Мы собрали, окрасили и визуализировали клетки из конъюнктивы внутреннего края век людей. Характеризуя морфологию клеток и метаболическую активность, этот метод может улучшить наше понимание сухого глаза и роли, которую трение между глазными поверхностями может играть в восприятии глазного дискомфорта.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Впечатление цитологии Лид Wiper Площадь
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Существует несколько отчетов о клеточной анатомии области стеклоочистителя век (LW) внутреннего века, и только в одном отчете используются цитологические методы. В данном исследовании описана оптимизация метода сбора, окрашивания и визуализации клеток из области LW с помощью импрессионной цитологии (ИК). Клетки собирают с внутренней поверхности верхнего века человека с помощью гидрофильных мембран политетрафторэтилена (ПТФЭ) и окрашивают цитологическими красителями, чтобы выявить наличие бокаловидных клеток, муцинов, клеточных ядер и различных степеней пре- и пара-кератинизации. Иммуноцитохимические красители проявляют активность клеточной эстеразы и нарушенные клеточные мембраны с помощью конфокального сканирующего лазерного микроскопа. Для каждого образца создается до 100 микроскопических цифровых изображений, которые сшиваются в крупномасштабное изображение с высоким разрешением по всему диапазону ИС. Мы демонстрируем более высокую чувствительность IC, чем сообщалось ранее, что подходит для идентификации клеточной морфологии и метаболической активности в области LW. Насколько нам известно, это первый случай, когда этот набор флуоресцентных красителей был использован для визуализации мембран LW IC. Этот протокол будет эффективен в будущих исследованиях для выявления недокументированных деталей области LW, таких как оценка клеточных особенностей пользователей контактных линз или пациентов с эпителиопатией сухого глаза или стеклоочистителя.
Введение
Верхнее веко человек выполняет около 10000 мигает каждый день 1, с помощью всего 1 - 2 мм узкая область конъюнктивы глазного противостояния миру. Из - за его движения протирки во время миганий, а эта часть края крышки было названо "крышка стеклоочистителя" область 2. Предполагается, что трение увеличивается в этом регионе во время привычного миганием, благодаря крышке очищающего по всему земному шару. Это может играть существенную роль в глазном комфорте. Кто носит контактные линзы , в частности , опыт глазного дискомфорта , и это является одной из главных причин прекращения ношения линз 3. Когда контактная линза находится на глазу, коэффициент трения между материалом линзы и поверхностью глазного яблока было показано , что изменение 4. Существует доказательство того, чтобы предположить , что симптомы сухости может быть связано с этим измененном трения 2,5,6.
Эта ассоциация также может быть отражено в клинически наблюдаемых явлений, в частности, крышка Wiза эпителиопатии (LWE), также называемая верхняя крышка Маржа окрашивания (ULMS) 6. LWE является ранним признаком раздражения глаз и потенциальным прогностическим для сухой глазной болезни. Наблюдается и измеряется витального окрашивания верхнего и нижнего края областей крышки. Хотя эта система классификации 2 и его клиническая обоснованность (т.е., корреляция с субъективными симптомами) , все еще в стадии обсуждения, глазного дискомфорта остается загадкой для врачей и ученых , так и, что самое главное, неудобство для пациентов.
На сегодняшний день, мало известно о клинически релевантных вариантов в (суб-) клеточной анатомии и физиологии стеклоочистителя области крышки 7 и только один отчет использует цитологических методов 8. Впечатление цитологии (IC) был принят на работу в течение более 40 лет , чтобы собрать клетки из эпителиальной поверхности бульбарных или предплюсны конъюнктивы путем применения мембраны 9,10. После удаления прилипшие клетки претерпевают Cytological окрашивание и микроскопические изображения. Из-за анатомических и клеточных различий в обтирочного области крышки, этот метод требует оптимизации.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этика заявление: До сбора клеток из человеческих субъектов, информированное согласие и должно быть получено одобрение этикой.
1. Подготовить Stain
Примечание: Подготовить пятно на день эксперимента.
- Добавьте 5 мкл этидий (или 4 мкМ) и 5 мкл кальцеином AM (или 4 мкМ) до 2,5 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) в 15 мл центрифужную пробирку; смешивание. Оберните алюминиевой фольгой, чтобы защитить от света и хранить при комнатной температуре до использования.
