Инженерная Трехмерные эпителиальной ткани Встроенные в внеклеточной матрицы

Summary

Эта рукопись описывает мягкую технику литографии на основе спроектировать единые массивы трехмерных (3D) эпителиальные ткани определенной геометрии, окруженными внеклеточного матрикса. Этот метод поддается широкое разнообразие типов клеток и экспериментальных контекстах и ​​позволяет высокопроизводительного скрининга одинаковых повторностях.

Abstract

Архитектура разветвленных органов, таких как легкие, почки и молочные железы, возникает в процессе развития ветвящегося морфогенеза, который регулируется различными растворимыми и физическими сигналами в микроокружении. Здесь описан метод, созданный для изучения процесса ветвящегося морфогенеза путем формирования инженерных трехмерных (3D) эпителиальных тканей определенной формы и размера, которые полностью встроены во внеклеточный матрикс (ВКМ). Этот метод позволяет формировать массивы идентичных тканей и позволяет контролировать различные факторы окружающей среды, включая геометрию тканей, расстояние между ними и состав ВКМ. Этот метод также может быть объединен с широко используемыми методами, такими как микроскопия с тракционной силой (TFM), чтобы получить больше информации о взаимодействиях между клетками и окружающей их ECM. Протокол может быть использован для исследования различных клеточных и тканевых процессов, выходящих за рамки разветвляющегося морфогенеза, включая инвазию рака.

Introduction

Развитие разветвленных эпителиальных тканей, известных как морфогенеза ветвления, регулируется клеточными происхождения, физических и экологических факторов. В молочной железе, морфогенеза ветвления представляет собой итерационный процесс, посредством которого направляется коллективная миграция клеток создает древовидную архитектуру. Первым шагом является первичное образование бутон из молочных протоков, а затем ветви инициации и удлинения ^1,2. Вторжение ветвей в окружающую строму индуцируется систематическом высвобождении стероидных гормонов в период полового созревания. Новые первичные почки затем начать с концов существующих ветвей, и этот процесс продолжает создавать эпителиальный дерево ^3. Хотя многие важные биохимические сигналы были идентифицированы, полное понимание клеточных биологических механизмов, которые ведут этот сложный процесс развития в настоящее время отсутствует. Кроме того, механистические исследования влияния конкретных киев трудно разобрать из эксперименты в естественных условиях, так как точные пространственно - временные возмущения и измерения часто не представляется возможным.

Трехмерные (3D) методы культивирования, такие как целые культуры органов, первичных органоидов и моделей клеточных культур, являются полезными инструментами для систематического изучения механизмов , лежащих в основе ткани морфогенеза ^4-6. Они могут быть особенно полезны для определения влияния конкретных факторов по отдельности, такие , как механические силы и биохимические сигналы, на различные клеточные поведения, включая миграцию, пролиферацию и дифференцировку. ⁶ сконструированные модели клеточных культур, в частности, легко включить возмущение отдельных клеток и их микроокружения.

Одной из таких моделей культура использует подход на основе микротехнологий для конструирования модели молочных желез эпителиальные ткани с контролируемой 3D-структуры, которые последовательно и воспроизводимо образуют ветви, которые мигрируют в совокупности, когда индуцированное с аppropriate факторы роста. Основным преимуществом данной модели является возможность точного манипулирования и измерения воздействия физических и биохимических факторов, таких как закономерности механических напряжений, с высокой статистической достоверностью. Этот метод, вместе с компьютерного моделирования, уже используется для определения относительных вкладов физических и биохимических сигналов в руководстве нормального развития молочных эпителиальных тканей и других разветвленных эпителий ^7-11. Представленные здесь подробные протокол для построения этих моделей тканей, которые могут быть легко распространены на другие типы клеток и внеклеточного матрикса (ECM), гели, и который служит в качестве потенциального инструмента для тестирования терапевтических средств.

