Воссоздание Basic митотических веретен в сферических эмульсионных каплях

Summary

Сборка и позиционирование митотического веретена зависят от объединенных сил, создаваемых динамикой микротрубочек, моторными белками и сшивающими агентами. Здесь мы представляем наши недавно разработанные методы, в которых геометрическое удержание сферических эмульсионных капель используется для восстановления основных митотических веретен снизу вверх.

Abstract

Сборка, позиционирование и ориентация митотического веретена зависят от объединенных сил, создаваемых динамикой микротрубочек, моторными белками микротрубочек и сшивающими агентами. Растущие микротрубочки могут генерировать толкающие силы, в то время как деполимеризующиеся микротрубочки могут преобразовывать энергию от сжатия микротрубочек в тянущие силы, когда они прикреплены, например, к корковому динеину или хромосомам. Кроме того, моторные белки и диффузионные сшивающие агенты внутри веретена вносят свой вклад в архитектуру веретена, соединяя и скольжение антипараллельных микротрубочек. В естественных условиях оказалось трудно разгадать относительный вклад отдельных игроков в общий баланс сил. Здесь мы представляем методы, которые мы недавно разработали в наших усилиях по восстановлению основных митотических веретен снизу вверх in vitro. С помощью микрофлюидных методов центросомы и тубулин инкапсулируются в капли водно-масляной эмульсии, что приводит к образованию геометрически ограниченных (двойных) микротрубочек астр. Благодаря дополнительному введению кортикально закрепленного динеина, направленных микротрубочек плюс-энда и диффузионных сшивателей, эта система используется для восстановления веретенообразных структур. Представленные здесь методы обеспечивают отправную точку для воссоздания более полных митотических веретен, позволяя детально изучить вклад каждого отдельного компонента и получить интегрированное количественное представление о силовом балансе в митотическом веретене.

Introduction

В процессе митоза хромосомы реплицированному генома организованы на экваторе клетки, чтобы обеспечить равномерное распределение сестринских хроматид над вновь образованных дочерних клеток. позиционирование Хромосома и сегрегация опосредуется их прикрепления к веретена микротрубочек, происходящих из двух противоположных центросом. В дополнение к обеспечению верного распределения хромосом, ориентация митотического веретена также диктует клеточного деления плоскости ^1. Согласованное направленность клеточного деления имеет важное значение во многих стадиях развития и для тканей гомеостаза ^2. В частности, регулируется позиционирование шпинделя митотический может привести к асимметричному распределению клеточного содержимого или даже производят дочерние клетки различных размеров ^2. Митотическое сборка шпинделя и ориентация начинается в профазе и оркестровке сложным взаимодействием между сотрудничающими и антагонизма к Силе генераторов ^3,4. Сформированные силы состоят из ЬПр и маневровые тяговые силы. Эти силы возникают как от шпинделя контактов с клеткой коры, а также внутри шпинделя, и может быть порождена динамики микротрубочек, а также молекулярных моторов и сшивающих (рисунок 1).

Толчок силы могут быть сформированы, когда микротрубочки растут против жестких структур, таких как клетки коры головного мозга. В зависимости от общей силы сопротивления , выделяемое внутри системы, это может привести к репозиции митотического веретена (низкие силы) или вызвать микротрубочек потери устойчивости или катастрофы (высокие силы) ^5-8. Величина силы , которая может быть сгенерирована путем нажатия зависит от длины микротрубочек, так как длина является серьезным фактором , определяющим микротрубочки коробления ^9. Кроме того, микротрубочки , которые происходят от одного центросоме может выдвинуть против другого центросоме, механизм , который был предложен для привода центросом разделения в начале профазы ^3,10.

В рекламеусловие для толкая сил , возникающих при растущих микротрубочек, микротрубочки концы контактирование клетки коры головного мозга также может посредничать силы тяги ^11. Исследования , проведенные в нескольких лабораториях, показали , что контролируемое активность корковых генераторов сила требуется для асимметричного расположения митотических веретен в естественных условиях ^1. Существенное значение для этих тянущих сил Кора локализованы цитоплазматический динеин (далее именуемые как "динеин"), минус-конец , направленный микротрубочек мотор белка ^8,12,13. Так , например, в почкующихся дрожжах, боковые взаимодействия коркового динеин с микротрубочками результате решетки в зависящих от двигателя микротрубочки , скользящей по коре ^14. Тем не менее, корковых тянущие силы также могут быть получены с помощью способности динеин с образованием конечных пользователей на вложения в деполимеризации микротрубочек ^8. Энергия , вырабатываемая микротрубочек усадки может привести к силам , которые , как правило , на порядок выше (~ 50 пН (ссылка ¹⁵ )) , чем силы , генерируемых отдельными моторными белками (~ 7-8 пН (см. ^16)). Конец на присоединение корковой динеин к деполимеризующих микротрубочек способствует позиционированию веретена у почкующихся дрожжей ¹⁷ и C. Элеганс ^13. Независимо от того , как мотор-зависимого скольжения и деполимеризация микротрубочек приводом корковых тянущие силы могут сотрудничать или взаимно исключают друг друга в естественных условиях является в настоящее время неизвестной.

В дополнение к микротрубочек толкающих сил и динеина опосредованную корковых тянущих сил, центросома позиционирование управляется изнутри митотического веретена многочисленными другими белками. Кинезин-5 двигателей, например, существуют как тетрамеры , которые могут поперечному сшиванию антипараллельных интерполяционных микротрубочек, что приводит к образованию наружу раздвижными сил ^18-20. Члены кинезином-5 двигателя семейства требуются для центросом разделения и сборки биполярного веретена во всех эукариот изученных, за исключением C. Элеганс (обзор в ссылке ^21).

