Фильтрация Выделение нуклеиновых кислот: Простой и быстрый ДНК Метод экстракции

В ряде докладов были обсуждены вопросы развития бумажно или мембран на основе методов извлечения для использования в пункте оказания медицинской помощи (ПСУ) устройства ^1-5 с целью сделать изящную чувствительность и специфичность молекулярной диагностики доступной для всех. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) венерических болезней Инициатива Диагностика ввел термин уверил (Бюджетное, Чувствительный, конкретные, Удобный, быстрый и надежная, оборудование свободные и доставляется к тем, кто в ней нуждается), чтобы описать идеальные характеристики ВОК тест ^6. Из этих руководящих принципов, оборудование свободной характеристикой является особенно сложной задачей для достижения молекулярной диагностики. Тем не менее, каждое нововведение в области будет продвигать цель достичь тех , кто больше всего нуждается, и есть надежда на ближайшую перспективу улучшения в проведении испытания путем адаптации существующих технологий ^7.

Здесь мы опишем простой протокол для экстракции ДНК из цельной кровичто не требует сложной химии или лабораторного оборудования. FINA (фильтрация выделение нуклеиновых кислот) способ подготовки проб был первоначально разработан для извлечения лейкоцитарной ДНК из цельной крови с целью выявления ВИЧ-1 провируса как часть образца до ответа точки оказания медицинской помощи (ПСУ) количественной ПЦР диагностики (ВИЗ) платформа детей раннего возраста (КПЦР) для использования в условиях ограниченных ресурсов ^8-11. FINA добыча отличается от традиционных способов очистки , которые используют кремнеземные мембран или парамагнитные частицы диоксида кремния , покрытые обратимо связывать ДНК в присутствии хаотропных агентов ^12. Вместо этого FINA использует вертикальную фильтрацию с помощью разделительной мембраны для извлечения клеточной ДНК из цельной крови непосредственно. Мембрана , содержащая захваченный ДНК может быть помещена непосредственно в пробирку для ПЦР , и либо непосредственно использовали в реакции ПЦР или сушат на воздухе в течение последующего усиления ^9. Нет хаотропные агенты, фенол, или спирты не используются при экстракции образца, eliminaтин обширные стадии промывки , необходимые для удаления мощные ингибиторы КПЦР , полученные из процесса экстракции ^13,14.

Мембрана FINA может выполнять захват либо клеток ⁹ или геномную ДНК , освобожденные от лизиса клеток ¹¹ до того , как образец добавляется к мембране. Для захвата клетки, цельной крови добавляют непосредственно к мембране. Клетки затем лизируют в мембране путем добавления 10 мМ NaOH. Преимущество этого метода заключается в том, что она включает в себя только 3 шага: 1) образец дополнение; 2) лизис клеток / мытья и 3) размещение фильтра диска в КПЦР трубке. Недостаток этого метода состоит в том, что мембрана может содержать только определенное количество клеток прямо пропорционально диаметру мембранного диска. Для того, чтобы достичь предела обнаружения, требуемого для EID, 100 мкл цельной крови требуется для ввода образца, который влечет за собой фильтр, который слишком велик, чтобы быть помещенной в трубку КПЦР. Лизиса клеток крови с помощью моющего средства перед добавлением образца в коллекциюмембрана добавляет стадию обработки, но позволяет использовать меньший фильтр для того же самого размера образца. Мы смогли продемонстрировать высокую воспроизводимость, одного обнаружения копирования и количественно оценить всего лишь 10 копий ВИЧ-1 провирусной ДНК из 100 мкл крови с помощью этой тестовой конфигурации ^11.

В этом докладе мы опишем FINA протокол, первоначально разработанный для использования в лабораториях. Сэндвич мембрана / фильтр известен как FINA модуль подготовки пробы может быть получен в больших количествах и складированы для последующего использования. При проведении анализа проб должны быть извлечены этот процесс занимает 2 мин и может быть выполнена в различных партий размера. КПЦР может быть запущена немедленно или фильтры, содержащие внедренный ДНК могут быть сохранены до тех пор, пока удобно выполнять КПЦР. Этот метод очень удобен для рутинного анализа образцов в обоих параметрах низких и высоких ресурсов.

Заявление по этике: Весь образцы крови, используемые в данном исследовании не рассматриваются как исследования с участием человека. Образцы были получены в клинических диагностических целей, которые были удовлетворены, а оставшаяся часть этих образцов была предоставлена ​​для FINA исследований анализа. Образцы были закодированы таким образом, что следователи не смогли легко установить личность лиц.