Protocol

1. Приготовление растворов

1. Для приготовления 5 мг / мл раствора инсулина а, разбавить порошкового инсулина запас с 5 мМ соляной кислоты (HCl) в дН ₂ O (500 мг инсулина в 100 мл растворителя). Подготовьте 100 мл растворителя путем добавления 50 мкл концентрированной HCl в 100 мл дистиллированной воды (Dh ₂ O).
2. Для того, чтобы сделать 1x раствор PBS, разбавленных в 10 раз фосфатным буферным солевым раствором (PBS) маточного раствора до 1х с дН ₂ O в стерильных условиях.
3. Готовят полидиметилсилоксана (PDMS) эластомерный раствор следующим образом: смешивают форполимера PDMS вместе с отвердителем в соотношении 10: 1 (вес W).
4. Готовят среду для культивирования клеток следующим образом: до 500 мл исходного Дульбекко в модификации Дульбекко: Питательная смесь F-12 (DMEM / F-12), добавляют 10 мл стерильной эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 500 мкл гентамицина реагента и 500 мкл 5 мг / мл инсулина.
5. Для приготовления 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в растворе 1X PBS, добавляют 1% (мас: V) раствор БСА порошка к 1X PBS, и тщательно перемешать.
6. Для приготовления 4 мг / мл раствора нейтрализованного бычьего типа I коллагена a, добавить 50 мкл 10х сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS) буфера, 30 мкл 0,1 N раствор гидроксида натрия (NaOH), 30 мкл клеточной культуральной среды, и 400 мкл стоковой коллагена к охлажденной 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Смешайте медленно с помощью пипетки вверх и вниз; избегать введения пузырьков. Чтобы удалить пузырьки, коротко центрифугируют смесь при температуре 4 ° С.
7. Приготовьте Фиксирующий раствор разбавлением 16% параформальдегид 1: 4 (по объему) в 1X PBS.
8. Приготовьте раствор ядра маркировки путем разбавления в наличии ядра маркировки раствор 1: 1000 (по объему) в 1x PBS.
9. Готовят 0,3% фосфатным буферном растворе и раствор детергента (PBST) путем смешивания 1x PBS с 0,3% (по объему) моющего средства.
10. Подготовка блокирующего буфера путем разбавления козьей сыворотки 1:10 (по объему), в 0,3% PBST.
11. Подготовка первичного раствора антител для конкретного интересующего белка путем разбавления ПОИмэри антитела (например, кролика против фокусного адгезионная киназа (ФСП)) 1: 200 (по объему) в блокирующем буфере.
12. Готовят вторичный раствор антител путем разбавления флуоресцентного зонда-антитела, конъюгированного (например, козы к антителам кролика) 1: 1000 (об: об) в блокирующем буфере.

2. Получение эластомерных Марки для 3D Micropatterning

Примечание: эластомерные штампы сделаны с PDMS.

1. Сделайте раствор PDMS при том же соотношении, как описано в пункте 1.3 и тщательно перемешать. Поместите смесь в вакуумной камере в течение 15-30 мин, чтобы удалить пузырьки воздуха, которые были введены во время процесса смешивания.
2. Налейте раствор дегазированной в пластиковую взвешивать лодку или чашку Петри, содержащую мастер кремния, который литографически узорной с особенностями желаемой геометрии. Для достижения наилучших результатов лечения решение PDMS при 60 ° С в течение ~ 12 ч.
   Примечание: Мастера кремния высоко настраиваемый; этот протокол использует прямоугольные структуры с размерами 50мкм х 200 мкм х 50 мкм на расстоянии 200 мкм друг от друга. Мастера кремния могут быть изготовлены с использованием стандартных методов фотолитографии. Вкратце, на основе эпоксидной смолы фоторезиста методом центрифугирования покрытием поверх кремниевой пластины. Маска с подробным желаемые функции штамп помещается в верхней части фоторезиста покрытием пластин, который затем подвергают воздействию УФ-излучения. Желаемые характеристики не блокированы маске подвергаются воздействию света и фоторезист в этих местах становится сшитый, в то время как остальная часть фоторезиста покрытия растворима и может быть смыта.
3. После того, как ПДМС затвердеет вокруг желаемых функций на мастер кремния, удалите PDMS и мастер из пластикового контейнера. Аккуратно отделить PDMS от кремниевой пластины и удалить избыток PDMS со всего отпечатанные компоненты, используя чистую лезвия бритвы.
4. Теперь отрежьте PDMS узорной с впечатывается особенностями в отдельные прямоугольные штампы (~ 8 мм х 5 мм) с лезвием бритвы. Храните эти функции стороной вверх в НКУ100 мм диаметр чашки Петри.
5. Кроме того, используйте раствор PDMS, описанный в шаге 1.3, чтобы сделать опоры для прямоугольных штампов.
6. С помощью устройства для нанесения покрытия спина, распространение ~ 2-3 г раствора PDMS ровным слоем на 100-мм диаметра чашки Петри и вылечить PDMS в течение ~ 12 ч при 60 ° С, как в пункте 2.1. Затем, используя лезвие бритвы, вырезать тонкий слой PDMS на прямоугольники (~ 5 мм х 2 мм).
   Примечание: Две опоры необходимы для каждого PDMS штампа сделали в шаге 2.3. Опоры могут быть сохранены в 100 мм чашки Петри диаметром, который содержит PDMS штампы.
7. До того, как PDMS штампы и опоры могут быть использованы для культивирования клеток, стерилизуют путем погружения в 70% этанола и сухой с использованием аспиратора в шкафу биологической безопасности (капот культуре клеток).