Кроме того, диффундирующие сшиватели о / PRC1 семейства Ase1 также известны локализовать перекрывающихся микротрубочек области интерполяционных микротрубочек в естественных условиях и в пробирке ^22-27. Силы , порожденные Ase1 приводом расширения перекрытия микротрубочки области достаточно велики , чтобы уравновешивать кинезином-14 , опосредованных скользящие силы в пробирке ^28,29. В клетках, Ase1 / PRC1 необходим для стабильного формирования перекрывающихся микротрубочек областей в шпинделе midzone ^25-27,30, предполагая , что силы , порожденные диффундирующих сшивающих может внести существенный вклад в шпинделе организации. И, наконец, силы из митотического хроматина и митотическую Кинетохоры влияют на сборку шпинделя и позиционирование с помощью различных путей ^3. Так как эти компоненты не являются частью восстанавливающей анализов, описанных здесь, они не будут обсуждаться более подробно.

jove_content "> Различные теории существуют о том , как различные молекулярные компоненты и силы , описанные выше , сотрудничают в сборки веретена и позиционирования, но мы все еще ​​далеки от количественного понимания. Помимо экспериментов в живых клетках, эксперименты в пробирке с очищенными компонентами обеспечивают мощный маршрут , чтобы помочь достичь этой цели. Здесь мы представляем визуальный путеводитель по адаптированной и расширенной версии недавно опубликованных методов (Roth и др. ^31), в котором основные шпиндели реконструированной в капельки эмульсии вода-в-масле, начиная с минимальное количество компонентов. Используя микрожидкостных методы, сферические капли образуются с размерами, которые сопоставимы с делящихся клеток. в пределах этих капель, очищенные центросомы и тубулина могут быть объединены с целью изучения динамики астры микротрубочек, формирования сил и астры-астры взаимодействий. по введение корковых (например, динеин) и между полярными (например, Kinesin-5 / Ase1) Форс-генераторы, мывоссоздавать все более сложные веретенообразной структуры , подобные , которые начинают напоминать ситуацию в естественных условиях.

Protocol

1. Приготовление микрофлюидики Chips

Примечание: Для снизу вверх изучения сборки веретена, сферические капельки эмульсии типа вода-в-масле используются. Эти водные микрокапель, отделенные от окружающей масляной фазы монослоем фосфолипидов и поверхностно-активного вещества. Эти эмульсии капли производятся внутри Микрожидкостных полидиметилсилоксана (PDMS) фишек. Изменения в канале геометрии и скорости потока могут быть использованы для размера мелодия капельным. В микрожидком конструкции, описанной здесь, капли генерируются с диаметром около 15 мкм, чтобы имитировать геометрическую удержание митотической клетки млекопитающего.

1. Photomask Проектирование и изготовление пресс-форм
   1. Дизайн фотошаблона , содержащий три входных каналов ^31. Впускной канал 1 соединяется с водной фазой, содержащей содержимое капельные (смотрите раздел 3 "Восстановление влагосодержания основные микротрубочки астры"). Впускной канал 2 подключается к масляной фазе (смотри раздел 2.1 "Липиды / масло-PHAсебе препарат "). Используйте впускной канал 3 для разбавления эмульсии капли с дополнительным липидного / масло-фазе до наблюдения ( по желанию) (рис 2а-б).
      Примечание: Все входные каналы следуют пылевой фильтр (лабиринте 2 мкм каналов) для улавливания пыли, частиц PDMS и () агрегатов белков - и , чтобы предотвратить их блокируя микроканалов (рис 2d). Каналы имеют ширину 75 мкм и липидный / масляной фазы и водной фазы встречаются на широком перекрестке 12,5 мкм , где эмульсионного капли будут образовывать (рис 2С).
   2. Заказать и получить отпечатанные фотошаблонов на пленочной подложке, с отрицательной полярности (фотошаблон будет темно с прозрачными проектируемых сооружений).
2. Mold Изготовление
   1. Изготовить формы спин-покрытия СУ-8 3025 фоторезиста на 4 дюйма кремниевой пластины с помощью спин-(для нанесения покрытий 500 оборотов в минуту, 10 секунд, а затем 1800 оборотов в минуту, 45 сек) в среде чистой комнаты.
   2. Expose СУ-8 с покрытиемкремниевой пластины через фотошаблон. Разработка вафель в соответствии с инструкциями изготовителя для создания каналов ~ толщиной 40 мкм.
3. Создание микрожидком чип
   1. Смешайте 10 частей PDMS предварительно полимера с 1 частью отверждения агента (всего ~ 40 гр) в лодке типа судна, используя пластиковый шпатель. Место ПДМС, содержащие лодочки сосуд в вакуумной камере в течение ~ 30 мин. для удаления пузырьков воздуха. Заверните алюминиевую фольгу вокруг пресс-формы, чтобы сформировать чашку с ~ 1 см выступающими вверх края.
   2. Налить PDMS (~ 75% от общего объема) в пресс-форму, оставить в вакуумной камере еще ~ 30 мин. (Для удаления пузырьков воздуха) и отверждения в течение 1 ч при 100 ° С в печи.
   3. Спин-пальто остальные ПДМС на предметные стекла (5 сек при 200 оборотах в минуту, затем 30 с при 4000 оборотов в минуту), с последующим отверждением в течение 1 ч при 100 ° С. Удалите пыль из предметные стекла с использованием сжатого воздуха / N ₂ -поток, предварительная очистка не требуется.
      Примечание: В PDMS покрытые предметные стекла могут быть использованы как для микрофонаrofluidic щепы и поточное ячейками (смотри также 2.2).
   4. Осторожно лишить PDMS от пресс-формы с помощью лезвия бритвы и пробивки отверстий (0,5 мм для впускных отверстий, 0,75 мм для выхода) .Corona-лечить микрожидкостных чип и PDMS покрытием из предметного стекла с использованием лабораторного коронный поверхности протравливатель в течение нескольких секунд ,
   5. Поместите микрожидкостных чип на стекле (каналы лицевой стороной вниз) и выпекать чипы о / п при 100 ° С (рис 3а). Магазин микрожидкостных чипов в течение нескольких месяцев в пыли окружающей среды.