1. Получение FINA образца модуля подготовки

1. Приготовьте промокательную прокладку путем разделки 35 х 35 мм ² из 2,6 мм толщиной 100% хлопок колодки. Отрежьте один прокладки в образце.
2. Приготовьте пластмассовую парафиновой пленки с бумажной защитной ленты режущей части парафиновой пленки (25 мм (h) на 50 мм (w)) и затем пробивать отверстие диаметром 7,14 мм в центре ленты с помощью молотка приводом дырокола. Подготовьте одну ленту на образец.
3. Приготовьте сепаратор мембраносвязанными стекла крови (захват мембраны) диск путем пробивки круга диаметром 8,35 ммс помощью молотка приводом дырокола. Удар один диск на образце. Диск имеет удерживающую способность частиц 2,3 мкм.
4. Собирают модуль подготовки проб FINA путем размещения захвата диска в центре блоттинга колодки с помощью щипцов. Поместите парафиновой пленки ленту над диском захвата так, чтобы отверстие парафинового ленты покидает центр диска захвата открытой.
5. Обеспечить максимальный контакт между диском и промокательной прокладки, слегка растягивая парафиновую пленку, чтобы покрыть промокательной площадку и нажав на парафиновую пленку твердо придерживаться ее на промокательной прокладки вокруг всех краев диска.
6. Сделать столько модулей, сколько необходимо для эксперимента или штабеля для использования в будущем.

2. Получение КПЦР Tube

1. Подготовьте ленточный диск 5,1 мм, что якорь мембраны захвата клеток к стороне трубки КПЦР, чтобы предотвратить мембрану от блокирования посредством флуоресцентной детекции путем пробивки круг двойной оболочкой ПолеSter диагностическую ленту с молотка приводом удар из листа ленты. Подготовьте один ленточный диск на образце.
2. Удалите одну сторону наклейки лайнера ленте в. Поместите ленту в 200 мкл ПЦР-пробирку, приклеить ее на одну сторону, и в сторону нижней части трубы. Удалите вторую наклейку лайнера. Трубка теперь готова получить подготовленный диск.
3. Производить столько трубок, сколько необходимо для эксперимента или штабеля для использования в будущем.

3. изловчиться образцы крови

Примечание: Если настоящий испытательный образец готовится, перейдите к шагу 4.

1. Оттепель клетки 8e5-LAV ¹⁵ , несущие одну копию провируса ВИЧ-1 , полученные из лаборатории вирусологии обеспечения качества (VQA; Rush Presbyterian / St медицинский центр Луки, Чикаго, Иллинойс.).
   Примечание: Они хранятся в виде замороженных гранул клеток в концентрации 4000 клеток / мкл. Количество клеток проверено , как описано выше ^9.
2. Подготовка серМВЛ разведение в замораживании среды (90% эмбриональной бычьей сыворотки, 10% диметилсульфоксиде) в диапазоне концентраций от 1 до 400 клеток / мкл.
3. Пипеткой 10 мкл клеток от каждого из серийных разведений в микроцентрифужных трубки. Добавьте 100 мкл свежей ВИЧ-1 отрицательный ЭДТА обработанной пробы цельной крови в каждую пробирку, чтобы создать стандартную кривую числа копий 8e5-LAV 10-4,000. Смешайте, аккуратно стряхивая нижней части трубы 5 раз.

4. Выполните FINA Extraction

1. Клетки Лизируйте крови путем добавления Triton-X100) до конечной концентрации 1% (11 мкл 10% Тритона-X100 до 110 мкл цельной крови и клеток со стадии 3.3).
2. Смешайте, аккуратно стряхивая нижней части трубы 5 раз. Кровь должна превратить полупрозрачный красный.
3. Пипетируйте образца крови на диске захвата.
   Примечание: водонепроницаемое уплотнение между парафином лентой и мембраной захвата гарантирует, что кровь течет через мембрану, и хороший контакт между захвата мembrane и промокательной площадку сборки обеспечивает быстрый образец затекание.
4. Разрешить образец, чтобы впитать через фильтр.
   Примечание: лизата крови фитили Into промокательной площадку из-за капиллярного действия, захватив геномную ДНК на поверхности диска захвата. Лизат впиталась в диск, когда он появляется матовость.
5. Добавить 600-1000 мкл 10 мМ NaOH по каплям на диск захвата.
   Примечание: Промывочный буфер также может быть добавлен в качестве сыпучего добавлением 600 мкл. Буфер будет образовывать капли на гидрофобной парафиновой ленту и фитиль через отверстие в диске примерно за 20 сек. Фильтр будет меняться от красного до белого с указанием зазора гемоглобина.
6. Отделить диск из промокательной прокладки с пинцетом и нанесите диск на ленту в подготовленную для ПЦР пробирку. Если есть красный цвет, оставленный на фильтре добавляют 50-100 мкл промывочного буфера, чтобы очистить фильтр перед размещением в трубке.
   Примечание: Нечасто, избыточное давление, применяемое в ходе подготовкиФИНА модулей приводит к разделения мембранных слоев во время отделения от промокательной прокладки. Выбросьте эти диски и готовить свежий образец.
7. После того, как фильтр помещают в пробирку для ПЦР, анализируют образцы сразу. В качестве альтернативы, сухой в течение ночи в коробке, содержащей сульфат кальция осушителя, а затем колпачок и поместить в пакет из фольги с диоксидом кремния осушителя и хранят до готовности для анализа.

