Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение гранулоцитов и моноцитов Фагоцитоз и окислительный взрыв активности в крови человека

13.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54264

⸱

12 сентября 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Human Performance Laboratory, North Carolina Research Campus, Appalachian State University, 2Department of Biology, Appalachian State University, 3David H. Murdock Research Institute

В этой статье

Краткое содержание

Цель этой рукописи - представить метод измерения фагоцитоза моноцитов и гранулоцитов и окислительной активности в образцах крови человека.

Аннотация

Анализ фагоцитоза гранулоцитов и моноцитов и активности окислительного взрыва (OB) может быть использован для изучения врожденной иммунной системы. В данной рукописи представлена необходимая методология для добавления данного анализа в арсенал иммунологии физических упражнений. Первым шагом в этом анализе является приготовление двух аликвот («H» и «F») цельной крови (гепарина). Затем к аликвоте H добавляют дигидроэтидий, и обе аликвоты инкубируют в теплой водяной бане с последующей холодной водой. Затем к H. aliquot добавляют Staphylococcus aureus (S. aureus), а к F-аликвоте добавляют S. aureus, меченный изотиоцианатом флуоресцеина (бактерии: фагоциты = 8:1), и обе аликвоты инкубируют на теплой водяной бане, а затем на холодной водяной бане. Затем в каждую аликвоту добавляют трипановый синий для гашения внеклеточной флуоресценции, а клетки промывают фосфатно-солевым буфером. Затем эритроциты лизируются, а лейкоциты фиксируются. Наконец, проточный цитометр и соответствующее аналитическое программное обеспечение используются для измерения фагоцитоза гранулоцитов и моноцитов и активности OB. Этот анализ используется уже более 20 лет. После тяжелых и длительных нагрузок у спортсменов наблюдается значительное, но преходящее усиление фагоцитоза и длительное снижение активности OB. Увеличение фагоцитоза после тренировки коррелирует с воспалением. В отличие от людей с нормальным весом, фагоцитоз гранулоцитов и моноцитов хронически повышен у участников с избыточным весом и ожирением и умеренно коррелирует с С-реактивным белком. Таким образом, этот анализ, основанный на проточной цитометрии, измеряет фагоцитоз и активность OB фагоцитов и может быть использован в качестве дополнительной меры воспаления, вызванного физической нагрузкой и ожирением.

Введение

Гранулоцитов и моноцитов фагоцитоз / окислительный взрыв (OB) анализ активности представляет собой простой, прямолинейный метод , который часто используется для сбора информации о врожденной иммунной функции после длительной и интенсивной тренировки. 1-4 При изучении реакции иммунной системы на стимул, гранулоциты и моноциты представляют особый интерес , так как они играют центральную роль в защите хозяина и первые иммунные клетки аккумулировать в месте инфекции. 5 Нейтрофилы, тип гранулоцитов, первые клетки к транслокации в поврежденных мышц ткани после интенсивных физических упражнений. 6 Фагоцитоз и ОВ активности являются наиболее распространенными мерами гранулоцитов и моноцитов функции, 7 и являются предпочтительными в качестве показателей врожденной функции иммунных клеток из - за их центральной роли в обоих инфекционного процесса и процесса ремонта.

Анализ, описанный в этой рукописи UtiliZES базовый поток цитометра, чтобы обеспечить количественное определение гранулоцитов и моноцитов фагоцитоз и активность OB в цельной крови. Использование цельной крови в этой технике является предпочтительным, так как оно позволяет анализ будет проводиться без процедуры очистки больших затрат времени. Этот анализ может быть легко изменена, чтобы приспособить множество научно-исследовательских проектов и возможностей лаборатории. Например, Ляо и др. Использовали подобную технику , чтобы показать , что нейтрофильный OB активность повышается и нейтрофилами фагоцитоза уменьшается следующим черепно - мозговой травмы. 8 В другом примере, McFarlin и др. Описал элегантную модификацию этого метода, использующего аллофикоцианин (APC ) -conjugated CD66b и высокопроизводительный тандем APC-конъюгированного маркировки с CD45 на основе изображений проточной цитометрии для классификации гранулоцитов с точки зрения их фагоцитоза и ОВ деятельности. 7,9

Наша исследовательская группа использовала различные приспособления этого тэchnique как показатель врожденной иммунной функции избыточным весом, ожирением и спортивных групп населения в течение почти 20 лет. 10,11 Приведенный ниже текст будет обеспечить читателя шаг за шагом инструкции для выполнения этого анализа и выделить области , которые читатель может адаптироваться для удовлетворения потребностей своих исследований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Все процедуры сбора крови были проведены в соответствии с руководящими принципами, установленными Аппалачи государственного университета совет Review (ASU) Институциональная (IRB).