3. Подготовка 3D эпителиальной ткани

1. В шкафу биологической безопасности, добавить каплю приблизительно 50 мкл 1% BSA в PBS в верхней части каждого штампа. Поместите капельку покрытую марки при 4 ° С для минимама 4 ч, чтобы гарантировать, что БСА адсорбируется на поверхности штампа.
2. Отберите БСА раствор из марок PDMS.
3. Промыть поверхности штампов дважды с клеточной культуральной среды (50 мкл на каждую промывку за штампом должно быть достаточно), аспирацией после каждой промывки.
4. Ручка простерилизованные PDMS штампы и опоры, используя изогнутые пинцет из нержавеющей стали. В кабинете биологической безопасности, выкладываем один 35-мм диаметра блюдо культуры ткани для каждого PDMS штамп. В каждом блюде, сложить два PDMS опор, расположенных на расстоянии чуть меньше, чем длина марок PDMS.
5. С помощью пинцета, стерилизуют, как много круговых покровные стекла (15 мм в диаметре, # 1), поскольку есть PDMS марки с использованием 70% этанола. Аспирируйте лишнюю жидкость из покровные, держа их с помощью пинцета. Хранить промытые покровные в отдельном 100-мм диаметра чашки Петри.
6. Разлить ~ 50 мкл смеси коллагена, чтобы равномерно покрыть поверхность каждого PDMS штампа.
7. Подбиратькаждый коллаген покрытием PDMS штамп с пинцетом и аккуратно переверните их. Понизить инвертированные марки на верхней части опоры PDMS выложен в 35-мм диаметра тканевой культуры вогнутое таким образом, что коллаген между штампом и нижней части блюдо культуры ткани. Инкубируйте блюда при температуре 37 ° С в течение 30 мин.
8. Разливают ~ 50 мкл оставшейся коллагеновой смеси на каждую из кольцевых покровные (позже, они будут размещены в верхней части сконструированных тканей, чтобы полностью инкапсулировать их в коллаген) и инкубировать их при 37 ° С в течение 30 мин.
9. Получают 100-мм диаметра тканевой культуры блюду, содержащей эпителиальные клетки (напр. EpH4 мышь эпителиальные клетки молочных желез) на ~ 40% сплошности. Аспирируйте среда для культивирования клеток и мыть один раз с 10 мл 1X PBS. Добавляют 2 мл трипсина к клеткам и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 5-10 мин.
10. Добавить 8 мл свежей культуральной среды для культуры ткани Петри, содержащую клетки обрабатывали трипсином, отсоединение все оставшиеся прилипшие клетки из чашки, Осторожно перемешать с помощью пипетки и переместить клеточной смеси в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируют при 100 & bull; g в течение 5 мин.
11. Аспирируйте супернатант из конической трубки, и ресуспендируют осадок клеток в среде для культивирования клеток. С помощью гемоцитометра подсчитывают число клеток для определения концентрации суспензии. Отрегулируйте объем суспензии для получения конечной концентрации ~ 10 ⁶ -10 ⁷ клеток / мл.
12. Удалить гелеобразных образцов коллагена из инкубатора. С помощью пинцета, осторожно поднимите PDMS штампы прямо вверх, чтобы отделить их от отформованного коллагена и отказаться от них.
13. Разливают ~ 30 мкл концентрированной суспензии клеток на поверхность каждого коллагеновым гелем, содержащим формованные полости желаемой геометрии. Обратите внимание на клетки под микроскопом светлопольному с целью Н.А. 10X / 0.25, осторожно встряхивая гарниров в сторону , чтобы продвинуть ячейку отстаивания внутри полостей. Полости должны быть заполнены в течение ~ 5 мин.
14. Для галить избыток клеток вокруг полости, наклон каждой ткани культуры блюдо на бок и аккуратно дозировать ~ 400 мкл среды для культивирования клеток на поверхности коллагеновый гель. Аспирируйте жидкость и повторите для стирки 1-2 раза больше, проверяя коллагеновые гели под микроскопом между каждым мытьем.
15. После того, как избыток клетки были удалены из вокруг ячейки заполненные полости в пресс-форме коллагена, место для культуры ткани посуды в культуре клеток инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 15 мин. Затем, с помощью пинцета, осторожно инвертируют коллаген покрытием покровные класса и поместить их на верхней части ячейки заполненные коллагеном формы таким образом, что коллаген из покровных образует колпачок на клеточных заполненных полостей. Инкубируйте образцы при температуре 37 ° С в течение 15 мин.
16. После того, как коллагеновые колпачки присоединились к клеточной заполненные коллагеном плесени, дозировать ~ 2-2,5 мл культуральной среды клеток медленно над покровным стеклом в верхней части гелей. Культура образцов при температуре 37 ° С в течение 1-3 дней.
    Заметка:24 ч после первоначального посева, эпителиальные ткани можно лечить с помощью факторов роста, таких как эпидермальный фактор роста (EGF) или фактор роста гепатоцитов (HGF), чтобы вызвать ветвление.