2. Микрожидкостных Setup

Примечание: вода-в-масле, как капельки эмульсии генерируются с использованием установки микрофлюидики и Микрожидкостных чипов, описанных выше. Состав липидной / масло-фазы можно варьировать в зависимости от потребностей эксперимента. Масляные солюбилизироваться липиды образуют монослой на границе раздела вода-масло с их полярными головными группами, с которыми сталкивается вода внутри. Для того, чтобы белки-мишени(Например , динеин) до границы капельным, низкие количества биотинил-фосфатидилэтаноламина (биотинил-PE) , липиды могут быть добавлены. Это позволяет набор биотинилированного динеин (смотрите раздел 4.1 "Dynein ориентации к капельной коры") через стрептавидин-опосредованной мультимеризацию. Капельки стабилизированы путем добавления поверхностно-активного вещества и хранится в ПДМС с покрытием проточных кювет.

1. Липиды / масло Подготовительная фаза
   1. Смешать хлороформ-растворили 1,2-dioleoyl- Sn- глицеро-3-фосфо-L-серин (DOPS) и биотинил-PE липиды в 4: мольном соотношении 1 в стеклянной пробирке с использованием стекла пипец (широко прополоскать пипец хлороформом до того использование). Готовят всего ~ 250 мкг липидов, что приводит к концентрации липидов в ~ 0,5 мг / мл.
   2. Тщательно высушить липидной смеси с N ₂ -потока и затем в вакуумной камере в течение ~ 1 ч. Растворение высушенных липидов в минеральном масле и 2,5% поверхностно-активного вещества до 0,5 мг / мл (~ сделать 500 мкл).
   3. Поместите образец липида / масло вУльтразвуковая ванна и гомогенат, в течение 30 мин. при 40 кГц, чтобы полностью растворить липиды.
2. Подготовка Flow-элементная
   1. Спин-пальто PDMS (смотри также раздел 1.3) на покровных стекол (5 сек при 200 оборотах в минуту, затем 30 секунд при 4000 оборотах в минуту) и предметные стекла (5 сек при 100 оборотах в минуту с последующим 30 с 1500 оборотов в минуту) для того, чтобы внести деньги однородный слой ПДМС.
      Примечание: Для получения оптимального качества изображения, не забудьте использовать покровные стекла с толщиной, которая соответствует объектива микроскопа. В этом случае: 1,5 (~ 0,17 мм).
   2. Вылечить PDMS покрывающей стекла и стеклянные слайды в течение 1 ч при 100 ° С в печи. Сделать потока-клетки, тесно интервал (~ 2 мм) тонкие ломтики лабораторной герметизирующей пленки (~ 3 мм в ширину) на PDMS с покрытием из стекла горками. При хранении в среде без пыли, каналы, которые не были использованы могут быть использованы в другое время.
   3. Накройте проточного клетки с покровным и печатью PDMS покрытием путем плавления лабораторной герметизирующей пленки ~ 1 мин. при температуре 100 ° C, нажмитемягко (рис 3в). Закройте лаборатории Уплотнительная пленка -стекло-границы с Valap (рис 3в). Магазин флоу-клетки в течение нескольких месяцев в пыли окружающей среды.
3. Кубок Подготовка PDMS
   1. Для длительной обработки изображений, сделать чашку PDMS, пробивкой отверстие диаметром 4 мм в ломтиком PDMS (~ 3 мм толщиной)
   2. Корона-лечения PDMS срез и покровного стекла с покрытием PDMS и поместите их поверх друг друга. Выпечка чашки PDMS o / n (при 100 ° С) (рис 5а).
4. Формирование Эмульсия-капелька
   1. Монитор образование капель на перевернутой светлого поля микроскопа. Подключить регулятор давления к микрожидком чип с использованием PEEK трубы (диаметр: 510 мкм (наружный) и 125 мкм (внутренний)) (рис.3). Заполните микрожидкостных чипы полностью с липидной / масло-фазы из впускного отверстия 2.
   2. Внедрение MRB80 на основе водную фазу (смотрите раздел 3 "О восстановлении основных микротрубочек астры4;) от впускного 1. Контроль капельно-с изменяющимся давлением липид / масляными фазы и водной фазы для создания капель ~ 15 мкм в диаметре (рис 3b).
      Примечание: С помощью этой установки, используйте ~ 800 мбар для липид / масло-фазы и ~ 200 мбар для водной фазы, чтобы создать капли требуемого размера.
   3. После получения желаемого капельно-и необходимое количество (~ 10 мкл на пробу), собирают капли с выходным каналом и нагрузки в проточной ячейке (полностью заполнить проточные ячейки).
   4. Закройте концы потокорегулирующими клетки тщательно с использованием Valap (неполностью замкнутом проточном-клетки могут привести к обширному движению капель, затрудняя изображению их). Кроме того, предотвратить образование пузырьков воздуха, что приводит к движению капель.
   5. Промыть PEEK трубки широко изопропанолом до и после использования для предотвращения образца перекрестного загрязнения и засорения.