2. Отобрать клетки
- Удалите культуры клеток вставки из их упаковки и этикетки для каждого веко должны быть взяты пробы. Отметить ориентацию сбора клеток на стороне мембраны пластикового держателя с помощью перманентным маркером. Провести осмотр щелевой лампы при умеренном увеличении (приблизительно 20Х) для подтверждения надлежащего здоровья региона пройти IC.
- Разлить одну каплю местного анестетика (0,5% пропаракаина гидрохлорид) в нижний конъюнктивальный мешок еач глаз и инструктировать участника, чтобы держать глаза закрытыми в течение одной минуты.
- Эверт верхняя крышка глаза и удерживать на месте по ресницам; избегать любого контакта с областью крышки стеклоочистителя.
Дополнительно: помощь вторичного исследователя может потребоваться для выполнения этого шага. - Применение мембраны перпендикулярно к поверхности центральной части обтирочного области крышки с минимальным давлением.
- Держите мембрану в месте в течение 3 - 5 сек. Обратите внимание на мембраны становятся полупрозрачными в зоне контакта. На данный момент, аккуратно удалить мембрану и разрешить крышку участника, чтобы "перевернуть" обратно на место.
- Оперативно применять одну каплю PBS на образце, чтобы предотвратить его от высыхания. Мембрана повернет полупрозрачным и не превращалась непрозрачным в любое время, так как это указывает на то сушку. Есть вторичный следователь немедленно приступить с обработкой образцов (раздел 3).
- Провести окончательную проверку глаз, чтобы обеспечить целостность конъюнктивы. Разлить окуляр смазки и инструктировать участниковчтобы избежать потирают глаза, пока обезболивающий эффект не спадет (примерно 15 мин.).
3. Обработка проб
- С помощью микро-ножницы, разрезать мембрану пополам (одна половина для каждой из последующих анализов), перпендикулярно через середину сбора клеток. Сокращение вдоль наружного края одной мембраны половины, чтобы отделить его от пластикового держателя; избежать взаимодействия с собранными клетками на мембране, в том числе обеспечение того, чтобы мембрана не сгиб на себя.
- Закрепите мембрану пинцетом до полного отсоединения от держателя. Поместите мембрану в меченой 2 мл центрифужную пробирку, содержащую 500 мкл 95% (об / об) этанола и оставляют для фиксации в течение минимум 20 минут до максимум 2 ч до обработки (раздел 4.2).
- Сразу же отдельная вторая половина мембраны (как описано в разделе 3.2) и незамедлительно приступить к разделу 4.1.
4. Образец Окрашивание
- Immunocytochemiкал Окрашивание
- Осторожно поместите мембрану в 35 мм со стеклянным дном культуры блюдо с коллекцией стороной вниз; обеспечить мембрана является плоской.
- Внесите 20 мкл Иммуноцитохимическую пятна состава собранной в секции 1 на мембране. Если образец сворачивается, использовать одноразовые наконечники пипеток тщательно выравнивать мембрану, нажав ее края вниз. Избегать контакта с участками сбора клеток.
- Аккуратно покрыть мембрану с покровным стеклом. Избегайте ненужного движения образца. Накройте блюдо с крышкой и запечатывают с лабораторным пленкой по краям. Не загромождать прозрачность посуды (сверху и снизу) и видимость образца. Этикетка с лабораторным маркером.
- Немедленно приступить к визуализации (раздел 5.1), а затем вернуться к разделу 4.2, чтобы продолжить цитологического окрашивания другой половины мембраны.
- Цитологические Окрашивание
- Постепенно гидратной оболочки путем медленного добавления 500 мкл дистиллированной воды в трубке UСЭД для фиксации в разделе 3.4. Аспирируйте содержимое несколько раз в пипетки перемешать, а затем удалить содержимое.
- Добавить 500 мкл дистиллированной воды. Дайте постоять в течение нескольких секунд, а затем удалить. Добавьте 500 мкл Альциановый синевы и оставить на 3 мин. Удалить пятно и выполнить 3 последовательных 500 мкл дистиллированной воды не полощет или пока жидкость промывает ясно.
