Методическая статья

Характеристика человека моноцитов дендритные клетки путем обработки изображений проточной цитометрии: Сравнение между двумя моноцитов Isolation протоколов

DOI:

10.3791/54296

⸱

18 октября 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, Herbert Wertheim College of Medicine, Florida International University, 2Millipore Sigma

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании сравниваются два различных метода выделения моноцитов человека для получения in vitro дендритных клеток (ДК). Моноциты отбираются путем адгезии или отрицательно обогащаются магнитной сепарацией. Выход и жизнеспособность моноцитов, а также жизнеспособность MDDC, пролиферацию и экспрессию поверхностных маркеров CD11c/CD14 будут сравниваться между обоими методами.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дендритные клетки (ДК) — это антигенпрезентирующие клетки иммунной системы, которые играют решающую роль в реакциях лимфоцитов, защитных механизмах хозяина и патогенезе воспаления. Выделение и изучение ДК имеют важное значение в биологических исследованиях из-за их отличительных особенностей. Несмотря на то, что ДК являются важными ключевыми медиаторами иммунной системы, они очень редко встречаются в крови, составляя примерно 0,1 - 1% от общего количества мононуклеарных клеток крови. Таким образом, альтернативы методам выделения основаны на дифференцировке ДК из моноцитов, выделенных из мононуклеарных клеток периферической крови (ПМЦ). Использование надлежащих методов изоляции, сочетающих в себе простоту, доступность, высокую чистоту и высокую производительность клеток, является обязательным для рассмотрения. В настоящем исследовании будут сравнены два различных метода генерации ДК. Моноциты отбирали путем адгезии или отрицательно обогащали с помощью процедуры магнитной сепарации с последующей дифференцировкой в ДК с IL-4 и GM-CSF. Жизнеспособность, пролиферацию и фенотип моноцитов и MDDC оценивали с помощью красителей на жизнеспособность, анализа МТТ и анализа поверхностных маркеров CD11c/CD14 с помощью визуализационной проточной цитометрии. Несмотря на то, что метод магнитной сепарации позволил получить значительно более высокий процент моноцитов с более высокой пролиферативной способностью по сравнению с методом адгезии, результаты продемонстрировали способность обоих методов одновременно генерировать моноциты, способные пролиферировать и дифференцироваться в жизнеспособные CD11c+ MDDC после семи дней в культуре. Оба метода дали > 70% CD11c+ MDDC. Таким образом, наши результаты дают понимание, которое способствует разработке надежных методов выделения и определения характеристик ДК человека.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дендритные клетки (ДК) являются важными медиаторами врожденной и адаптивной системы иммунитета. Они действуют, чтобы вызвать первичные иммунные реакции и способствуют развитию иммунологической памяти. Эти клетки в первую очередь ответственны за захват антигена, миграции и стимуляции Т - клеток и, следовательно , называют профессиональных антиген - представляющих клеток (АРС) 1 .Manipulation ДК могут быть использованы в самых различных областях исследований и в клинических условиях для лечения различных воспалительных заболеваний , таких как ВИЧ , 6,7, рак 8, аутоиммунные заболевания 9, а также аллергические реакции 10. Контроллеры домена также используются для исследования злоупотреблением вещества для того , чтобы решить неизвестные механизмы и пути , такие как те , которые связаны с алкогольной зависимостью 11-14 наркотической зависимости 13,15, и сочетание инфекции и наркомании ВИЧ 16-19. Эти текущие исследования и будущие научные исследования Iп области иммунологии делают в пробирке поколения РС чрезвычайно важны для исследования. Тем не менее, существуют некоторые трудности , связанные с выделением контроллеров домена из крови человека , поскольку они составляют лишь 0,1 - 1% от общего количества мононуклеарных клеток крови 20.