3. воссоздании Основные микротрубочек Астры

Примечание: содержание капельке можно варьировать в зависимости от потребностей эксперимента. Все буферы MRB80 на основе (80 мМ ТРУБЫ, 1 мМ EGTA, 4 мМ MgCl ₂ (рН 6,8)), и все образцы готовят на льду. В общем, капли всегда содержат центросомами, компоненты, необходимые для полимеризации микротрубочек, система удаляющего кислород и блокирующего агента (смотри раздел 3.1). Микротрубочек сила-генераторы и необходимые кофакторы и ТАРГЕТИНГ факторы могут быть включены при желании (см разделы 4.1 и 4.2).

1. Общие настройки для формирования астры в капель эмульсии (рисунок 3d)
   1. Готовят глюкозооксидазы (20 мг / мл глюкозооксидазы в 200 мМ DTT и 10 мг / мл каталазы) Смешать заранее и хранить в виде небольших аликвот при -80 ° С.
   2. Приготовьте 'блокирующий' смесь , содержащую каппа-казеин, бычий сывороточный альбумин (BSA), твин-20 и флуоресцентный декстран (как нейтральный маркер) (таблица 1) заранее и хранить в небольшом aliquoТ.С. при -80 ° С. Предотвращение повторных циклов замораживания-оттаивания. Убедитесь, что все компоненты свежеприготовленной.
   3. Очищают центросомами от лимфобластного линий KE37 клеток человека , как описано у Moudjou и др. ³² и хранить при температуре -150 ° C в виде небольших аликвот.
   4. Растаяйте центросомами при комнатной температуре и инкубировали при 37 ° С в течение ~ 20 мин. перед использованием, чтобы обеспечить надлежащее нуклеации микротрубочек.
      Примечание: Это способствует нуклеации микротрубочек во время эксперимента.
   5. В то же время, подготовить 'анализа смеси', содержащий тубулин (флуоресцентной и «темный»), гуанозинтрифосфат (GTP), система поглотитель кислорода (глюкоза, глюкоза-оксидаза, каталаза и 1,4-дитиотреитола (DTT)), молекулярная сила генераторы (например , микротрубочки , двигатели / перекрестно сшивающие агенты), аденозинтрифосфата (АТФ) и АТФ-регенерирующей системы (фосфоэнолпируват (РЕР), пируват - киназы (ПК) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ)) на льду (смотри таблицу 2).
   6. Предварительно охладитьультрацентрифуга с воздушным приводом ротора на льду. Спин вниз образец в охлажденном ультрацентрифуга с воздушным приводом ротора (30 фунтов на квадратный дюйм в течение 3 мин) .Add предварительно подогретым центросомах (оптимизировать количество центросомах стремиться капель, содержащих 1-2 центросомами).
   7. Использование комбинированной смеси для получения капель эмульсии с использованием методов, описанных в разделе 2.3.

Компонент	концентрация Фото	Конечная концентрация (в тесте)	объем	Комментарий
Декстран-647nm	75 мкМ	3,75 Um (0,6 мкМ)	5 мкл
κ-казеина	20 мг / мл	12,5 мг / мл (2 мг / мл)	62,5 мкл
Твин-20	5%	0,375% (0,06%)	7,5 мкл
БСА	200 мг / мл	12 мг / мл (1,9 мг / мл)	6 мкл
MRB80			19 мкл
			100 мкл окончательным	Хранить в 2 мкл аликвоты

Таблица 1: Составляющие 'блокирующего Mix' Составляющими блокирующего смеси, необходимые для восстановления шпиндельных-подобных структур в капель эмульсии вода-в-масле.. Описание см Основной текст раздела 3 "О восстановлении основных микротрубочек астры". Для получения дополнительной информации о материалах приведена в разделе "Материалы табл.

Компонент	Фото concentratioN	Конечная концентрация	объем	Комментарий
Блокирующий смесь			1,6 мкл
Tubulin	500 мкМ	30 мкМ	0,6 мкл
Tubulin-488/561	50 мкМ	3 мкМ	0,6 мкл
GTP	50 мМ	5 мМ	1,0 мкл
Dynein-TMR	178 нМ	30 нмоль	1,7 мкл
стрептавидином	5 мг / мл	200 нМ	0,4 мкл	Для коркового Dynein только
Kinesin-5	1,6 мМ	80 нМ	0,5 мкл
АТФ	25 мМ	1 мМ	0,4 мкл	Для двигателей только
PEP	0,5 М	25,6 мМ	0,5 мкл	Для двигателей только
PK / LDH	800 U / U 1100	23 U / 32 U	0,3 мкл	Для двигателей только
Ase1-GFP	400 нМ	80 нМ	2,0 мкл
глюкоза	2,5 М	50 мМ	0,3 мкл	Последний шаг
Глюкозо-оксидазы	50x	1.0x	0,3 мкл	Последний шаг
MRB80			Икс
			9 мкл Окончательный

Таблица 2: Составляющие «пробирной Микс». Составляющие для анализа смеси, необходимой для восстановления шпиндельных-подобных структур в капель эмульсии вода-в-масле. Описание см Основной текст раздела 3 "О восстановлении основных микротрубочек астры". Для получения дополнительной информации о материалах, см Материалы табл.

4. Введение Шпиндель сборочно-факторы

Примечание: В анализах , описанных здесь, зеленый флуоресцентный белок (GFP) , -tagged усеченный вариант S. CEREVISIAE динеин использовался, искусственно димеризована с помощью амино-концевой глутатион S-трансферазы (GST) -tag ^33. Этот белок очищают с помощью аффинной метки, который содержит две копии с белком А IgG-связывающий домен. Вариант, используемый здесь, помечен меткой тетраметилродамин (ПСР) на карбокси-концевой и N-концевой SNAP-тег используется для biotinylate очищенных белков. Для получения дополнительной информации построить см Рот и др ^31. для получения более подробной очистки, см RecK-Петерсон и др. ^33. GFP-биотин-динеин-TMR могут быть направлены на капельной-коры за счет образования биотин-стрептавидин комплексов , которые связывают динеин с биотинил-PE липиды (рис 3e).