- Добавьте 500 мкл гематоксилин # 1 пятно и оставьте на 3 мин. Удалить пятно и выполнить три последовательных 500 мкл дистиллированной воды полосканий или пока жидкость не полощет ясно. Дегидрировать (обратная раздела 4.2.1) с помощью аспирационных прозрачной жидкости.
- Добавьте 500 мкл Папаниколау ОГ-6 пятно и оставьте на 3 мин. Удалить пятна и выполнить одну 500 мкл 95% (об / об) полоскание этанола.
- Добавьте 500 мкл Папаниколау EA-65 пятно и оставьте на 3 мин. Удалить пятно и выполнить 3 последовательных 500 мкл 95% (об / об) этанол ополаскивателей.
- Полностью обезвоживают с использованием трех последовательных 500 мкл 100% этанола полосканий. Использование TWEEZERS, удалить образец из раствора; избегать прикосновения к области сбора клеток.
- Поместите мембрану на предметное стекло; обеспечить сбор клеточной линии параллельно или перпендикулярно к слайду маржу для облегчения выравнивания при визуализации.
- Нанесите каплю 100% этанола и накрыть стеклянным скольжением. Немедленно приступить к визуализации (раздел 5.2).
5. Пример обработки изображений
- Флуоресцентные визуализации Иммуноцитохимические Пятна
- С помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) 11 или флуоресцентный микроскоп 12, оснащенный цифровой цветной камерой, подключенной к компьютеру , на котором работает программное обеспечение захвата изображений. Из-за выборок, содержащаяся в культуральные чашки, инвертированный микроскоп может быть необходимым.
- Настройка микроскопа 11,12 в зависимости поглощения и испускания спектров этидия гомодимерного-1 (528/617 нм Ex / Em максимумы в присутствии ДНК) и кальцеина AM (494/517 нм Eх / Em максимумы).
- Выберите наименьшее увеличение микроскопа (например, 2.5X объективную) и активировать систему цифровой обработки изображений; наблюдать за пробой, отображаемое на мониторе компьютера.
- Проверьте образец для клеточных функций, представляющих интерес.
- Выберите нужный увеличение микроскопа и получения изображений с помощью программного обеспечения визуализации.
- Сохранить файлы в любом исходном формате микроскоп файл или несжатый формат файла (например, * .raw, * .tiff).
- Визуализации цитологическое Пятна
- Используйте стандартный лабораторный ярко-полевой микроскоп без фильтров, оснащенный цифровой цветной камерой, подключенной к компьютеру, на котором работает программное обеспечение захвата изображений.
- Место и замок предметное стекло (со стадии 4.2.8) на столике микроскопа. Увлажняет образец с 100% -ным этанолом в случае необходимости, на протяжении всей процедуры визуализации.
- Выберите наименьшее увеличение микроскопа (например, 2.5X объективное) и активировать е местоСистема цифровой обработки изображений е; наблюдать за пробой, отображаемое на мониторе компьютера.
- Обеспечить сбор клеток выравнивается либо оси X или Y контроля стадии микроскопа. Отрегулировать при необходимости, удалением покровное и вращением образца с помощью пипетки или пинцета.
- С помощью программного обеспечения обработки изображений, захвата изображения (ы) по всей выборке с наименьшим увеличением микроскопа.
- Переход к умеренным увеличением микроскопа (например, 10 - 20X объективной) и настроить микроскоп источник света и параметры визуализации программного обеспечения (экспозиция, контраст, баланс белого и т.д.), и отключить их автоматизированное программное обеспечение учета. Сохраните эти настройки для использования в будущем.
- Определить начальную и конечную точки сканирования (например, верхний левый и нижний правый углы сбора клеток).
- С помощью программного обеспечения обработки изображений, захвата изображения (ы) всей площади сбора клеток в начальной и конечной точек. Убедитесь, что 20% из стороны в сторону и сверху донизу перекрытия betwееп все соседние изображения.
- Сохраните файлы , используя собственный формат файла микроскопа или несжатый формат файла (например, * .raw, * .tiff).