На сегодняшний день некоторые из хорошо известных методов для генерации РС экстракорпорального состоит из пластика или стекла адгезии моноцитов 21,22, центрифугирования в градиенте плотности 23, удельная разделения на основе маркеров , таких как магнитная активированной сортировки клеток 22, флуоресцентная сортировка клеток 24, положительный выбор CD14 + моноцитов с использованием декстрана покрытием магнитных наночастиц 25 и быстрое выделение высокоочищенных моноцитов с использованием полностью автоматизированной негативной селекции 26 клеток. Тем не менее, лучшим методом выбора остается спорным. Таким образом, для улучшения методов генерации постоянного тока, несколько методов были разработаны, в которыхЧистота этих клеток может быть значительно увеличена путем дифференцировки из очищенных CD34 + клеток - предшественников и моноцитов , выделенных из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) 27. Как упоминалось до, широко используемый и популярный метод для генерации моноцитов дендритных клеток (MDDCs) заключается в изучении способности моноцитов придерживаться стекла или пластика (метод спаек) 21,22,27. Метод прилипание является быстрым и простым способом, который не требует использования сложного оборудования. Тем не менее, некоторые недостатки этого процесса включают загрязнение лимфоцит, низкую гибкость и моноцитов переходную манипуляцию 28. Альтернативный метод метода прилипание магнитная изоляция моноцитов от общего МНПК, в частности , с использованием человеческого набора обогащения моноцитов, который предназначен для выделения моноцитов МНПК путем негативного отбора 26. Во время этой процедуры нежелательные клетки предназначены для удаления с тетрамернойантитело и магнитные частицы, покрытой декстраном. Преимущество этого способа выделения является то, что нежелательные меченые клетки отделяются с помощью магнита в то время как клетки-мишени могут быть свободно слили в новую пробирку без необходимости колонн. На сегодняшний день, при наличии специфических моноклональных антител, которые могут маркируют уникальные клеточные популяции, метод магнитной сепарации становится не просто дополнительный метод, а необходимость для выделения редких клеток в области иммунологии. Например, методы , такие как магнитно сортировки клеток с коммерчески доступными парамагнитных MACS-наночастиц способствовали разработке новых подходов для проведения исследований и клинических применений 22,29. Кроме того, последние научные исследования , сравнивающие поколение постоянного тока от прилипания моноцитов и технологии MACS методы продемонстрировали более высокую чистоту и жизнеспособность DC с использованием MACS разделенных моноциты 22,30.

Настоящее исследование представляетсравнение между двумя методами генерации человеческих моноцитов из ГЦ, выделенных из МНПК: 1) моноцитов изоляции путем присоединения и 2) моноцитов изоляции путем негативной селекции с использованием коммерческого набора обогащения моноцитов человека. Это исследование свидетельствует о том, чтобы показать, что отрицательная магнитная процедура разделения выбора для выделения моноцитов генерирует наибольший выход моноцитов без каких-либо существенных различий в жизнеспособности моноцитов по сравнению с моноцитами, выделенных методом прилипания. В свою очередь, через семь дней, моноциты, выделенные магнитной сепарации дифференцировались в MDDCs со значительно более высоким пролиферативным потенциалом и более высоким количеством клеток, экспрессирующих дважды положительных (CD11c + / CD14 +) фенотипа, не затрагивая жизнеспособность MDDC. В целом, данное исследование отличается от предыдущих исследований, упоминаемых выше, так как он демонстрирует способность обоих методов, чтобы одновременно генерировать моноциты, которые способны пролиферировать и дифференцироваться в CD11c +MDDCs (> 70%) после семи дней в культуре без ущерба для их жизнеспособности. Кроме того, в настоящее время подход предусматривает впервые характеристики различных популяций CD11c / CD14 MDDCs методом проточной цитометрии изображений.

Таким образом, так как контроллеры домена играют роль фокусного отношении проведения исследований в области иммунологии, различные параметры должны быть приняты во внимание при рассмотрении вопроса о том , как они получены , и какие методы используются для выделения и культуры их в пробирке. Таким образом, данное исследование направлено на дать представление о двух различных методов выделения моноцитов и как эти методы дифференцированно влияют на жизнеспособность моноцитов и выход в конечном счете, затрагивающего дендритных жизнеспособность клеток, пролиферации и фенотип. Эти результаты будут в значительной степени способствовать области иммунологии и предоставит подробный протокол постоянного выделения, очистки и характеристики.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В целом исследования крови человека были рассмотрены и одобрены Советом по институциональному (IRB) ПФР, IRB протокол утверждения # IRB-13-0440. Человеческие leukopaks были приобретены у банковского сообщества крови в Майами, штат Флорида.