4. Иммунофлуоресценции и анализ изображений

1. Аспирируйте среда для культивирования клеток из культуральных чашек ткани и добавить достаточное количество раствора для покрытия фиксаторный клеточные содержащие гели. Инкубируйте блюда при комнатной температуре в течение 15 мин на шейкере со скоростью 200 оборотов в минуту.
2. Аспирируйте закрепитель, заполнить посуду культуры ткани с 1х PBS, и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин на качалке при 200 оборотах в минуту. Повторите два раза в течение трех полных стирок.
3. Для маркировки ядер: аспирация PBS от блюдо культуры ткани и заменить раствором Hoechst. Инкубируют при комнатной температуре в течение 15-20 мин. Для того, чтобы окрасить для ФСП или другого маркера, который может быть обнаружено с помощью антител, перейдите к шагу 4.5.
4. Аспирируйте решение ядерной маркировки и мыть клеток, содержащих гELS три раза 1x PBS, как в шаге 4.2. Запятнанные образцы могут храниться в 1X PBS при 4 ° С до дальнейшего использования.
5. Для того, чтобы окрасить для белка , представляющего интерес: аспирата PBS с чашек культуры ткани, добавляют 300 мкл 0,3% PBST, и инкубировать образца при комнатной температуре в течение 15 мин.
6. Аспирируйте PBS, покрывают гели с блокирующим буфером и инкубировать на вибраторе (200 оборотов в минуту) при комнатной температуре в течение ~ 4 ч.
7. Отберите блокирующий буфер, покрывают гели с раствором первичного антитела и инкубировать на вибраторе при 200 оборотах в минуту в течение ночи при температуре 4 ° С.
8. Аспирируйте раствор первичного антитела, добавляют 0,3% раствор PBST, и инкубируют на качалке при 200 оборотах в минуту при комнатной температуре в течение 30 мин. Аспирируйте PBST и повторять каждые 30 мин в течение 3-4 ч.
9. Повторите шаги 4.7 и 4.8, на этот раз инкубирования с раствором вторичного антитела. Заверните посуду культуры ткани с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить фотообесцвечивания вторичного антитела. После FINAл мыть, окрашивали образцы могут храниться в 1X PBS при 4 ° С до дальнейшего использования.
10. Для визуализации образцов используйте объектив 10X / 0.30 NA сосредоточены на средней плоскости эпителиальных тканей.
11. Для визуализации клеточных ядер, изображения фиксированных образцов , меченных ядерного маркера с использованием объектива 10X / 0.30 NA под действием УФ - освещения.
12. Чтобы визуализировать образцы окрашивали для интересующего белка, изображения с использованием объектива 10х NA / 0,30 на инвертированный флуоресцентный микроскоп.
13. Для создания частотных карт белка окрашивания тканей нескольких (как правило, 50 или более) одинаковой начальной геометрии, первый импорт каждого из изображений с использованием стандартного программного обеспечения для анализа изображений (см Материалы) и конвертировать их в 8-битной градации серого.
14. Для того, чтобы пороговое значение этих изображений, преобразовать их в двоичный (т.е., полутона / черно-белый), определив в оттенках серого точку среза; в оттенках серого значения ниже порогового значения становятся черными, а те, выше порога становится белым. Затем объединитькаждый из отдельных двоичных изображений в единый стек изображений.
15. Затем регистрируют сложенных изображения (то есть, выровнять или сопоставить их) в программном обеспечении анализа. Многие пакеты программного обеспечения для анализа изображений приходят с свободно доступной регистрации плагина.
    1. Используйте каждое изображение в стеке в качестве шаблона для выравнивания следующего изображения, таким образом, что изображения во всем стеке выровнены распространением. И, наконец, наложение (проект) изображения в выровненном стека изображений на основе средней интенсивности, чтобы сформировать единое изображение с картой частоты пикселя. Это изображение может затем быть маркирован для редактирования изображений программное обеспечение выбора ^10,11.