- Произведите окончательную панорамное изображение с помощью программного обеспечения автоматизированного сшивание выбора (например, Adobe Photoshop Elements). Используйте эталонные изображения, сделанные на этапе 5.2.5), чтобы подтвердить достоверность автоматизированной строчки в итоговом изображении.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Культуру клеток мембрана, натянутая над пластмассовым держателем является удобным инструментом для портативной коллекции эпителиальных клеток из крышки стеклоочистителя конъюнктивы. Этот способ исключает необходимость в дополнительных стерилизованных инструментов , обычно используемых для подготовки и обрабатывать IC мембраны. На рисунке 1 показана интегральная схема зоны стеклоочистителей крышки с использованием клеточной культуры вставку. Мы оптимизировали два различны...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Впечатление цитологическое, как правило, выполняется на бульбарной конъюнктивы, с использованием смешанного сложного эфира целлюлозы мембраны. Образцы разрезают по размеру из массивного материала листов, стерилизованы, применяется и удаляется из конъюнктивальной поверхности с помощью щипцов. Используя тот же материал мембраны, поршень под контролем ИС - устройство было недавно разработан , чтобы соответствовать геометрии поверхности бульбарной конъюнктивы, и поддерживать постоянное давление между приложениями 13.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют соответствующего финансирования или конфликтов для раскрытия.
Благодарности
Мы хотели бы выразить признательность нашему коллеге доктору Джалайе Варикути (Jalaiah Varikooty), который поделился своими знаниями и опытом по теме салфеток для крышек, что очень помогло в этом исследовании.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Альцианский синий, 1% в 3% уксусной кислоте | Sigma | B8438-250ML | |
| гематоксилин, Gill 1 | Sigma | GHS116-500ML | |
| краситель Papanicolaou, OG-6 | Sigma | HT40116-500 мл | |
| краситель Papanicolaou, модифицированный EA | Sigma | HT40232-1L | |
| Живая/мертвая жизнеспособность/цитотоксичность Набор | Life Technologies | L-3224 | содержит гомодимер этидия-1 и кальцеин AM красители |
| Алкаин (0,5% пропаракаина гидрохлорид | Alcon | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 12 мм, гидрофильный ПТФЭ, 0,4 &микро; m | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Тарелки со стеклянным дном 35 мм | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
Ссылки
- Barbato, G., et al. Diurnal variation in spontaneous eye-blink rate. Psychiatry Res. 93, 145-151 (2000).
- Korb, D. R., et al. Lid-Wiper Epitheliopathy and Dry-Eye Symptoms in Contact Lens Wearers. Eye & Contact Lens. 28, 211-216 (2002).
- Dumbleton, K., Woods, C. A., Jones, L. W., Fonn, D. The impact of contemporary contact lenses on contact lens discontinuation. Eye & Contact Lens. 39, 93-99 (2013).
- Roba, M., Duncan, E., Hill, G., Spencer, N., Tosatti, S. Friction measurements on contact lenses in their operating environment. Tribol Lett. 44, 387-397 (2011).
- Sickenberger, W., Pult, H., Sickenberger, B. LIPCOF and contact lens wearers: a new tool to forecast subjective dryness and degree of comfort of contact lens wearers. Contactologia. 22, 74-79 (2000).
- Pult, H., Purslow, C., Berry, M., Murphy, P. J. Clinical tests for successful contact lens wear: relationship and predictive potential. Optom Vis Sci. 85, E924-E929 (2008).
- Doughty, M. J. Morphological features of cells along Marx's line of the marginal conjunctiva of the human eyelid. Clin Exp Optom. 96, 76-84 (2013).
- Jalbert, I., et al. Assessing the human lid margin epithelium using impression cytology. Acta Ophthalm. 90, e547-e552 (2012).
- Nelson, J. D. Impression cytology. Cornea. 7, 71-81 (1988).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84, 798-801 (1977).
- Wilson, T. Confocal microscopy. , Academic Press. London. 1-64 (1990).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tomlins, P., Roy, P., Curnow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival Impression for Flow Cytometry. Invest Ophthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Res Proj Dry Eye Syn. 45, 108-122 (2010).
- Knop, E., et al. The lid wiper and muco-cutaneous junction anatomy of the human eyelid margins: an in vivo confocal and histological study. J Anat. 218, 449-461 (2011).
- Christensen, J. A., Skaarland, E. Nuclear and cell area measurements in the cytological evaluation of pleural effusions: a study of subjective assessments and morphometric measurements. Diag Cytopathol. 3, 50-54 (1987).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