1. Выделение МКПК с помощью стандартной плотности Gradient Technique

  1. Выполните 1: 1 разбавление крови с 1х-фосфатно-буферном солевом растворе в колбе Т75.
  2. Пипетка 15 мл раствора градиента плотности в 50 мл центрифужные пробирки и тщательно слой (25 - 30 мл / трубка) разведенной крови над этим градиентом.
  3. Центрифуга в течение 20 мин при 1200 х г с ускорением 1 и замедления 0.
  4. После центрифугирования собирают граничный слой (белых кровяных телец) в новый 50 мл центрифужную пробирку и промыть клетки дважды в PBS (3 мин при 1,080 мкг). Удалите супернатант каждый раз.
  5. Лечить клеток с (ACK) буфера аммоний хлорид калия лизировать (лизировать эритроциты). Добавьте 10 мл буфера и вcubate в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
  6. Промыть клетки дважды PBS, центрифуга в течение 3 мин при 1,080 мкг и отбросить супернатант каждый раз.
  7. Сохранить осадок, который будет содержать МНПК.
  8. Продолжайте метод очистки моноцитов выбора.

2. моноцитов Очистка с помощью метода ПРИСОЕДИНЕНИЯ

  1. Подготовить всю клеточную культуральную среду, содержащую L-глутамина (300 мг / мл) и добавлением пенициллина (50 ед / мл) -streptomycin (50 мкг / мл) и 10% фетальной телячьей сыворотки.
  2. Разрешить МНПК придерживаться в течение примерно 2 ч при культивировании их в Т75 колбы при концентрации 5 × 10 7 клеток на 10 мл полной среды при 37 ° С и 5% СО 2 в увлажненном инкубаторе.
  3. После инкубации удалить неадгезированных плавающих клеток из культуральной колбы и осторожно промыть прилипшие клетки дважды PBS.
  4. Выдержите адгезивных клеток в полной среде для культивирования клеток, дополненной 2 мкл / мл человеческого гранулоцитарного MACRophage колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и интерлейкин 4 (IL-4), хранящегося в наличии концентрации 10 мкг / мл.
  5. Изменение половины среды и пополнения цитокины каждые 48 ч.
  6. Разрешить 5 - 7 дней для дифференциации моноцитов в MDDCs.

3. моноцитов Очистка с помощью магнитного метода разделения

  1. Сбор МНПК от стандартной методики в градиенте плотности, влить в полистирола пробирку объемом 5 мл и повторно приостанавливать в буфере PBS при концентрации клеток / мл.
  2. Добавьте человеческий коктейль обогащения моноцитов с использованием клеток / мл 50 мкл, хорошо перемешать и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 10 мин.
  3. После инкубации, добавьте магнитные частицы, используя / мл клеток 50 мкл, хорошо перемешивают и инкубируют при 4 ° С в течение 5 мин.
  4. Принесите клеточной суспензии до общего объема 2,5 мл, добавляя PBS буфера, хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз 2 - 3 раза.
  5. Поместите трубку из полистирола без колпачка в магнитное устройство и отложите в сторону при комнатной температуре в течение 2.5 мин.
  6. После инкубации и в одном непрерывном движении, поднимите магнит и вылить желаемый очищенный фракции моноцитов в чистую 50 мл центрифужную пробирку.
  7. Выдержите адгезивных клеток в полной среде для культивирования клеток, дополненной 2 мкл / мл человеческого гранулоцитов-макрофагов колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и интерлейкин-4 (ИЛ-4), хранящегося в наличии концентрации 10 мкг / мл.
  8. Каждый 48 ч, менять половину среды, спином вниз на 1,080 мкг в течение 5 минут и повторно приостанавливать осадок с новыми медиа (CRPMI) и цитокинов.
  9. Разрешить 5 - 7 дней для дифференциации моноцитов в MDDCs.

4. трипанового синего Жизнеспособность Пробирной

Примечание: Используйте эту технику , чтобы получить выход клеток и жизнеспособность РВМС, моноцитов и MDDCs.