1. Dynein Ориентация на дроплета Cortex
   1. Включить GFP-биотин-Dynein-TMR в 'анализа смеси' (см таблицу 2) в конечной капельной-концентрации 30 нМ. Включают стрептавидин в 'анализа смесь' (см таблицу 2) в конечной капельной-концентрации 200 нМ.
      Примечание: Dynein зависит от АТФ гидролиза для пошагового движения на микротрубочки. Таким образом, включают АТФ и систему АТФ регенерирующим (содержащий ПЭП и PK / LDH) в 'анализа смеси' (смотри таблицу 2).
      Примечание: Рекомбинантный полной длины S. pombe GFP-Cut7 (кинезином-5) был любезно предоставлен в Diez лаборатории (Центр молекулярной биоинженерии, Technische Universitat Dresden, Дрезден, Германия), см. Рекомбинантный полный лength гистидин-меченый S. pombe GFP-Ase1 был любезно предоставлен из Янсонс лаборатории (Wageningen University, Вагенинген, Нидерланды) и добавляли к смеси для анализа '' при концентрации при 80 нМ.

5. обработки изображений

Примечание: В ходе эксперимента рост микротрубочек можно регулировать путем изменения температуры. При выборе условий формирования изображения, компромиссы должны быть сделаны между высоким качеством изображения и возможностью контроля шпинделя в сборе для долгого периода времени. Для сравнения кинетики формирования шпинделя при различных условиях, капли с различным содержанием могут быть смешаны и отображены в том же самом канале потока.

1. Основные параметры обработки изображений
   1. Изображение в контролируемой температурой окружающей среды с использованием закрытой камере. Визуализация отдельных микротрубочек после ~ 30 мин при 26 ° С. В то время как изображения, способствуют росту микротрубочек путем повышения температуры до ~ 30 ° C.
      Примечание: settings ниже являются специфическими для нашей установки микроскопа и может меняться в зависимости от различных систем и различных операционных программного обеспечения. Все анализы, описанные здесь, изображаются на моторном перевернутой системе с конфокальной головкой вращающимся диском и управляется с помощью программного обеспечения обработки изображений, таких как Андор IQ 3.1. Получить все изображения с целью иммерсионным 100X и EMCCD камеры.
   2. Набор лазеров возбуждения 488, 561 и 641 нм с интенсивностью примерно ~ 10%. Перейти к панели '' захвата, нажмите на вкладку и слайд-лазер 'AOTF' интенсивности до 10%. Нажмите на ссылку "записи", чтобы сохранить настройки.
   3. Для г -projections, возьмите стеки с интервалом в 1 мкм (~ 20 изображений / капельных). Перейти к основному "камеры" панели, нажмите на кнопку "редактировать г 'и установите' Z 'шага до 1.0. Нажмите на" Далее ", чтобы сохранить настройки.
   4. Установить максимальную линейную ЭМ-усиления, нажав на вкладке "камеры" на панели "захвата" и переместите ползунок усиления EM 300. Установить экспозициюраз в 200 мс в той же вкладке. Нажмите на ссылку "записи", чтобы сохранить настройки.
2. Живая съемка
   1. Для живого изображения, с помощью элементов управления программного обеспечения делают Z -projections каждые 2 мин. на протяжении 1-2 ч за счет снижения времени экспозиции до ~ 100 мс. (как описано в разделе 5.1.4) и увеличить Z -intervals до 2 мкм (как описано в разделе 5.1.3). Установите временные ряды в главной панели "камеры", нажмите на кнопку "повтор т 'и установить до 2 мин. интервалы в течение общего времени 120 мин.
   2. Для живых анализов, используйте чашку PDMS вместо обычного проточные ячейки, чтобы гарантировать, что капли, как неподвижна, насколько это возможно.
3. В сочетании с изображениями из 2-х условий
   1. Образуют капли, используя микрофлюидики и хранить на верхней части ПДМС с покрытием предметное стекло на льду. Это предотвращает нуклеации микротрубочек, пока второй набор капель не сформирован. Перед тем как производить второй набор капель, промойте PEEK трубки и микрожидкостных чип сMRB80 и полностью наполнить микрофлюидальный чип с липидной / масло-фазы.
   2. Сформировать капли с и без флуоресцентного декстрана (или с использованием декстрана с различными флуорофоров длины волны) для того, чтобы различать между каплями с различными цветами. После получения второй партии капель, осторожно смешать капли с помощью пипетки и загружают в единый поток клеток / PDMS чашки.
4. Анализ изображений.
   1. Анализ изображений с помощью Фиджи (программное обеспечение с открытым исходным кодом доступны в Интернете) ^34.
   2. Для живых тестов, конвертировать стеки в hyperstacks используя 'изображение' - 'hyperstacks' - 'стека HyperStack'. Установите правильное число Z-срезах и временных рамок.
   3. Для того чтобы сделать Z-проекции, выберите 'изображение' - 'стеки' - 'Z-проект ". Выберите проекцию 'Макс' интенсивности.
   4. Для 3D-реконструкций, сначала перейдите в "образ" - "Свойства" и установить правильный пиксель, пиксель, глубина высота системы воксельном и фрAME интервалы. Нажмите 'OK'. Выберите 'изображение' - 'стеки' - '3D-проект ", установите флажок" интерполировать "флажок и нажмите кнопку" OK ".