1. Анализ Получение

  1. Собрать, подготовить и организовать материалы, указанные для данной процедуры (пожалуйста, обратитесь к таблице конкретных материалов / оборудования).
    1. Этикетка 12 х 75 мм трубки.
      1. Этикетка две трубки для каждого участника: одна трубка для анализа фагоцитоза (этикетка эту трубку с черными чернилами, и "F" для флуоресцеинизотиоцианатом [FITC]) и одну пробирку для анализа О.Б. активности (маркировать эту трубку с красными чернилами и " H "для dihydroethidium [HE]).
        Примечание: Использование стерильных 12 х 75 мм труб рекомендуется свести к минимуму непреднамеренные активацию клеток и связанного с ним увеличение фонового шума.
      2. Добавьте три пробирки для анализа управления: одну трубку для анализа фагоцитоза (контроль FITC: этикетка эту трубку с BlacK чернил и "F"), одна трубка для анализа О.Б. активности (ОН контроль: маркировать эту трубку с красными чернилами и "H"), а также одну трубку для отрицательного контроля (кровь только: маркировать эту трубку с зелеными чернилами и "только кровь").
    2. Подготовьте растворы по крайней мере за один день до дня проведения анализа.
      1. Готовят стерильный фосфатно-солевой буфер (PBS). Разбавляют 100 мл 10х PBS с 900 мл 18,2 МОм H 2 O. Фильтр стерилизовать с фильтром с размером пор 0,2 мкм. Хранить при температуре 4 ° С до использования.
      2. Подготовьте стерильный PBS-глюкозу. Растворить 1,0 г глюкозы в 100 мл PBS. Фильтр стерилизовать с фильтром с размером пор 0,2 мкм. Хранить при температуре 4 ° С до использования.
      3. Приготовьте стерильный 0,1 М цитратный буфер. Растворить 1,2 г лимонной кислоты и 1,1 г цитрата натрия в 100 мл 18,2 МОм H 2 O. Доводят рН до 4,0. Фильтр стерилизовать с фильтром с размером пор 0,2 мкм. Хранить при температуре 4 ° С до использования.
      4. Подготовка исходного раствора он. рesuspend 1,0 мг HE в 1,0 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Осторожно перемешать, аликвоты и хранят при температуре -20 ° С до использования.
      5. Подготовка FITC-меченый стафилококк (S. стафилококк) маточный раствор (2 х 10 9 частиц / мл). Ресуспендируют 10 мг FITC-меченного S. стафилококк в 1,5 мл (или соответствующее количество) PBS. Разделить на три 500 мкл аликвоты и разрушать ультразвуком в соответствии с рекомендациями производителя. Аликвоты и хранят при -20 ° С до использования.
      6. Подготовьте непомеченное S. Исходный раствор стафилококк (2 х 10 9 частиц / мл). Ресуспендируют 100 мг немеченого S. стафилококк в 15 мл (или соответствующее количество) PBS. Разделить на тридцать 500 мкл аликвоты и разрушать ультразвуком в соответствии с рекомендациями производителя. Аликвоты и хранят при -20 ° С до использования.
    3. Подготовить свежие рабочие решения на день анализа.
      1. Подготовка рабочего раствора HE. Передача 10 мклпротаявшая HE раствор 990 мкл PBS-глюкозы. Защита от света и держать на льду до использования.