  1. Клетки Harvest с использованием стандартного трипсин-ЭДТА и выполняют промывками колбы и осадок клеток с использованием PBS. В зависимости от размера гранул, повторноприостанавливать в 5 до 10 мл PBS, чтобы растворить осадок.
  2. В микро-центрифуге трубки, выполнить разбавление 1: 1 трипанового синего реагента с разбавленным осадку клеток.
  3. Из этой смеси, аликвоты 10 мкл в ячейку подсчета слайд и чтения результатов с использованием автоматического счетчика клеток в соответствии с протоколом производителя. Если автоматизированный счетчик клеток не доступен, аналогичное количество клеток можно с помощью гемоцитометра или ручного счетчика.

5. МТТ

  1. Пластина клеток при концентрации 4 х 10 4/100 мкл полной среды в каждую лунку в 96-луночный планшет. Разрешить 24 ч для клеток, чтобы приспособиться к культуре.
  2. Выдержите и выполнять показания при 0 (0 день), 36 (3-й день) и 84 (7-й день) ч соответственно.
  3. По завершении желаемого инкубации удалить средства массовой информации и заменить 100 мкл PBS в одиночку.
  4. Готовят 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенил раствор тетразолия (МТТ) (5 мг / мл) путем добавления 10 мл dimethил сульфоксид (ДМСО) до 1 г додецилсульфата натрия (SDS).
  5. Добавляют 10 мкл (5 мг / мл) раствора МТТ в каждую лунку и инкубировали при 37 ° С в течение 2-х дополнительных часов.
  6. После инкубации удалить супернатанты, содержащие PBS и не превращенный МТТ (смесь желтого цвета раствора).
  7. Добавляют 100 мкл раствора SDS-ДМСО в каждую лунку и инкубировать в течение одного дополнительного часа.
  8. Измерить оптическую плотность при 540 нм с использованием микропланшет-ридера.

6. Окрашивание поверхности клеток Анализ изображений проточной цитометрии

  1. Через 7 дней дифференцировки из очищенных моноцитов, дозировать 1x10 6 клеток аликвоты моноцитов дендритные клетки в соответствующее число 1,5 мл пробирки.
  2. Начало клеточной поверхности окрашивания путем блокирования клеток с использованием 50 мкл инактивированной нагреванием (HI), сыворотка крови человека, инкубируют при 4 ° С в течение 10 мин.
  3. После инкубации клетки центрифугированием при 720 х г в течение 5 мин, отбросить супернатант.
  4. Для клеток Pelleт, добавить соответствующие Флуорохром-конъюгированные антитела (например, анти-CD11c или анти-CD14) и инкубируют при 4 ° С в течение 20 мин в защищенном от света. В отдельных трубок, готовят одиночные Флуорохром окрашенных образцов / мл), так как они необходимы для компенсации.
  5. После инкубации, мыть клетки дважды в 1 мл PBS буфера и центрифуге каждый раз при 720 мкг в течение 5 мин.
  6. Поддержание клеток в защищенном от света, повторно приостанавливать в буфере PBS при концентрации клеток / 100 мкл для анализа потока цитометрии.
  7. Для того, чтобы ворота на жизнеспособных клеток, добавить 1 мкл DAPI в каждую пробирку до приобретения клеток на едином потоке визуализации клеток цитометрии прибор в соответствии с инструкциями изготовителя.

7. Статистический анализ

  1. Ввод всех данных в электронную таблицу.
  2. Сравните результаты с помощью Т-теста студента и / или одностороннюю ANOVA в зависимости от обстоятельств.
  3. Рассмотрим различия статистически значимыми, если р <0,05.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Моноцитов Выход магнитной сепарацией выше по сравнению с моноцитов Выход по методу ПРИСОЕДИНЕНИЯ