Results

Методы, представленные в предыдущих разделах, позволяют воссоздание шпинделей-подобных структур с возрастающей сложностью, используя геометрическую удержание капель эмульсии вода-в-масле. В этом разделе описываются типичные результаты, которые качественно демонстрируют способность этих анализов.

Во время митоза, когда биполярный шпиндель собран, клетки округлить до формирования сфер с диаметром примерно 15 мкм, как измерено в клетках человека. Эта характерная форма митоза клетка обеспечивает геометрическую границу , что и ограничивает и направляет размер шпинделя и ориентацию ^35,36. Микрожидком методы, обеспечивают уровень геометрического конфайнмента , который точно напоминает ситуацию , наблюдаемую в живых клетках и , следовательно , допускает снизу вверх реконструкцию митотических веретен в пробирке.

(рис 4а, левая панель). Примерно через 20-30 мин, первые микротрубочки становятся видимыми и центросома диффузия становится ограниченным, как микротрубочки растут против коры во всех направлениях. Астры с микротрубочками промежуточной длины (примерно 50% от диаметра капель) может (стерически) отталкиваются друг от друга, с микротрубочками толкающих друг против друга, остальные Центросомы и кора головного мозга. Это приводит к типичной 'биполярного' веретеновидной договоренности с двумя центросомах противостоящие друг другу (фиг.4А, средняя панель). Когда микротрубочки растут дольше, чем ~ 50% от капельной-диамметр, центросомы получить отодвинута еще дальше на противоположных границах капельке, с микротрубочек , растущих вдоль коры капли (рис 4а, правая панель). Важно отметить, что темпы роста микротрубочек в этих анализах, очень чувствительны к температуре и как тубулина-концентрации. Эти параметры будут, следовательно, сильно влияет на время, когда зарождение сначала наблюдается и при установившихся позиции астра достигаются.

В клетках коры головного мозга тянущие силы возникают за счет формирования несущих вложений между микротрубочки плюс-концами и Cortex-ассоциированных динеин. В клетках животных, эта ассоциация зависит от комплекса Gαi / LGN / NuMA, который является мишенью для плазменной мембраны с помощью N-концевого миристоилированию из Gαi ^1. В этих восстанавливающих анализах, требование комплекса Gαi / LGN / NuMA обойдена путем прямого соединения с динеин биотинилированных липидов черезформирование биотинстрептавидин-биотин комплексов. Эти облигации являются относительно стабильными (K _D ~ 10 ^-14 М) ³⁷ и быстро образуют ( как правило , в течение 10 мин после образования эмульсии капель до микротрубочек зарождение становится очевидным) (4б). При наличии корковой динеин, Центросомы обычно сохраняют более центральное положение, в то время как при отсутствии динеин, Центросомы выталкиваются в противоположные стороны коры капли (рис 4в). Мы Причиной этого является результатом двух эффектов, которые предотвращают и противодействия микротрубочек толкая сил. (1) Dynein непосредственно способствует микротрубочек катастрофами, ограничивая тем самым длину микротрубочек и предотвращения чрезмерного микротрубочек потери устойчивости, и (2) корковых тянущие усилия приводят к чистому центрирующих сил на отдельных астры ^8, которые противодействуют астра-астры силы отталкивания.

Диффундирующего сшивающий Ase1 индуцирует Forces , которые имеют тенденцию к увеличению зоны перекрытия анти-параллельных микротрубочек ^29. В соответствии с этим, в присутствии Ase1 (и отсутствие динеин) Центросомы находятся близко друг к другу с Ase1 локализацией в комплекте интерполяционных микротрубочек (рис 4г). Члены семьи кинезином-5 приводов центросом разделение, обеспечивая толкающее усилие внутри шпинделя (см введение). В присутствии Cut7 (С. pombe кинезином-5 ортолог), Центросомы выталкиваются на противоположных сторонах капель эмульсии, даже в присутствии Ase1 (рис 4д). Объединив корковых и между полярными генераторов силы, уровень сложности может быть дополнительно увеличена в этих экспериментах, в конечном итоге приводит к исчерпывающему пониманию биполярной сборки митотического веретена. Подробное количественное описание этих результатов будет доступна в будущем (Roth и др., Рукопись в процессе подготовки).

(рис 5в). Это облегчает изучение как стационарного поведения и шпинделя кинетики сборки. Объединив капельки с различным содержанием в том же образце, то есть, например, можно непосредственно сравнить центросоме установку и монтаж шпинделя кинетику в каплях с и без корковых генераторов силы (рис 5b).

Рисунок 1: Силы , действующие на веретена Несколько силовоспроизводящую молекулы действуют на микротрубочки митотического веретена , чтобы способствовать формированию шпинделя и позиционирования.. Микротрубочки, которые растут в клетки коры порождают толкающую силу на центросоме. Кортикальная динеин (фиолетовый) захватывает деполимеризации микротрубочек и создает тяговое усилие на центросомах. В шпинделе, Kinesin-5 / Cut7 моторные белки обеспечивают наружу сила скольжения на анти-параллельных микротрубочек, в то время как сшиватели семейства PRC1 / Ase1 порождают противоположную наружу сила скольжения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры ,

