Интерференция РНК на основе Исследование функции белка теплового шока 27 во время роговичного эпителиального заживление ран

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол использования малой интерферирующей РНК, специфичной для белка теплового шока 27 (HSP27), для оценки функции HSP27 во время заживления эпителиальных ран роговицы. РНК-интерференция является лучшим методом эффективного подавления экспрессии генов для исследования функции белка в различных типах клеток.

Аннотация

Малая интерферирующая РНК (миРНК) является одним из наиболее широко используемых методов РНК-интерференции для кратковременного подавления белок-кодирующих генов. миРНК представляет собой синтетический дуплекс РНК, созданный специально для нацеливания на транскрипт мРНК, чтобы индуцировать его деградацию, и он используется для идентификации новых путей в различных клеточных процессах. Существует несколько сообщений о роли фосфорилированного белка теплового шока 27 (HSP27) в заживлении эпителиальных ран роговицы. В данной работе культивируемые эпителиальные клетки роговицы человека были разделены на скремблированную контрольную группу, трансфицированную миРНК, и группу, специфичную для HSP27, трансфицированную миРНК. Затем были проведены анализы направленного ранения, вызванные царапинами, вестерн-блоттинг и проточная цитометрия. Мы пришли к выводу, что HSP27 играет роль в заживлении эпителиальных ран роговицы, что может включать апоптоз и миграцию эпителиальных клеток. Здесь представлены пошаговые описания пробоподготовки и протокол исследования.

Введение

Роговичные эпителиальные клетки (CECS) непрерывно пролил в слезную пленку, в то время как они одновременно заменяются клетками из лимба и роговицы эпителиальных базальных слоев. ¹ Различные внешние факторы стресса могут вызывать апоптоз и слущивание центральноевропейских стран. ² В белки теплового шока (HSP) высоко консервативны и могут быть разделены на два семейства в соответствии с размером молекул. ³ Наибольший семейство HSP включает HSP90, HSP70 и HSP60, а меньшая семейство включает в себя Hsp27. ⁴ фосфорилирование HSP27 , как известно, играют важную роль в выживании клеток и необходима для миграции клеток из - за роли этого белка в актина ремоделирования. ^5-7 Поэтому мы попытались проверить потенциальную роль Hsp27 фосфорилирования в миграции ЦИК и апоптоза в модели в пробирке эпителиального заживления раны.

РНК-интерференция (RNAi) с использованием либо небольших или коротких интерферирующих РНК (миРНК) имеет GEnerated интерес как фундаментальной и прикладной биологии, так как она потенциально позволяет получить выражение любого интересующего гена быть разобранной. ⁸ При этом мы использовали Hsp27 конкретных миРНК для оценки вклада HSP27 в ЦИК заживление ран и апоптоза. Традиционные методы RNAi для генной нокдаун в клетках используют синтетические дуплексы РНК, в том числе двух немодифицированных 21-мерными олигонуклеотидами, которые могут быть собраны для создания миРНК. RNAi миРНК, которые мы использовали в этом настоящем исследовании является простой и высокоэффективный метод для трансфекции клеток, и этот реагент работает с различными линии иммортализованных клеток. В этом настоящем исследовании мы демонстрируем методы, используемые для этого анализа, в том числе анализа нуля индуцированной направленной раны, вестерн-блоттинга, трансфекции миРНК анализа, иммунофлуоресценции и проточной цитометрии.

Протокол

1. Клеточная линия

1. Культура 10 ⁶ теломеразы-увековечен эпителиальные клетки роговицы человека (HCECs) в 6-луночного планшета (плотность: 1039,9 клеток / мм ²⁾ в 37 ° C инкубаторе с 5% CO ₂ атмосферы с использованием бронхиальную среду для роста эпителий (BEGM) до они достигают 95% слияния.