Results

Общая схема молочных желез микротехнологий эпителиальной ткани

Общая схема процедуры микроструктур с изложением экспериментальной работы потока показана на рисунке 1. Конечный результат представляет собой массив из эпителиальных тканей одинаковой геометрии и расстояния, которые полностью заложенным в геле ECM. Представитель эксперимент использует EpH4 мышиной молочной железы эпителиальные клетки, культивированные в геле бычье...

Discussion

Описанный выше протокол описывает метод получения идентичных эпителиальных тканей заданной формы, что позволяет осуществлять пространственный контроль механического напряжения, испытываемого клетками ткани. Эластомерная форма используется для создания полостей в коллагене I типа, которые затем заполняются эпителиальными клетками и покрываются дополнительным коллагеновым слоем, так что клетки полностью инкапсулируются в среду 3D-коллагенового матрикса. Дальнейшее культивирование этих тканей и обработка факторами роста для...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Полидиметилсилоксан (PDMS)	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184
PDMS Отвердитель	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184
Мастер с литографическим рисунком силикон	самодельный	Н/Д
Пластиковый весовой катер	Fisher Scientific	08-732-115
Чашки Петри диаметром 100 мм	BioExpress	D-2550-2
Этиловый спирт 200 Proof	Pharmco-Aaper	111000200	Приготовьте 70% раствор EtOH (v:v) путем смешивания с dH2O
Лезвие бритвы	American Safety Razor	620179
1:1 Dulbecco' s Модифицированный Eagle' s Средний: Ветчина s F12 Питательная смесь (DMEM/F12) (1:1)	Гиклон	SH30023FS
фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150H
10x Hank' s сбалансированный солевой раствор (HBSS)	Life Technologies	14185-052
Инсулин	Sigma Aldrich	I6634-500MG
Гентамицин	Life Technologies	15750-060
10x Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Fisher Scientific	BP399-500
Гидроксид натрия (NaOH)	Sigma Aldrich	221465-500G
Бычий коллаген I типа (непепсинизированный)	Koken	IAC-50
Альбумин из бычьей сыворотки (БСА)	Sigma Aldrich	A-7906
Изогнутый пинцет из нержавеющей стали	Dumont	7
Чашки для культуры тканей диаметром 35 мм	BioExpress	T-2881-6
15 мл конические пробирки	BioExpress	C-3394-2
1,5 мл Eppendorf Safe-Lock Tube	США Scientific	1615-5500
Circular #1 стеклянные покровные стекла, диаметр 15 мм	Bellco Glass Inc.	Спецзаказ
0,05% 1x Трипсин-ЭДТА	Лайф Технолоджис	25300-054
Параформальдегид	VWR	100503-916
Тритон Х-100	Перкин Элмер	N9300260	Моющее средство
HGF	Sigma Aldrich	H 9661	Ресуспендирование в dH<суб>2О в дозе 50 мг/мл
Кролик антимышиный антитело	FAK Life Технологии	AMO0672
Козья анти-кроличья Alexa 488 антитело	Life Technologies	A-11034
Adobe Photoshop	Adobe	N/A	Используется для цветового кодирования пиксельных частотных карт.
FIJI (ImageJ)	NIH	N/A	Бесплатное программное обеспечение для анализа изображений, используемое для порогового значения, регистрации и наложения изображений для создания карты частоты пикселей. Для регистрации бинарных изображений использовался плагин StackReg.