Рис . 2: Микрожидкостных Chip Design (A) Дизайн 4 - дюймовый фотошаблон , содержащий 4 микрожидкостных чипов. (В) подробное представление одной микросхеме. Чипсы содержат один выпускной канал и три входных каналов с последующим пылевого фильтра. Впускной канал 1 содержит водную фазу, канал 2 липидного / масло-фазы и канал 3 может быть использован для разбавления образовавшиеся капли с дополнительной липид / масло-фазы. (C) , детальное представление о соединении , где липид / масло-фаза (прибывающий сверху и снизу) встречается с водной фазой (поступая с левой). На стыке, капли будут образовываться и течь в направлении выпускного канала справа. (D) Подробное представление пылевого фильтра с 2 мкм каналами. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рис . 3: Методология Водно-в-масле Droplet формирования (А) Микрожидкостных чип и микрофлюидики трубки на ярко-поле микроскопа. Оба Водо- и липид / масло фазные трубы соединены с чипом входных отверстий 1 и 2, соответственно. (B) Ограничение на микрофлюидики чипе , где влаго- и липидные / масляные фазы встречаются. Изменяя давление, капли размер можно регулировать. (C) Дизайн PDMS покрытием потока клеток. После загрузки капель в проточной камере, открытые концы закрыты дополнительными Valap. (D) Схема формирования капель. Капельки используются для инкапсулирования центросомами, тубулина и дополнительные компоненты, необходимые для формирования веретена. (Е) Схема корково-динеин адресности. Биотинилированных (Bio) динеин предназначен для биотинилированных липидов через стрептавидином (ГНТО).

Рис . 4: репрезентативные результаты шпинделя Reconstitutions с возрастающей сложностью (А) Максимальные проекции интенсивности капель , содержащих два центросомами , показывающие примеры коротких, промежуточных и длинных микротрубочек. Центросомах и микротрубочки визуализировали добавлением 10% HiLyte-488 меченых тубулина. Шкала бар = 10 мкм. (B) Локализация GFP-биотин-динеин-TMR в отсутствие (-, слева) и наличие (+, справа) стрептавидин (полоской). (C) микротрубочек позиционирование астры в отсутствие (-, слева) или в присутствии (+, справа) корковых GFP-биотин-динеин-TMR. (D) микротрубочек астры (левая панель, грееп) позиционирование в присутствии Ase1 (средняя панель, красный). (E) микротрубочек астры (левая панель, зеленый) позиционирование в присутствии Ase1 и Cut7 (кинезином-5) (средней панели, красный). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Визуализация Aster позиционирования Динамика в пробирке (A) Конструкция чашки PDMS , что позволяет визуализацию капель в течение нескольких часов.. (Б) создания, хранения и обработки изображений капель (передача) , содержащие различное содержание, иллюстрированные отсутствии (слева) включение (справа) флуоресцентного декстрана (Alexa 647). (C) одной плоскости изображения в 60 мин покадровой (2 минутные интервалы) взяты из г-стека (2 мкм) расстояния от объявленияroplet содержит один центросому. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Методы, описанные здесь, присутствующие в последнее время усилия для восстановления основных митотических веретен в капельки эмульсии вода-в-масле. Изучение сборки веретена в пределах геометрических границ обеспечивает многочисленные преимущества. Важные механизмы обратной связи существуют между микротрубочек митотического веретена и геометрических ограничений, в которых они собраны. Микротрубочки может генерировать толкая силы, когда они растут в геометрической границы, что может привести к смещению митотического веретена. Кроме того, растет в физический барьер может вызывать микротрубочек катастрофах. Кроме того , сборка шпинделя в пределах ограниченной геометрии может привести к постепенному истощению отдельных компонентов, таких как тубулин, в свою очередь , непосредственно влияет на скорость роста микротрубочек ^36. Все эти существенные детерминанты шпиндельного узла, которые могут быть исследованы с помощью анализов, описанных здесь.

Описанные анализы очень чувствительны к небольшой концентрации differeNCES компонентов капельке. Это случай для тубулина, где незначительные различия концентрации может привести к или слишком медленно или слишком быстрого роста микротрубочек. В этом случае, микротрубочки темпы роста часто могут по-прежнему быть скорректировано путем регулирования температуры в течение первой ~ 30 мин эксперимента. Митотическое сборка шпинделя и позиционирование также очень чувствительны к изменениям концентрации (корковый) силовых генераторов. Это, вероятно, зависит от концентрации, чистоты и активности очищенных компонентов и должна быть тщательно титруют для каждого вновь очищенного белка.

Кроме того, некоторые компромиссы должны быть сделаны в настройках обработки изображений, в зависимости от характера анализа. Первоначально высокие уровни растворимых флуоресцентных димеров тубулина затрудняют изображения отдельных микротрубочек. Поскольку микротрубочки становятся длиннее и растворимым тубулина медленно истощаются, отношение сигнал-шум постепенно становится все выше и позволяет визуализацию индивидуаль микротрубочки. В отличие от установок с открытыми системами, геометрическое ограничение предотвращает обмен флуоресцентных молекул и компонентов системы поглотитель кислорода внутри объемного резервуара, что приводит к значительным обесцвечиванием. Специально для контроля сборки веретена и позиционирование в течение долгого времени, требуется изображение с низкой интенсивности света, даже при наличии мощной системы удаляющего кислород.

Эти методы позволяют снизу вверх воссоздание упрощенных шпинделя подобных структур в лабораторных условиях . В дополнение к компонентам , представленных здесь, и многие другие факторы , как было описано , чтобы влиять на формирование биполярного веретена, позиционирование, ориентацию, шейпинг, ³ и т.д.. Эта система может быть расширена для изучения индивидуальных и комбинированных эффектов дополнительных генераторов силы. Важный вклад в формирование веретена, которые в настоящее время отсутствуют в этой системе являются митотических хромосомах. Митотический хроматин было показано,формирование прямого шпинделя (1) chromokinesins , который может генерировать так называемый "полярно-выталкивания силы ^'3, (2) формирование градиента RanGTP хроматином связанного RanGEF RCC1 ^38, (3) Кинетохоры , которые могут взаимодействовать с (деполимеризующим ) микротрубочки ³⁹ и (4) сама хроматина, которая может функционировать в качестве механической пружины в-между противоположными микротрубочек ^40.