      2. Подготовка FITC-меченого S. стафилококк рабочего раствора (133,333 частиц / мкл). Передача 70 мкл талой FITC-меченого S. стафилококк раствор 980 мкл PBS. Защита от света и держать на льду до использования.
      3. Подготовьте непомеченное S. стафилококк рабочего раствора (133,333 частиц / мкл). Передача 70 мкл талой немаркированной S. стафилококк раствор 980 мкл PBS. Защита от света и держать на льду до использования.
      4. Приготовьте раствор резкого охлаждения. Добавить 750 мкл 0,4% трипанового синего раствора до 11,25 мл стерильного 0,1 М цитратного буфера. Хранить в бане с ледяной водой до использования.
    4. Есть сертифицированный Phlebotomist забор крови в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения для забора крови.
      1. Нарисуйте кровь в один 4 мл пробирку для сбора крови , содержащей K 2 ЭДТА. Вверт сбора крови трубки в соответствии с инструкциями изготовителя. Хранить пробирку для сбора крови при комнатной температуре на настольном качалке до использования. Используйте эту кровь для полного анализа крови (CBC) с белых кровяных клеток (WBC) дифференциального анализа, описанного в пункте 1.2.1.
      2. Нарисуйте кровь в пробирку для сбора один 4 мл крови, содержащей гепарин лития. Переверните пробирку для сбора крови в соответствии с инструкциями изготовителя. Хранить пробирку для сбора крови при комнатной температуре на настольном качалке до использования. Используйте эту кровь для анализа моноцитов и гранулоцитов фагоцитоза и активности OB, описанной в шаге 2.
  2. Определить количество бактерий (то есть, золотистого стафилококка) , которые будут необходимы для завершения анализа для каждого образца.
    1. С помощью гематологического анализатора для выполнения CBC с WBC дифференциального анализа на крови, как описано в инструкции изготовителя. Запишите количество лейкоцитов (в клетках / мл),% нейтрофильных и%Значения моноцитов.
    2. С помощью уравнения ниже, чтобы определить, нейтрофилами и моноцитов подсчета для каждого образца.
      Количество нейтрофилов (в клетках / мл) =% × Нейтрофильная WBC (в кл / мл)
      Количество моноцитов (в клетках / мл) =% моноцитов × WBC (в кл / мл)
    3. С помощью уравнения ниже, чтобы определить количество фагоцитов для каждого образца и количество фагоцитов, присутствующих в 100 мкл образца.
      Количество фагоцита (в кл / мл) = количество нейтрофилов (в клетках / мл) + моноцитов (в кл / мл)
      Количество фагоцитами в 100 мкл = (кол       -цикл фагоцитоза (в клетках / мл)) / 10
    4. С помощью приведенного ниже уравнения для определения количества бактерий (то есть, золотистого стафилококка) , которые необходимы для каждого образца и количество ФИТЦ-меченым S. стафилококк или немаркированные S. стафилококк рабочего раствора (133,333 частиц / мл) , которые должны быть добавлены в каждую пробирку.
      Примечание: целевые бактерии: соотношение фагоцитов составляет 8: 1.
      Количество бактерий требуется =Количество фагоцитами в 100 мкл × 8
      Объем FITC или немаркированные рабочего раствора , необходимого (в мкл) = (количество бактерий , необходимых) / (133,333 частиц / мкл)