2. Вестерн-блот-анализ после создания эпителиальной Скретч Раны

1. Серия стерильный 200 мкл пипетки по всей поверхности скважины сливающихся культивируемых HCECs четыре раза в блюдо в кабинете биологической безопасности (класс II, тип А2) и инкубировать HCECs отдельно в 37 ° C инкубаторе с 5% атмосфере СО ₂ в течение 1, 5, 10, 30, 60 и 120 мин.
2. Используйте один 6-луночного планшета для шести различных образцов в зависимости от времени инкубации после роговичного эпителиального ранению.
3. Промыть раненным HCEC монослоев три раза 1x PBS, а затем добавляют 2,0 мл BEGM в каждую лунку.
4. Отделить HCECs с использованием 2мл 0,25% трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) на лунку в течение 5 мин, центрифуге при 900 х г в течение 5 мин в 15 мл пробирку, и аспирата трипсин-ЭДТА с использованием 1 мл пипетки.
5. Приостановка HCECs с 1 мл 1x PBS и передавать их в 1,5 мл трубки.
6. Центрифуга HCECs при 10000 мкг в течение 15 секунд и аспирата 1x PBS с использованием 1 мл пипетки.
7. Ресуспендируют HCECs в 100 мкл охлажденного льдом буфера для лизиса (10 мМ Трис, 10 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 25 мМ NaF, 2 мМ Na ₃ VO _4, 1 мМ фенилметансульфонилфторид [ФМСФ], ингибиторы протеазы [1 мкМ пепстатина А, 1 мкМ лейпептина и 0,1 мкМ апротинина] и 0,5% Тритон Х-100 [рН 7]) и хорошо перемешать.
8. Инкубируйте клетки в течение 30 мин на льду, чтобы вызвать лизис клеток.
9. Центрифуга лизатов при 4 ° С при 10000 х г в течение 15 мин, а затем передать супернатанты на свежий 1,5 мл пробирки (90 мкл аликвоты) и хранить их при температуре -80 ° С.
10. Определение общей концентрации белка клеточных лизатов с использованием пр Bradfordotein анализ. ⁹
11. Нагрузка 30 мкг общего белка клеточные в акриламидном геле, 10% или 12% для электрофореза додецилсульфата натрия в полиакриламидном геле (SDS-PAGE), а затем электрофоретически перенос разделенных полос белка на нитроцеллюлозных фильтрах с током 200 мА в течение 1 ч при 4 ° с использовать в Вестерн-блот-анализах.
12. Блок нитроцеллюлозный фильтр мембраны с 5% обезжиренным молоком в Трис-буферном солевом растворе с Tween 20 (TBST) в течение 1 часа, добавляют первичный кроличьи поликлональные антитела против нефосфорилированный HSP27 (1: 1000 разведение) или первичный кроличьи поликлональные антитела против фосфорилированного HSP27 (1 : 1000 разбавление) в 5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и инкубируют в течение ночи мембраны при 4 ° с на качалке.
13. Обнаружение иммунореактивных полос с использованием конъюгированного с пероксидазой хрена козьих антител против кроличьего (1: 10000 разведение) в 5% бычьего сывороточного альбумина, после промывки в течение 10 мин 3 раза TBST.
14. Инкубируйте мембраны в вестерн-блоттинга люминола реагентов (6-7 мл на 10 см × 5 см мембраны) в течение 1 мин при комнатной температуре.
15. Удалить мембрану из раствора реагента, удалить лишнюю жидкость с абсорбирующим полотенцем, и место в защитном пластиковом листе.
16. Работая в темной комнате с безопасным светом, поместите покрытый мембраной в кассете пленки с боковой белком лицевой стороной вверх.
17. Поместите рентгеновскую пленку поверх мембраны и подвергают в течение 1 мин.

3. миРНК Трансфекция Анализ ¹⁰

1. HCECs культуре 5 × 10 ⁵ клеток / лунку в 6-луночный планшет в 37 ° C инкубаторе с 5% CO ₂ атмосферы с использованием BEGM , пока они не достигнут 95% слияния.
2. Развести трансфекции реагента (2,5 или 7,5 мкл) с 100 мкл уменьшенные сыворотки среды для трансфекции (коэффициент разбавления составлял 41 или 14.3) и растворения HSP27-специфических и вскарабкался управления миРНК в 100 мкл восстановленного сыворотки среды для создания 10 или 50 нМ HSP27 специфические и пополз управления миРНК.
3. Смешайте 100 мкм; Л раствора киРНК с 100 мкл разбавленного реагента для трансфекции (соотношение 1: 1) и инкубировать смесь в течение 15 мин при комнатной температуре.
4. Добавьте миРНК-липидных комплексов с клетками. Затем через 4 ч Смена носителя для завершения BEGM и инкубировать клетки в течение 2-х дней при 37 ° С.
5. Анализ трансфектированных клеток с помощью вестерн-блоттинга, как описано в разделах 4.1 до 4.7.

