же место на льду. Добавить 4 мл 1x FACS лизиса раствора в пробирки, в то время как на льду. Центрифуга при 220 мкг при 4 ° С в течение 5 мин.
  3. Промыть один раз путем добавления 4 мл промывочного раствора (0,5% БСА в 1X PBS). Центрифуга при 220 мкг при 4 ° С в течение 5 мин. Слейте и место на льду.
  4. Пятно клеток с антителами: 5 мкл анти-CD3-PE, 5 мкл анти-CD14-APC и 5 мкл анти-CD16-PECy7. Смешайте и место на льду в течение 30 мин в темноте.
    Примечание: В течение этого периода убедитесь, что поток цитометр готов к немедленному анализу. Приобретать клеток в следующем возбуждения и длина волны излучения: 2-NBDG (488, 530), ПЭ (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660).
  5. Добавляют 4 мл охлажденного льдом промывочного буфера (0,5% БСА в 1x PBS) в пробирки.Вымойте один раз путем центрифугирования при 220 мкг при 4 ° С в течение 5 мин. Слейте и добавьте 200-300 мкл ледяной старой PBS и держать на льду в темноте (покрытый алюминиевой фольгой). Анализ на проточном цитометре в течение 10 мин с использованием возбуждения и установки длины волны эмиссии, как в шаге 2.4.

3. Приобретение и анализ данных

Примечание: Знание проточной цитометрии и анализа данных предполагается.

  1. С использованием проточного цитометра позволяет проводить анализ по крайней мере, 4-цвета, установить компенсацию с использованием неокрашенных и индивидуально окрашенных образцов.
    Примечание: Одно окрашивание с использованием FITC-меченного CD4 и CD14 могут быть использованы для GLUT1 и компенсации 2-NBDG.
  2. Настройка и пометить соответствующие окна перед получением образцов. Нарисуйте ворота вокруг населения моноцитов, и приобрести 100 000 до 300 000 событий в выборке на средней скорости. 50000 событий в образце компенсации достаточно.
    Примечание: Компенсация может быть проведена до образцаприобретение или в одном программного обеспечения для анализа клеток, в соответствии со стандартными процедурами.
  3. Экспорт и сохранить данные в нужное место. Открывают одного программного обеспечения для анализа клеток , таких как FlowJo или другого программного обеспечения для анализа (Справочная Рисунок 1) и перетаскивание образцов , как указано (Дополнительное Рисунок 2).
  4. Дважды щелкните , чтобы открыть файл (Дополнительный рисунок 3). Нарисуйте круг для ворот моноциты на основе вперед и свойства бокового рассеяния , как показано на рисунке 1А и Дополнительной Рисунок 4. Дважды щелкните население моноцитов. Наблюдайте и нарисуйте рамку вокруг CD3 - население (Справочная рисунок 4).
  5. Дважды щелкните на CD3 - население. Для наблюдения моноцитов субпопуляции выберите CD14-APC на "х" оси, и CD16-PECy7 на «y'- оси, и соответствующим образом маркировать (Supplemental рисунок 5).
  6. Там, где нет четкихположительные и отрицательные популяции, измеряют экспрессию GLUT1 или поглощение 2-NBDG в конкретных моноцитов подгруппах. Определить средние интенсивности флуоресценции (MFI) из GLUT1 и 2-NBDG путем вычитания изотип и отсутствие фона 2-NBDG (Справочная рисунок 6).
  7. Там , где существуют определенные группы населения, использовать IgG2b-FITC , чтобы установить ворота, и определить процент положительных клеток (рисунок 3).
    Примечание: Эта процедура используется для анализа общих CD14 + моноцитов. Поскольку поглощение 2-NBDG обычно отмечается сдвиг в интенсивности флуоресценции данные лучше всего представлены MFI и гистограмм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Компенсация должна быть выполнена для отдельных флюорохромами для предотвращения флуоресценции перелива. Моноциты сначала обогащается стробирования на основе передней и боковой разброс. Графики , представленные представители по крайней мере , шесть независимых экспериментов , проведенных на цельной крови из шести или более участников , как сообщалось ранее 10 Рисунок 1А показывает начальное стробирования моноцитов клеток разбросом и исключения Т - клеток путем...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол, описанный здесь подробно описан простой метод для изучения глюкозы экспрессии переносчика и люминесцентную глюкозы аналоговый поглощение моноцитов и моноцитов субпопуляций в цельной крови. Оценивая поглощение 2-NBDG в цельной крови, эта методика позволяет условиях , аналогичных тем , в естественных условиях. В предыдущем исследовании изучались 6-NBDG поглощение в моноцитах , выделенных из цельной крови путем центрифугирования плотности 17. Тем не менее, данное исследование не исследовал мон...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было профинансировано Австралийским центром по борьбе с ВИЧ и гепатита вирусологии исследований (ACH 2) и 2010 грант развития (CNIHR) из Университета штата Вашингтон Центра исследований СПИДа (CFAR), в NIH ​​финансируемой программы под удостоенный номером AI027757 , которая поддерживается следующим NIH институтов и центров (NIAID, NCI, NiMH-, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA). СНТ является получателем гранта 2 CNIHR и ACH. SMC является получателем национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии (NHMRC) Основные научные стипендии. Авторы выражают признательность за вклад в эту работу викторианской Оперативной программы инфраструктуры поддержки, полученной Бернет институтом. Мы признаем помощь Геза Paukovic и Ева орловского-Оливер из AMREP проточной цитометрии основной комплекс для проточной цитометрии подготовки и технических консультаций. Мы благодарим Angus Морган для тренерской медиа и организации съемок клипа. Наша благодарностьДжесси Массона и Джихад Абдулазиз К. Alzahrani для лабораторной помощи во время видеосъемки. Мы благодарим усилия д-ра Дэвида Simar в школе медицинских наук, UNSW, Австралия, которые предложили критические методологические рекомендации. СКП хотел бы поблагодарить www.nice-consultants.com для графических консультаций.