Наконец, описанная система в настоящее время обеспечивает ограниченную временную и пространственную контроль за деятельностью и локализацию вводимых силовых генераторов. В клетках, многие шпинделей факторы сборки локализуются в определенных отсеках или активны в течение ограниченного временного окна. Ярким примером может служить деятельность динеин, которая специфически обогащается на задней стороне C. Элеганс одноклеточные стадии эмбриона содействовать асимметричный позиционирование шпинделя и деление клеток. В этой системе, мы в настоящее время изучает возможность имитации такого тemporal и асимметричные методы деятельности с использованием заимствованных из опто-генетических методов. Кроме того, как это имеет место для C. Элеганс эмбрионов и клеток с жесткой клеточной стенки, многие клетки не сгонять в митозе. Форма геометрической заключения будет иметь существенное влияние на силы , действующие на шпинделе ^41. Поэтому он будет иметь важное значение для восстановления узла шпинделя и позиционирования в несферических капель , а также, потенциально с использованием более сложных микрожидкостных систем , которые позволяют обработка и хранение эмульсии капель ^42,43. Наконец, в тканях, клетка-клетка и клетка-сигнализации субстрат и крепления обеспечивают внешние сигналы, которые могут быть переведены на направленный ориентации шпинделя, как это часто наблюдается в эпителиальных клетках и стволовых клеток. Все эти специализированные аспекты не были приняты во внимание в этом текущем исследовании , и может обеспечить будущие задачи по созданию в сторону более в естественных условиях -как reconstitutions митотического веретена АССАМБЛЕЯLY и позиционирование.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<сильный>1. Получение микрофлюидных чипов
Фотошаблон (Фотошаблон на пленочной подложке)	Selba S.A. Switzerland
SU-8 3025	MicroChem
Silicon wafer (4-дюймовая кремниевая пластина p/Boron < 1-0-0>10-20 Ω-см, 500-550 μ m, SSP, с 2 плоскостями)	WRS Materials	4P0SSP-005
Прядильная машина для нанесения покрытий	Polos	SPIN150I
PDMS преполимер RVT615 A+B	Lubribond	9481
Коронный протравитель	Электротехнические изделия	BD-20ACV
2. Микрофлюидная установка
Название<	strong>Company	Номер в каталоге	>Комментарии
DOPS (1,2-диолеол-sn-глицеро-3-фосфо-L-серин)	Avanti Polar Lipids	840035
биотинил ПЭ (1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-( биотинил))	Avanti Polar Липиды	870285
Хлороформ	Сигма-Олдрич	650498
Стеклянные трубки
Стеклянные трубки
Вакуумный насос	Laboport	KNF
Вакуумная камера	Kartell	Полипропилен Вакуумный эксикатор
Минеральное масло	Sigma-Aldrich	M5904
Поверхностно-активное вещество (Span80)	Sigma-Aldrich	85548
Ультразвуковой аппарат	Branson	M2800H
Покровные			24 мм x 60 мм, толщина 1,5
Стеклоподъемники			26 мм x 76 мм
Перфоратор	Harris Uni-Core	135840/135841/135843
Лабораторная герметизация пленка	Парапленка
Валап (вазелин, ланолин, парафин расплавленный в равных концентрациях)			Самодельный
Светлопольный микроскоп	Leica	PMIRB	Достаточно было бы любого инвертированного светлого поля
Регулятор давления	Fluigent	MFCS-FLEX-4C-1000
PEEK Tubing	Cluzeau Info. Лабо, Франция
Микрофлюидные флаконы (Tubes Micrew 0,5 мл и 1 мл)	VWR, Нидерланды
3. Восстановление формирования и позиционирования шпинделя
Name	Company	Номер в каталоге	Комментарии
Dextran-647 нм (Dexten, Alexa Fluor 647, 10 000 МВт, анионный, поправимый)	Life Technologies
Tween-20	Sigma-Aldrich
BSA - Сывороточный альбумин крупного рогатого скота	Sigma-Aldrich
Глюкоза (D-(+)-Глюкоза)	Sigma-Aldrich	G8270
Глюкозо-оксидаза (Глюкозооксидаза из Aspergillus niger)	Sigma-Aldrich	G6125
DTT (DL-дитиолтейтол)	Sigma-Aldrich	646563
Каталаза (Каталаза формы бычьей печени)	Sigma-Aldrich	C9322
Tubulin (Тубулин из головного мозга крупного рогатого скота)	Cytoskeleton Inc.
Тубулин-488/561 (HiLyte-488/Родамин меченый тубулин из свиного мозга)	Cytoskeleton Inc.
ГТФ (гуанозин-'5-трифосфат, гидрат соли натрия)	Sigma-Aldrich	51120
κ-казеин (κ-казеин из бычьего сывороточного молока)	Sigma-Aldrich	C0406
Airfuge (ультрацентрифуга с пневматическим приводом)	Beckman-Coulter	CLS
strong>4. Представляем факторы сборки шпинделя
Name	Company	Номер в каталоге<	strong>Comments
Neutravidin	Sigma-Aldrich	A2666
ATP (Аденозин-'5-трифосфат, гидрат соли динатрия)	Sigma-Aldrich	A9187
PEP (Фосфо(енол)пировиноградная кислота мононатриевая соль гидрат ≥ 97% (ферментативный))	Sigma-Aldrich	P0564
PK/LDH -(ферменты пируваткиназы/молочной дегидрогеназы из мышц кролика)	Sigma-Aldrich	P0294