2. Выполните Пробирной

  1. Подготовьте всю кровь для анализа.
    1. Для каждого участника и контрольной трубки, используют наконечник пипетки расширенной длины, чтобы передать 100 мкл цельной крови из пробирки для сбора крови лития гепарином на дно помеченную 12 х 75 мм трубки. Заменить колпачки.
      Примечание: Будьте осторожны, чтобы избежать попадания крови на сторонах мм трубок 12 х 75.
    2. Используйте микропипетки добавить 10 мкл рабочего раствора ОН к трубам, помеченных красными чернилами и "H", в том числе трубки управления HE. Заменить колпачки и вихревую на короткое время.
    3. Инкубируйте все пробирки в водяную баню C 37 ° в течение 15 мин. Затем сразу же передавать все пробирки на водяной бане со льдом в течение 12 мин.
      Примечание: Используйте открытую металлическую стойкуи осторожно встряхните стойку каждые 5 минут, чтобы убедиться, что трубы быстро и адекватно нагретый или охлажденный.
  2. Добавить бактерии (например, золотистого стафилококка) для образца и контрольных трубок.
    1. Используйте микропипетки , чтобы добавить соответствующее количество (рассчитанное на шаге 1.2.4) немеченого S. стафилококк рабочий раствор в пробирки , помеченных красными чернилами и "H", в том числе трубки управления HE. Заменить колпачки и вихревую на короткое время.
    2. Используйте микропипетки , чтобы добавить соответствующее количество (рассчитанное на шаге 1.2.4) из FITC-меченого S. стафилококк рабочий раствор в пробирки , помеченных черными чернилами , и "F", в том числе трубки управления FITC. Заменить колпачки и вихревую на короткое время.
    3. Vortex "кровь только" контрольную пробирку, но не добавляют ни тип бактерий (то есть, золотистого стафилококка) к нему.
    4. Инкубируйте все пробирки в водяную баню C 37 ° в течение 20 мин. Используйте открытую металлическую стойку и аккуратно встряхнуть стойку каждые 5 минутчтобы гарантировать, что трубки быстро и адекватно нагреваются. После инкубационного периода, немедленно передать все пробирки на водяной бане со льдом в течение 1 мин.
  3. Вымойте клетки.
    1. Используйте ретранслятор пипетки для добавления 100 мкл охлажденного льдом раствора закалочной во все пробирки. Заменить колпачки, вихревые кратко, а затем инкубируют все пробирки на льду в течение 1 мин.
    2. Используйте ретранслятор пипетки для добавления 1 мл охлажденного льдом PBS во все пробирки. Vortex кратко, а затем добавьте еще 2 мл охлажденного льдом PBS во все пробирки и заменить колпачки. Центрифуга все пробирки в течение 5 мин при температуре 4 ° С и 270 мкг, а затем аспирата супернатант.
    3. Повторите шаг 2.3.2 один раз (всего 2 стирок).
  4. Подготовка проб для проточной цитометрии.
    1. Используйте ретранслятор пипетки для добавления 50 мкл охлажденного льдом эмбриональной телячьей сыворотки во все пробирки. Кратко вихрь все пробирки.
    2. Перенесите все трубки к соответствующему каруселью и использовать автоматизированное рабочее место клеточного препарата гемолитика с красной крови челл (RBC) лизировать и фиксирующих реагентов для лизиса эритроцитов и фиксируют лейкоциты, как описано в инструкции изготовителя WBC.
    3. После того, как автоматизированная ячейка гемолитика подготовки рабочей станции запуска завершена, оберните трубы в алюминиевую фольгу и хранить в 4 ° C холодильнике до проточной цитометрии анализа может быть выполнена.