Данные , представленные на рисунке 1 отображения РВМС и подсчета клеток моноцитов с помощью трипанового синего методом исключения в день изоляции МНПК и разделения моноцитов. В среднем, моноциты, выделенные методом прилипания составляли примерно 6,2 процента от общего объема МНПК в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На основании известных трудностей выделения и генерации MDDCs из человеческой крови, настоящее исследование с целью обеспечить всестороннее сравнение двух хорошо известных методов для генерации MDDCs. Первый способ по сравнению является хорошо установленный традиционный способ генерации MDDCs за счет использования способности моноцитов прилипать к стеклу или пластмассы (метод спаек) 21,22,27. Метод прилипание является быстрым и экономически эффективным, и не требует использования сложного оборудования. Тем не...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все авторы не раскрывают конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование поддержано Национальным институтом злоупотребления алкоголем и алкоголизма, премия K99/R00 AA021264. Дополнительная лабораторная поддержка в рамках стартового пакета была получена от Департамента иммунологии, Института нейроиммунной фармакологии, Медицинского колледжа Герберта Вертхайма и FIU - Управления исследований и экономического развития. Джанна Кастелейро выступила при поддержке NIH/NIGMS R25 GM061347. Ответственность за содержание лежит исключительно на авторах и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ficoll-PaqueGE Healthcare17-5442-03Необходимо использовать в RT
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Life Technologies10010-023
ACK Лизирующий буферQuality Biological118-156-101
RPMI 1640 mediumLife Technologies22400-089
Антибиотик-антимикотик (100x)Life Technologies15240-062
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Life Technologies16000-044
RoboSep буферStemCell20104
EasySep Набор для обогащения моноцитов человекаStemCell19059
TC20 Автоматизированный счетчик клетокBio-Rad145-0101
FITC-DextanSigma AldrichFD4-100MG
Трипановая синяя морилка (0.4%)Life Technologies15250-061
Synergy 2 многорежимный считывательBiotek7131000
XTT Биореагент на основе натриевой соли (XTT)Sigma AldrichX4626-100MG
Биореагент диметилсульфоксид (DMS)Sigma AldrichD8418-500ML
Тиазолил синий тетразолия бромид (MTT)Sigma Aldrichm5655-500MG
Додецилсульфат натрия (SDS)Bio-Rad161-0302
Феназина метосульфат (ДМСО)Sigma AldrichP9626-1G
Инактивированный (HI) Сыворотка крови человекаChemicon S1-100ML
Accuri C6 Проточный цитометрBD Accuri653119
FlowSight Amnis Проточный цитометрEMDMillipore 100300