ВКЛАД Авторов:

СНТ задумал проект, разработанный и провели эксперименты, анализ и интерпретация данных, и написал рукопись. JJA интерпретировать данные и написал рукопись. TRB написал рукопись. JMM интерпретировать данные, сделал критические интеллектуальные предложения, и рассмотрел рукопись. SMC интерпретировать данные, сделанные критические интеллектуальные предложения и рассмотрел рукопись.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
VACUETT Tube 9 мл ACD-B антикоагулянтные пробиркиGreiner Bio-One GmbH455094
5 мл стерильные полипропиленовые пробиркиBD Biosciences352063
Альбумин из бычьей сыворотки (BSA)Sigma-AldrichA7906
16% раствор формальдегидаЭлектронная микроскопияScience 15710
BD FACS лизирующий раствор (10x)BD Biosciences349202Разбавить лизирующий раствор BD FACS 1/10 деионизированной водой до рабочей концентрации (хранить до 1 недели при температуре 4°°; C)
анти-CD3-PEBD Biosciences555340
анти-CD14-APCBD Biosciences555399
анти-CD16-PECy7BD Biosciences557744
анти-Glut1-FITCR & DSystems FAB1418F
IgG2b-FITCR & D SystemsIC0041F
2-NBDGLife technologiesN13195Суспензировать 5 мг 2-NBDG в 1 мл деионизированной воды для получения исходного раствора 14,60 мМ (хранить до 6 месяцев при 4 °°; В). Чтобы получить рабочую концентрацию 2-NBDG, разбавьте бульон 1/100 1x DPBS. Накрыть пленкой. (хранить до 1 недели при 4° В)
Дульбекко' s Фосфатно-солевой буферный раствор (1x)Life technologies14190-144Для приготовления раствора для промывки добавьте 0,5 г BSA на 100 мл DPBS (хранить до 2 недель при 4 &dg; В)