3. Проточная цитометрия Приобретение

  1. Настройка системы проточной цитометрии.
    1. Разминка проточной цитометрии системы, как указано в инструкции, предоставленной изготовителем. Затем проверьте уровни реагентов и емкости для отработанных чернил. При необходимости заполнения резервуаров с реагентами и / или опустошить бак отходов.
    2. Используйте "Clean Panel", чтобы запустить систему цикл очистки. Затем запустите выравнивание и проверки струйная флуоросферы, и убедитесь, что коэффициент половинной пика вариации (HPCV) для каждого детектора находится в пределах заданного диапазона, описанного в контроле качества (QC) протоколы предоставлены производствар.
  2. Создание анализа конкретных приобретение и установка приборов протоколов.
    1. Создание опробования конкретных протоколов приобретения для фагоцитоза и ОВ активности анализов.
      Примечание: протоколы сбора данных, описанные здесь, могут быть адаптированы для использования на любой проточной цитометрии с синим лазером (488 нм), фильтр (530/30) для FITC, и фильтр (575/26) для HE.
      1. Открыть проточной цитометрии программного обеспечения сбора системы и создать "новый протокол".
      2. Выберите "FL1 параметр" для анализа фагоцитоза (FITC) и "FL2 Параметр" для анализа OB активности (HE).
      3. Создание графики (т.е. вперед разброс [FSC] против бокового рассеяния [SSC] точка участка, FL1 гистограмма, FL2 гистограмма) , необходимых для приобретения.
      4. Создание полигональных областей для WBC (белых кровяных телец), гранулоцитов и моноцитов популяции на FSC против SSC участка и создают линейные области на гистограмме FL1 и FL2. Установить & #34; Stop Count "50000 событий для WBC ворот.
      5. Сохраните протоколы с именами анализа конкретных.
    2. Создание опробования конкретных инструментов настройки протоколов для фагоцитоза и ОВ активности анализов.
      1. Перетащите "опробования специализированные протоколы сбора" (определенные в пункте 3.2.1) из "Resource Explorer," к "Acquisition Manager" на проточной цитометрии программного обеспечения сбора системы.
        Примечание: Информация об Добавленный таким образом всегда будет появляться в конце списка.
      2. Введите информацию об образце в рабочем списке, и сохранить рабочий список.
      3. Удалить Контрольный образец трубки от 4 ° C холодильник и дать им возможность уравновешивания до комнатной температуры в течение 15 мин. Затем кратко вихрь каждого образца контрольную пробирку.
      4. Используйте "опробования специализированные протоколы сбора" , определенные в пункте 3.2.1 , чтобы запустить отрицательный контрольный образец (то есть, только кровь) и положительный контрольобразцы (т.е. HE контроль, контроль FITC) через систему проточной цитометрии. Обзор гистограмм и отрегулируйте ФЭУ (ФЭУ) напряжений в FITC и фикоэритрин (РЕ) каналов по мере необходимости.
      5. Vortex контрольные образцы и передавать их в проточной цитометрии системы карусельного типа в соответствии с порядком на рабочем листе. Затем поместите каруселью в камере для отбора проб и нажмите на кнопку Цитометр панели "Пуск", чтобы получить данные для контрольных образцов. Сохранить "XXX Настройка Pro" Настройка протокола.
  3. Приобретать образцы исследования в системе проточной цитометрии.
    1. Удалите исследование образцов трубки от 4 ° C холодильник и позволяют уравновешиваться до комнатной температуры в течение 15 мин.
    2. В то время как образцы уравновешивания, перетащить предопределенные исследования конкретных протоколов сбора в пространстве рабочего списка, чтобы сделать рабочий список проекта.
    3. Убедитесь, что "протокол настройки" связан с &# 34;. Анализа конкретных Настройка протоколов " , определенные в пункте 3.2.2 Затем введите идентифицирующую информацию (например, название исследования, рисовать номер, номер посещения, с учетом ID) для каждой трубки в рабочий список.
    4. После 15-минутного периода уравновешивания, вихревых исследуемых образцов и передавать их в проточной цитометрии системы карусельного типа в соответствии с порядком на рабочем листе. Затем поместите каруселью в камере для отбора проб и нажмите на кнопку Цитометр панели "Пуск", чтобы получить данные для исследуемых образцов.
    5. Обзор качества данных путем проверки эффективности РБК лизиса и WBC распределения клеток подгруппы, пропорции, абсолютного количества и интенсивности флуоресценции на отчет панели каждого образца.
      Примечание: Качество данных считается приемлемым, если все эти критерии находятся в пределах своих предопределенных пределах. Если все критерии не выполняются, образец должен быть переработано.
    6. Чистый и выключить систему проточной цитометрии. Храните проточной цитометрииданные о двух разных дисках компьютера, чтобы предотвратить случайную потерю данных.