5. КПЦР реакции

1. Подготовьте 100 мкл КПЦР мастер смеси в реакции с использованием ВИЧ - специфических праймеров и зондов , как описано выше ^9,11. Включите внутренний контроль усиления для контроля за наличием ингибиторов амплификации и убедиться, что отрицательный образец является истинным отрицательным. Убедитесь, что фильтр полностью покрыт мастер-смеси и что фильтр остается фиксированной на стороне трубки в течение всей реакции.
2. Выполнение амплификации с использованием ПЦР в реальном времени устройство , как было описано выше ^9.

Рабочий процесс для извлечения провирусной ДНК из цельной крови с добавленными 8e5-LAV клеток показано на рисунке 1. На рисунке 2 показан модуль образца FINA и подготовил КПЦР трубку. Этот метод позволяет эффективно амплификации ВИЧ-1 провируса из 8e5-LAV клеток при различных значениях числа копий, как показано на стандартной кривой надуманных образцов (рисунок 3). ПЦР была эффективность 103%, как рассчитано с КПД = -1 + 10 (-1 / наклон). Уравнение линии было у = -3.25x + 27,95, с соотношением r² = 0,996. Провирусная стандартной ДНК кривой ВИЧ размножается также имеют высокую воспроизводимую усиление, о чем свидетельствует в таблице 1. Кроме того, внутренний контроль в 500 экземпляров Hydroxypyruvate редуктазы присутствует , чтобы показать , что не существует никакого ингибирования ПЦР в результате извлечения крови с FINA, не зависит от числа копий ВИЧ-1 провируса присутствующих (Рисунок 4). ИК-амплификацию эффективно получены во всех 18 испытанных образцов, при среднем Cq из 21,92 ± 0,25 и CV 1%.

Рисунок 1: Процедура для обнаружения провирусной ДНК из цельной крови с добавленными 8e5-LAV клеток к кПЦР. (А) Слева направо, подготовленную FINA модуль, после того, как кровь добавляется к мембране захвата и после того, как промывочный буфер был добавлен. (B) КПЦР трубки с захватом дисков приклеились двойным покрытием ленты с мастер КПЦР смеси добавляют. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: FINA в доме модуль и подготовка КПЦР трубки. (А) захвата Диаметр мембранного диска 8,35 мм был зажат между квадратным 707 блоттинга колодкой и тонкий лист парафиновой ленты , содержащей отверстие диаметром 7,14 мм , диаметр в центре таким образом, что отверстие парафинового ленты была сосредоточена на захват диска для непосредственного применения лизированной крови по пипеткой. (B) 5,1 мм двойной покрытием диагностическая лента полиэфирная застревает на стороне 200 мкл КПЦР трубки. Второй вкладыш ленты удаляется подвергать липкую поверхность для нанесения захвата диска , когда будете готовы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рис . 3: стандартная кривая ВИЧ-1 провирусной ДНК умудрялся образцов (A) Amplification участки , полученные из 100 мкл 4 размножается ВИЧ-1 Нефисключаемых цельной крови с добавленными с 8e5-LAV клеток 4000, 400, 40 и 10 500 копий / реакция внутреннего контроля сплошными линиями = усилительных участков; Пунктирная линия = порог. Y-ось единицы флуоресценции и X-ось КПЦР номер цикла. (B) Стандартные кривые значений Cq рассчитывается амплификации участка по сравнению с лог числа копий 8e5-LAV клеток на 100 мкл цельной крови. Уравнение линии: у = -3.25x + 27,95; R² = 0,996; Эффективность ПЦР = 103,23% рассчитывали с помощью КПД = -1 + 10 (-1 / наклон) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Внутренний контроль указывает на отсутствие КПЦР ингибирования 500 копий контрольной плазмиды Hydroxypyruvate редуктазы Amplification добавлены на реакцию.. твердое тело= линии усиления участков; Пунктирная линия = порог. Средняя Cq СК = 21,92 ± 0,25. CQS колебалась от 21,21 до 22,32. Коэффициент вариации (CV%) = 1%; N = 18. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1: Средние Cq, стандартное отклонение (SD) и коэффициент вариации (CV%) из 4000, 400, 40 и 10 копий стандартной кривой 8e5-LAV с FINA экстракции и ВИЧ-1 специфических праймеров и зонды. N = 4. WB = цельной крови.

Авторам нечего раскрывать.