Ссылки

  1. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).
  2. Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).
  3. Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and macrophages in cancer: development and functions. Cancer Microenviron. 6, 179-191 (2013).
  4. Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., Angelovich, T. A., Crowe, S. M., Palmer, C. S. Monocytes as regulators of inflammation and HIV-related comorbidities during cART. J Immunol Res. 2014, 569819(2014).
  5. Palmer, C., Cherry, C. L., Sada-Ovalle, I. Glucose Metabolism in T Cells and Monocytes: New Perspectives in HIV Pathogenesis. EBioMedicine. , (2016).
  6. Cheng, S. C., et al. mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science. 345, 1250684(2014).
  7. Maratou, E., et al. Glucose transporter expression on the plasma membrane of resting and activated white blood cells. Eur J Clin Invest. 37, 282-290 (2007).
  8. Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1)-mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. J Biol Chem. 289, 7884-7896 (2014).
  9. Gonnella, R., et al. Kaposi sarcoma associated herpesvirus (KSHV) induces AKT hyperphosphorylation, bortezomib-resistance and GLUT-1 plasma membrane exposure in THP-1 monocytic cell line. J Exp Clin Cancer Res. 32, 79(2013).
  10. Palmer, C. S., et al. Glucose transporter 1-expressing proinflammatory monocytes are elevated in combination antiretroviral therapy-treated and untreated HIV+ subjects. J Immunol. 193, 5595-5603 (2014).
  11. Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118, e16-e31 (2011).
  12. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116, e74-e80 (2010).
  13. Belge, K. U., et al. The proinflammatory CD14+CD16+DR++ monocytes are a major source of TNF. J Immunol. 168, 3536-3542 (2002).
  14. Frankenberger, M., Sternsdorf, T., Pechumer, H., Pforte, A., Ziegler-Heitbrock, H. W. Differential cytokine expression in human blood monocyte subpopulations: a polymerase chain reaction analysis. Blood. 87, 373-377 (1996).
  15. Ziegler-Heitbrock, L. The CD14+ CD16+ blood monocytes: their role in infection and inflammation. J Leukoc Biol. 81, 584-592 (2007).
  16. Ziegler-Heitbrock, L. Macrophages: Biology and Role in the Pathology of Diseases. , Springer. 3-36 (2014).
  17. Dimitriadis, G., et al. Evaluation of glucose transport and its regulation by insulin in human monocytes using flow cytometry. Cytometry A. 64, 27-33 (2005).
  18. Fu, Y., Maianu, L., Melbert, B. R., Garvey, W. T. Facilitative glucose transporter gene expression in human lymphocytes, monocytes, and macrophages: a role for GLUT isoforms 1, 3, and 5 in the immune response and foam cell formation. Blood Cells Mol Dis. 32, 182-190 (2004).
  19. Stibenz, D., Buhrer, C. Down-regulation of L-selectin surface expression by various leukocyte isolation procedures. Scand J Immunol. 39, 59-63 (1994).
  20. Ahmed, N., Kansara, M., Berridge, M. V. Acute regulation of glucose transport in a monocyte-macrophage cell line: Glut-3 affinity for glucose is enhanced during the respiratory burst. Biochem J. 327 (Pt 2), 369-375 (1997).
  21. Cutfield, W. S., Luk, W., Skinner, S. J., Robinson, E. M. Impaired insulin-mediated glucose uptake in monocytes of short children with intrauterine growth retardation). Pediatr Diabetes. 1, 186-192 (2000).
  22. Yoshioka, K., et al. A novel fluorescent derivative of glucose applicable to the assessment of glucose uptake activity of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1289, 5-9 (1996).
  23. Speizer, L., Haugland, R., Kutchai, H. Asymmetric transport of a fluorescent glucose analogue by human erythrocytes. Biochim Biophys Acta. 815, 75-84 (1985).
  24. Palmer, C. S., et al. Increased glucose metabolic activity is associated with CD4+ T-cell activation and depletion during chronic HIV infection. AIDS. 28, 297-309 (2014).
  25. Palmer, C. S., Ostrowski, M., Balderson, B., Christian, N., Crowe, S. M. Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions. Frontiers in immunology. 6, (2015).
  26. Palmer, C. S., et al. Regulators of glucose metabolism in CD4 and CD8 T cells. International reviews of immunology. , 1-12 (2015).
  27. Palmer, C. S., Crowe, S. M. How does monocyte metabolism impact inflammation and aging during chronic HIV infection? AIDS research and human retroviruses. 30, 335-336 (2014).
  28. McFadden, K., et al. Metabolic stress is a barrier to Epstein-Barr virus-mediated B-cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E782-E790 (2016).
  29. Gamelli, R. L., Liu, H., He, L. K., Hofmann, C. A. Augmentations of glucose uptake and glucose transporter-1 in macrophages following thermal injury and sepsis in mice. Journal of leukocyte biology. 59, 639-647 (1996).
  30. Yin, Y., et al. Glucose Oxidation Is Critical for CD4+ T Cell Activation in a Mouse Model of Systemic Lupus Erythematosus. Journal of immunology. , 80-90 (2016).
  31. Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis research & therapy. 17, 29(2015).
  32. Yin, Y., et al. Normalization of CD4+ T cell metabolism reverses lupus. Science translational medicine. 7, 274ra218(2015).
  33. Barbera Betancourt, A., et al. Inhibition of Phosphoinositide 3-Kinase p110delta Does Not Affect T Cell Driven Development of Type 1 Diabetes Despite Significant Effects on Cytokine Production. PloS one. 11, e0146516(2016).
  34. Barron, C. C., Bilan, P. J., Tsakiridis, T., Tsiani, E. Facilitative glucose transporters: Implications for cancer detection, prognosis and treatment. Metabolism: clinical and experimental. 65, 124-139 (2016).
  35. Hegedus, A., Kavanagh Williamson, M., Huthoff, H. HIV-1 pathogenicity and virion production are dependent on the metabolic phenotype of activated CD4+ T cells. Retrovirology. 11, 98(2014).
  36. Taylor, H. E., et al. Phospholipase D1 Couples CD4+ T Cell Activation to c-Myc-Dependent Deoxyribonucleotide Pool Expansion and HIV-1 Replication. PLoS Pathog. 11, e1004864(2015).
  37. Loisel-Meyer, S., et al. Glut1-mediated glucose transport regulates HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2549-2554 (2012).
  38. Palmer, C. S., et al. Emerging Role and Characterization of Immunometabolism: Relevance to HIV Pathogenesis, Serious Non-AIDS Events, and a Cure. J Immunol. 196 (11), 4437-4444 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

2 NBDGCD14 CD16

Похожие статьи