Анализ 4. Данные

  1. Провести анализ фагоцитоза.
    1. Объединить все фагоцитоза (т.е. F-меченого) выборка данных и список управления режима (LMD) файлы данных в одну папку. Затем откройте проточной цитометрии программного обеспечения для анализа и перетащить файлы в выборочном пространстве.
    2. Установите WBC, гранулоцитов, моноцитов и Лимфоцит ворота.
      1. Дважды щелкните на имени файла, чтобы открыть любой из "контрольных образцов FITC". Используйте раскрывающиеся меню, чтобы установить ось х на "FSC" и "линейный" и у-ось "ССК" и "линейный".
      2. Используйте "селектор многоугольник ворота", чтобы подготовить ворота общей WBC населения.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте включить все клетки по краям диаграммы. Добавьте эти ворота "WBC".
      3. Дважды щелкните на "новый WBC ворота" и использовать нижепреведенноговниз меню, чтобы установить ось х на «FSC» и «линейной» и у-ось "SSC" и "Линейная".
      4. Используйте "селектор многоугольник ворот", чтобы установить "гранулоцитарный ворота" и моноцитов ворота ", а затем с помощью" эллиптическую селектора ", чтобы установить" лимфоцит ворота ". На каждом ворота соответственно. Перетащите" данные ворот (%) "в сторону так, чтобы клетки легко просматривать.
    3. Установите "фагоцитоза положительные ворота» и «фагоцитоз Отрицательная ворота» для населения гранулоцитов и моноцитов.
      1. Дважды щелкните на "контрольном образце FITC", используемый на шаге 4.1.2.1. Затем нажмите на "Гранулоцита ворота" и использовать раскрывающиеся меню, чтобы установить ось х, чтобы "FL1" и "Log" и у-ось "ССК" и "линейный".
      2. Используйте "квадрат селектора" установить "фагоцитоза отрицательный ворота" и "фагоцитоза ПостулироватьАйв ворота ".
        Примечание: Так как контрольные образцы FITC не получали бактериальных (т.е. золотистого стафилококка) раздражители, все клетки должны быть теоретически фагоцитоза отрицательным. Используйте по своему усмотрению при установлении границ для этих групп населения.
      3. Повторите шаг 4.1.3.1 и 4.1.3.2 Шаг для населения моноцитов.
    4. Добавить статистика для "% от WBC", "интенсивности флуоресценции" и "% фагоцитоза позитивных клеток» для популяций гранулоцитов и моноцитов.
      1. Нажмите на кнопку "контрольного образца FITC", используемый на шаге 4.1.2.1. Выделите "гранулоцитарный ворота", а затем нажмите на кнопку "Рабочее пространство" и "Добавить статистику". Выделите "геометрическое среднее" и "FL1 Log" и нажмите кнопку "Добавить". Затем выбрал "Частота от родительского" статистики и нажмите кнопку "Добавить".
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это даст интенсивность флуоресценции (среднее геометрическое) всего населения и гранулоцитовпроцент WBC (родителя), которые являются гранулоциты.
      2. Нажмите на кнопку "контрольного образца FITC", используемый на шаге 4.1.2.1. Выделите "фагоцитоза положительные ворота» населения гранулоцитов, а затем нажмите на кнопку "Рабочее пространство" и "Добавить статистику". Выделите "геометрическое среднее" и "FL1 Log" и нажмите кнопку "Добавить". Затем выберите "Частота из Родитель" статистики и нажмите кнопку "Добавить".
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это даст интенсивность флуоресценции (среднее геометрическое) фагоцитарной положительных гранулоцитов и процент гранулоцитов (Parent), которые являются фагоцитоз положительными.
      3. Повторите шаг 4.1.4.1 и 4.1.4.2 Шаг для населения моноцитов.
      4. Нажмите на кнопку "контрольного образца FITC", используемый на шаге 4.1.2.1. Выделите "лимфоцит ворота", а затем нажмите на кнопку "Рабочее пространство" и "Добавить статистику". Выделите "Частота от родительского" статистики и нажмите кнопку "Добавить".
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этодаст процент WBC (родителя), которые являются лимфоциты.
      5. Выделите все ворота и статистики, созданных в контрольном образце FITC, используемый на стадии 4.1.2.1. Перетащите их в "Все образцы" на панели "Группа" в верхней части экрана.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет применять эти параметры для всех исследуемых образцов.
      6. Сохранить и название работы в качестве WSP-файла в той же папке, содержащей папку LMD.
    5. Отрегулируйте отдельные ворота образца.
      1. Нажмите на "первой пробы" в наборе данных и убедитесь, что WBC ворот соответствующим образом подходит распределение клеток на экране. Если этого не произойдет, нажмите и перетащите края ворот отрегулировать ворота для этого образца. Нажмите на кнопку "стрелка вправо" (т.е. "˃") , чтобы перейти к следующему образцу. Повторите этот шаг, пока не будут рассмотрены все образцы.