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).
  2. Banchereau, J., et al. Immunobiology of Dendritic Cells. Ann Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  3. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  4. Kaouther, M., Ridha, O. Dendritic Cell-Based Graft Tolerance. ISRN Pharmacol. , (2011).
  5. Steinman, R., Gutchinov, B., Witmer, M., Nussenzweig, M. Dendritic cells are the principal stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. J Exp Med. 157, 613-627 (1983).
  6. Nair, M. N., et al. RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: Prospects for HIV-1 therapy. AAPS J. 7, E572-E578 (2005).
  7. Agudelo, M., et al. Chapter 10. Dendritic Cells: Types, Life Cycles and Biological Functions. , Nova Publishers. 167-177 (2010).
  8. Kajihara, M., Takakura, K., Ohkusa, T., Koido, S. The impact of dendritic cell-tumor fusion cells on cancer vaccines - past progress and future strategies. Immunotherapy. , (2015).
  9. Suwandi, J., Toes, R., Nikolic, T., Roep, B. Inducing tissue specific tolerance in autoimmune disease with tolerogenic dendritic cells. Clin Exp Rheumatol. 33, 0097-0103 (2015).
  10. Gorelik, M., Frischmeyer-Guerrerio, P. A. Innate and adaptive dendritic cell responses to immunotherapy. Curr Opin Allergy Immunol. 15, 575-580 (2015).
  11. Zwolak, A., et al. Peripheral blood dendritic cells in alcoholic and autoimmune liver disorders. Hum Exp Toxicol. 31, 438-446 (2012).
  12. Agudelo, M., et al. Differential expression and functional role of cannabinoid genes in alcohol users. Drug Alcohol Depend. 133, 789-793 (2013).
  13. Nair, M. P., Figueroa, G., Casteleiro, G., Muñoz, K., Agudelo, M. Alcohol Versus Cannabinoids: A Review of Their Opposite Neuro-Immunomodulatory Effects and Future Therapeutic Potentials. J Alcohol Drug Depend. 3, 184(2015).
  14. Boukli, N. M., et al. Implications of ER Stress, the Unfolded Protein Response, and Pro- and Anti-Apoptotic Protein Fingerprints in Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Treated With Alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34, 2081-2088 (2010).
  15. Nair, M. N., Mahajan, S., Sykes, D., Bapardekar, M., Reynolds, J. Methamphetamine Modulates DC-SIGN Expression by Mature Dendritic Cells. J Neuroimmune Pharmacol. 1, 296-304 (2006).
  16. Napuri, J., et al. Cocaine Enhances HIV-1 Infectivity in Monocyte Derived Dendritic Cells by Suppressing microRNA-155. PLoS ONE. 8, e83682(2013).
  17. Nair, M. P. N., Saiyed, Z. M. Effect of methamphetamine on expression of HIV coreceptors and CC-chemokines by dendritic cells. Life Sciences. 88, 987-994 (2011).
  18. Nair, M. P. N., et al. Cocaine Modulates Dendritic Cell-Specific C Type Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Expression by Dendritic Cells in HIV-1 Patients. J Immunol. 174, 6617-6626 (2005).
  19. Reynolds, J. L., Mahajan, S. D., Sykes, D. E., Schwartz, S. A., Nair, M. P. N. Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC). Biochem Biophys Acta. 1774, 433-442 (2007).
  20. Van Voorhis, W., Hair, L., Steinman, R., Kaplan, G. Human dendritic cells. Enrichment and characterization from peripheral blood. J Exp Med. 155, 1172-1187 (1982).
  21. Davis, G. The Mac-1 and p150,95 beta 2 integrins bind denatured proteins to mediate leukocyte cell-substrate adhesion. Exp Cell Res. 200, 242-252 (1992).
  22. Delirezh, N., Shojaeefar, E. Phenotypic and functional comparison between flask adherent and magnetic activated cell sorted monocytes derived dendritic cells. Iran J Immunol. 9, 98-108 (2012).
  23. Lehner, M., Holter, W. Endotoxin-Free Purification of Monocytes for Dendritic Cell Generation via Discontinuous Density Gradient Centrifugation Based on Diluted Ficoll-Paque Plus®. Int Arch Allergy Immunol. 128, 73-76 (2002).
  24. Van Brussel, I., et al. Fluorescent activated cell sorting: An effective approach to study dendritic cell subsets in human atherosclerotic plaques. J. Immunol Methods. 417, 76-85 (2015).
  25. Mucci, I., et al. The methodological approach for the generation of humandendritic cells from monocytes affects the maturation state of the resultant dendritic cells. Biologicals. 37, 288-296 (2009).
  26. Yuan, N., et al. The American Association of Immunologists (AAI). , AAI. Miami Beach, FL. (2007).
  27. Romani, N., et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med. 180, 83-93 (1994).
  28. Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56, 236-240 (1994).
  29. Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
  30. El-Sahrigy, S. A., Mohamed, N. A., Talkhan, H. A., Rahman, A. M. A. Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial. Cent Eur J Immunol. 40, 18-24 (2015).
  31. Curry, C. V. Differential Blood Count. , http://emedicine.medscape.com/article/2085133-overview (2015).
  32. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179, 1109-1118 (1994).
  33. Cavanagh, L. L., Saal, R. J., Grimmett, K. L., Thomas, R. Proliferation in Monocyte-Derived Dendritic Cell Cultures Is Caused by Progenitor Cells Capable of Myeloid Differentiation. Blood. 92, 1598-1607 (1998).
  34. Ardeshna, S. M., et al. Monocyte-derived dendritic cells do not proliferate and are not susceptible to retroviral transduction. Br J Haematol. 108, 817-824 (2000).
  35. Chapuis, F., et al. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. Eur J Immunol. 27, 431-441 (1997).
  36. Zhou, L. J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).
  37. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).
  38. Caux, C., et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).
  39. Fujii, S. i, Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation. J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).
  40. Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding. Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Monocyte IsolationDendritic Cell GenerationImaging Flow CytometryMagnetic SeparationAdherence MethodCD11c CD14 AnalysisPeripheral Blood Mononuclear CellsHuman Monocyte DifferentiationViability Proliferation AssessmentSingle Cell Analysis

Похожие статьи