4. Вестерн - блот - анализа для миРНК-трансфецированных клеток ¹¹

1. Экстракт HSP27-специфичны и вскарабкался управления миРНК-трансфицировали HCECs в кабинете биологической безопасности с использованием 100 мкл ледяной буфер для лизиса (10 мМ Трис, 10 мМ NaCl, 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 25 мМ NaF, 2 мМ Na ₃ VO _4, 1 мМ фенилметансульфонилфторид (ФМСФ), ингибиторы протеазы, и 0,5% Тритон Х-100, рН 7).
2. Инкубируйте клетки в течение 30 мин на льду, чтобы вызвать лизис клеток.
3. Гранул лизатов при 10000 х г в течение 15 мин, а затем передать супернатанты на свежую 1,5 мл ваннеэс (90 мкл аликвоты) и хранить их при температуре -80 ° C.
4. Определение концентрации белка лизатов клеток с использованием анализа Брэдфорда. ⁹
5. Загружают образцы с равным количеством суммарных белков клеток на акриламидном геле 10% или 12%, подвергают гель на SDS-PAGE, и электрофоретически передавать разделенные полосы белка на нитроцеллюлозные фильтры с током 200 мА в течение 1 часа при 4 ° С до используют в Вестерн-блот-анализах.
6. Блок нитроцеллюлозный фильтр мембраны с 5% обезжиренным молоком в Трис-буферном солевом растворе с Tween 20 (TBST) в течение 1 ч, добавляют первичные антитела против фосфорилированного и нефосфорилированном HSP27 (1: 1000 разведение), фосфорилированного Akt (1: 1000 разведение), нефосфорилированный Akt (1: 1000 разведение, использовали в качестве маркера для выживания клеток), Bcl-2-ассоциированных Х белок (1: 1000 разведение, использовали в качестве про-апоптотических белков) и глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH; 1 : 200 разбавление, использовали в качестве контроля нагрузки) в 5% бычьего сывороточного альбумина (БСА), иинкубировать мембраны в течение ночи при 4 ° С на качалке.
7. Обнаружение иммунореактивных полос с использованием конъюгированного с пероксидазой хрена козьих антител против кроличьего (1: 10000 разведение) в 5% бычьего сывороточного альбумина, после промывки 3 раза TBST, 10 мин каждой промывке.
8. Инкубируйте мембраны в вестерн-блоттинга люминола реагентов (6-7 мл на 10 см × 5 см мембраны) в течение 1 мин при комнатной температуре.
9. Удалить мембрану из раствора реагента, удалить лишнюю жидкость с абсорбирующим полотенцем, и место в защитном пластиковом листе.
10. Работая в темной комнате с безопасного света, поместите покрытую мембрану в пленку кассеты стороной белка лицевой стороной вверх.
11. Поместите рентгеновскую пленку на верхней стороне мембраны и выставить в течение 1 мин.

5. Скретч-индуцированной Направленная Ранение Анализ Оценка миграции клеток ¹²

1. В кабинете биологической безопасности, сделать рану путем перетаскивания стерильной пипетки по всей поверхности скважины сливающихся культурHSP27 конкретных миРНК-трансфицировали или яичница управления миРНК-трансфицировали HCECs.
2. Сразу после ранения, промыть клетки дважды с 1x фосфатным буферным раствором (PBS) и поддерживать их в BEGM культурах в 37 ° C инкубаторе с 5% атмосфере СО ₂ в течение 24 ч после ранения.
3. Сфотографировать HCEC изображений с использованием прямой микроскоп при увеличении 100X 24 ч после ранения и выполнить фоне уплощение с помощью фильтра Команда в области программного обеспечения для анализа изображений.
4. С помощью команды Select измерения, определить область интереса (AOI) с тем же размером многоугольной формы, которые могут охватывать перпендикулярно от конца до конца начальной раны, и определить три различных AOI в раненой области каждого образца.
5. Автоматически подсчитать количество ячеек в каждой области, используя Count / размер опции меню Measure.

6. Проточная цитометрия Анализ Апоптоз

1. Культура HSP27 специфичные миРНК-трансфицировали и контIRNA трансфицируются HCECs , содержащие каждый 10 нМ миРНК в концентрации 5 × 10 ⁵ клеток / лунку в 6-луночные планшеты , пока клетки не достигают 95% слияния в 37 ° C инкубаторе с 5% атмосфере СО ₂ в BEGM.
2. Отделить HCECs с использованием 2 мл 0,25% трипсин-ЭДТА на лунку в течение 5 мин, центрифугируют при 900 х г в течение 5 мин в 15 мл пробирку, и аспирата трипсин-ЭДТА с использованием 1 мл пипетки.
3. Промыть клетки дважды холодным PBS , а затем клетки вновь суспендируют в 1X связывающем буфере (0,1 М HEPES / NaOH [рН 7,4], 1,4 М NaCl, и 25 мМ CaCl ₂₎ при концентрации 10 ⁶ клеток / мл.
4. Передача 100 мкл суспензии клеток (1 × 10 ⁵ клеток) в культуральную пробирку 5 мл.
5. Добавить 5 мкл флуоресцеин изотиоцианат-конъюгированный аннексина V и йодид пропидий 5 мкл.
6. Осторожно вихре клетки и инкубировать их в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
7. Добавить 200 мкл 1х буфера для связывания в каждую пробирку и анализируют клетки потоком Cytometer в течение 1 часа.