      2. Нажмите на "WBC ворота" для первой выборки в наборе данных и убедитесь, что "Гранulocyte ворота "," моноцитов ворота ", и" Лимфоцит ворота "для каждого образца надлежащим образом соответствовать распределение ячеек на экране. Выполните необходимую настройку. Нажмите на кнопку" стрелка вправо "(т.е." ˃ ") , чтобы перейти к следующему образцу ,
      3. Повторите шаг 4.1.5.2 до всех образцов были рассмотрены. Затем нажмите кнопку "Сохранить".
    6. Отображение данных в электронной программе электронных таблиц.
      1. Нажмите на иконку "Table Editor" в верхней части экрана. Нажмите кнопку "Изменить", "Ключевые слова" и "$ Date", чтобы включать дату отбора проб на конечную таблицу. Затем нажмите кнопку "Изменить", "Ключевые слова" и "@ SAMPLEID1", чтобы включить идентификацию выборки на окончательную таблицу. Повторите эти действия для "@ SAMPLEID2", "@ SAMPLEID3", и "@ SAMPLEID4".
      2. Настройка экрана "Table Editor" и экран "образец", чтобы они могли одновременно просматривать на экране компьютера. Селект любой "образец" на листе примера. Затем перетащите каждый статистический интерес к "Table Editor".
        1. Перетащите "Frequency. Из Родитель" статистики, перечисленных в разделе "Гранулоцита ворота" к "Таблица Editor". Тип "% WBC как гранулоциты" в столбце "Имя" в "Table Editor".
        2. Перетащите "среднее геометрическое" статистики, перечисленные под "Гранулоцита ворота" к "Таблица Editor". Тип "Геометрическая средняя флуоресценция, гранулоциты" в столбце "Имя" в "Table Editor".
        3. Перетащите "Frequency. Из Родитель" статистики, перечисленных в разделе "гранулоцитов / фагоцитоза положительные ворота" к "Таблица Editor". Тип "% фагоцитоза Положительные Гранулоцитов" в столбце "Имя" в "Table Editor".
        4. Перетащите "Среднее геометрическое" статистики, перечисленных в разделе "гранулоцитов / фагоцитоза положительные ворота" к йе "Редактор таблиц". Тип "Геометрическая средняя флуоресценция, фагоцитоз Положительные гранулоциты" в столбце "Имя" в "Table Editor".
        5. Перетащите "Frequency. Из Родитель" статистики, перечисленных в разделе "моноцитов ворота" к "Таблица Editor". Тип "% WBC как моноциты" в столбце "Имя" в "Table Editor".
        6. Перетащите "среднее геометрическое" статистики, перечисленные под "моноцитов ворота" к "Таблица Editor". Тип "Геометрическая средняя флуоресценция, моноцитов" в столбце "Имя" в "Table Editor".
        7. Перетащите "Frequency. Из Родитель" статистики, перечисленных в разделе "моноциты / фагоцитоза положительные ворота" к "Таблица Editor". Тип "% фагоцитоза Положительные моноцитов" в столбце "Имя" в "Table Editor".
        8. Перетащите "Среднее геометрическое" статистики, перечисленных в разделе "моноциты / Phagocytosis положительные ворота "к" Таблица Editor ". Тип" Геометрическая средняя флуоресценция, фагоцитоз моноцитов Позитивный "под" "колонке" Имя таблицы Editor ".
        9. Перетащите "Frequency. Из Родитель" статистики, перечисленных в разделе "ворота" лимфоцитов в "Таблица Editor". Тип "% WBC в лимфоцитах" в столбце "Имя" в "Table Editor".
      3. Перетащите параметры, видимые в таблице "Редактор", пока они не расположены в порядке предпочтения.
      4. Нажмите кнопку "Сохранить". Затем нажмите кнопку "Создать таблицу" для отображения данных в формате электронной таблицы. Нажмите на кнопку "Сохранить как", чтобы сохранить и имя работы в качестве .xlsx файла.
  2. Повторите шаг 4.1 для анализа OB активности (то есть, H-меченый) образцы и контролировать LMD файлы данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте заменить все ссылки на фагоцитоз со ссылками на OB деятельности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Продолжительное и интенсивное упражнение оказывает глубокое воздействие на врожденной иммунной функции, в том числе естественной функции клеток-киллеров, макрофагов цитокинами ответ на вирусные инфекции, и гранулоцитов и моноцитов фагоцитоза и OB деятельности. Многочисленные исследования показывают, что гранулоцитов и моноцитов фагоцитоза значительно возрастает после окончания упражнений, отражающие воспаление, вызванное повреждением мышц и метаболических потребностей. В противоположност...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Эта рукопись представляет собой протокол шаг за шагом для определения двух показателей гранулоцитов и функции моноцитов. Мы определили несколько шагов, которые имеют решающее значение для успеха этого анализа. Одним из таких шагов является ледяная баня инкубационный, который происходит непосредственно перед добавлением бактерий. Тщательное охлаждение всех образцов позволит свести к минимуму влияние температуры на фагоцитоз и OB деятельности. Другим важным шагом является добавление бактерий к каждому образцу. A 8: 1 бакт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы признать Zack, Кейси Шу Джона и Линн Cialdella-Kam за их помощь в ходе оптимизации этой процедуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
12 пробирок по 75 мм, с колпачкомVWR20170-579Вам потребуется 2 пробирки на образец ("H" и "F") плюс 3 пробирки на партию (для пробирного контроля; "F", "H" и "Только кровь").
PBS (10x), pH 7,4Life Technologies70011-044
Крышка бутылки 0,2 &; m фильтр из ацетата целлюлозы (емкость 500 мл)Fisher Scientific09-741-07 
Глюкоза, порошокLife Technologies15023-021
Лимонная кислота (безводная, протестирована клеточная культура, протестирована культура растительных клеток)Sigma-AldrichC2404-100G
Цитрат натрия трехосновной дигидратSigma-AldrichS4641-25G
Дигидроэтидий (Гидроэтидин) (HE)Life TechnologiesD11347
Диметил сульфоксид (ДМСО) AnhydrousLife TechnologiesD12345
Staphylococcus aureus ( Древесный штамм без белка А) Биочастицы, флуоресцеиновый конъюгат (FITC)Life TechnologiesS2851
Staphylococcus aureus ( Древесный штамм без белка А) Биочастицы, немаркированныйLife TechnologiesS-2859
Trypan Blue Solution, 0,4%Life Technologies15250-061
4,0 мл вакутайнер, содержащий 7,2 мг K2EDTA, высушенный распылениемVWRBD367861Вам потребуется 1 пробирка для сбора крови K2EDTA на образец.
Вакутайнер 4,0 мл, содержащий 68 единиц гепарина лития и гепарина США, покрытый аэрозолемVWRBD367884Вам потребуется 1 пробирка для сбора крови с гепарином лития на образец.
COULTER Ac· T 5diff CPBeckman Coulter6605705т.е., гематологический анализатор
COULTER Ac· T 5diff ОполаскивательBeckman Coulter8547167
COULTER Ac· T 5diff FixBeckman Coulter8547171
COULTER Ac· T 5diff WBC LyseBeckman Coulter8547170
COULTER Ac· T 5diff Hgb LyseBeckman Coulter8547168
COULTER Ac· T 5diff Калибратор Cal BeckmanCoulter7547175
COULTER Ac· T 5diff Control PlusBeckman Coulter7547198
AcT 5diff DiluentBeckman Coulter8547169
200 &микро; l Наконечники для пипеток увеличенной длиныVWR37001-526
Изолированная сковорода для льдаVWR89198-980Для ледяной водяной бани.
Открытый металлический штатив для пробирокVWR60916-702
Фетальная бычья сывороткаLife Technologies26140-111
Рабочая станция TQ-PrepBeckman Coulter6605429e., автоматизированная рабочая станция по приготовлению лизиса
клеток Система реагентов ImmunoPrepBeckman Coulter7546999e., система реагентов RBC lyse/WBC fix
Система проточной цитометрии Cytomics FC500 MCL с программным обеспечением CXPBeckman Coulter626553
IsoFlow FluidBeckman Coulter8547008
COULTER CLENZBeckman Coulter8546929
Flow-Check Fluorospheres Beckman Coulter6605359e., выравнивание и проверка флюосфер
FlowJo FlowJoFlowJoi., программа для анализа проточной цитометрии
Excel SoftwareExcelт.е., программа для работы с электронными таблицами
Microsoft

Ссылки

  1. Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725(2014).
  2. Knab, A. M., et al. Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists. Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).
  3. Konrad, M., et al. The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).
  4. Nieman, D. C., et al. Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling. Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).
  5. Nieman, D. C., et al. Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running. Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).
  6. Tidball, J. G. Inflammatory cell response to acute muscle injury. Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).
  7. McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
  8. Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human. PLoS One. 8, e68963(2013).
  9. McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro. J Vis Exp. , (2014).
  10. Nieman, D. C., et al. Immune response to obesity and moderate weight loss. Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).
  11. Nieman, D. C., et al. Immune function in female elite rowers and non-athletes. Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).
  12. Ichii, H., et al. Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes. Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).
  13. Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).
  14. Gruger, T., et al. Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro. Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).
  15. Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PLoS One. 7, e32621(2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Staphylococcus aureusFITC
Измерение гранулоцитов и моноцитов Фагоцитоз и окислительный взрыв активности в крови человека
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.