Результаты

Выражение фосфорилированного HSP27 значительно увеличилось в 5, 10, и 30 мин после того, как царапины телесных повреждений по сравнению с разматывать HCECs ^13. Вестерн - блот - анализ показал , что экспрессия фосфорилированной HSP27 и фосфорилированного Akt оба были значительно снижены, тогда как экспрессия Bax была значительно увеличена в Hsp27 специфических киРНК-трансфецировали HCECs (рис 1A-E). Выражение фосфорилируется HSP27 был уменьшен на 30% и 40% в 10...

Обсуждение

В настоящем исследовании мы оценили потенциальную роль HSP27 в повреждении эпителия роговицы с использованием подходов in vitro . Критические этапы включали трансфекцию миРНК для нокдауна HSP27 для наблюдения за функцией HSP27 в клетках, подвергшихся стрессу. Примечательно, что в этих экспериментах была выявлена роль HSP27 в миграции эпителиальных клеток и апоптозе во время заживления эпителиальных ран роговицы. В отличие от предыдущих исследований¹⁰ , в которых использовалась специфичная для HSP27 ми...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Шкаф биологической безопасности	CHC LAB Co.Ltd,  Тэджон, Республика Корея	CHC-777A2-06	Класс II, тип A2
Stealth RNAi™ siRNA	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA		RNAi siRNA; скремблированная контрольная миРНК и HSP27-специфичная миРНК
BEGMTM	Lonza, Inc., Walkersville, MD	CC-3171, CC4175	Среда для роста бронхиального эпителия
Ингибитор протеазы	Sigma-Aldrich, Inc., Сент-Луис, Миссури	P8340 ,P7626	1 μ М Пепстатин А, 1 μ М Лойпептин, 0.1 μ Анализ белка M Aprotinin
Bradford	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	#500-0001	Брэдфордский анализ белка
Нитроцеллюлозные фильтры	Амершам, Литтл-Чалфонт, Великобритания	RPN3032D	Западная блоттинговая мембрана
Нефосфорилированный HSP27	Abcam Inc., Кембридж, Массачусетс	ab12351	1:1,000 разведение (Total HSP27)
Фосфорилированный HSP27 (Ser85)	Abcam Inc., Кембридж, MA	ab5594	1:1,000 разведение HSP27 фосфорилировали в реагенте Ser85
Lipofectamine® RNAiMAX	Invitrogen, Карлсбад, Калифорния	13-778-075	Трансфекционный реагент
Фосфорилированный Akt (Ser473)	Технология клеточной сигнализации, Данверс, Массачусетс	No. 4060	Разведение 1:1,000 Akt фосфорилировали в Ser473 (маркер выживаемости клеток)
Нефосфорилированный Akt	Технология клеточной сигнализации, Данверс, Массачусетс	No 4061	Разведение 1:1,000 (общий Akt)
Bcl-2-ассоциированный X-белок	Технология клеточной сигнализации, Данверс, Массачусетс	No 4062	1:1,000 (антиапоптотический белковый маркер)
GAPDH	Santa Cruz Biotechnology, Санта-Круз, Калифорния	No. 4063	1:1,000 маркер контроля нагрузки (ген домашнего содержания)
Пероксидаза-конъюгированные с хреном козьи антикроличьи антитела	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	NCI1460KR	разведение 1:10,000
OPTI-MEM	Invitrogen, Карлсбад, Калифорния	31985	сыворотка для трансфекции
Программное обеспечение для анализа изображений	Olympus, Inc., Токио, Япония	Image-Pro Plus 5.0
Сухое обезжиренное молоко	Carl Roth GmbH + Co. KG, Карлструэ, Германия	T145.2
Tris	Amresco LCC, Inc. Солон, Огайо	No-0497
Хлорид натрия	Amresco LCC, Inc. Solon, OH	No-0241
Шестилуночная культуральная пластина	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	140675	диаметром 35,00 мм / лунка
24-луночная чашка для культуры	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	142475
Орбитальный шейкер	N-Bioteck, Inc., Сеул, Южная	Корея NB1015
Бычий сывороточный альбумин Santa	Cruz Biotechnology, Санта-Круз, Калифорния	sc-2323
BDFACSCantoTM II	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ		Проточная цитометрия
X-Ray Film	Kodak, Рочестер, Нью-Йорк		Медицинская рентгеновская кассета с зеленым экраном 400
реактив западного блоттинга люминолом	Santa Cruz Biotechnology, Санта-Круз, CA	sc-2048
Набор для обнаружения апоптоза FITC Annexin V	BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси	556547