Роботизированной платформы для высокой пропускной способности выделения протопластов и трансформации

Summary

Методология с высокой пропускной способностью, автоматизированное, табачных протопластов производство и преобразование описано. Роботизированная система позволяет массово-параллельной экспрессии генов и открытие в модельной системе BY-2, которая должна быть переводимым не-модельных культур.

Abstract

За последнее десятилетие наблюдается всплеск в использовании растительных протопластов, которые варьируются от модельных видов подрезать видов, для анализа путей передачи сигнала, транскрипционных регуляторных сетей, экспрессии генов, генома редактирования и гена-глушителей. Кроме того, значительный прогресс был достигнут в регенерации растений из протопластов, породившей еще больший интерес к использованию этих систем для растений геномики. В этой работе, протокол был разработан для автоматизации изоляции протопластов и трансформации из «Ярко-желтый '2 (BY-2) табака суспензионной культуры с использованием роботизированной платформы. Процедуры трансформации были подтверждены с использованием оранжевый флуоресцентный белок (ОФП) ген-репортер (pporRFP) под контролем промотора вируса мозаики цветной капусты 35S (35S). ОФП выражение в протопласты было подтверждено эпифлуоресцентной микроскопии. Анализы также включены протопластов методы эффективности производства с использованием propidiuм йодистый. И, наконец, недорогие ферменты пищевые были использованы для процедуры выделения протопластов, обходя необходимость лабораторного класса ферментов, которые непомерно в высокой пропускной способности автоматизированной изоляции и анализа протопластов. На основании протокола, разработанного в данной работе, полная процедура от выделения протопластов к трансформации может быть проведена в соответствии с 4 ч, без какого-либо вмешательства оператора. В то время как протокол, разработанный в данной работе была подтверждена с клеточной культурой BY-2, процедуры и методы должны быть переводимым к любой подвески растений культуры / протопластов системы, которая должна позволить ускорению исследований в области геномики культур.

Introduction

В последние годы наблюдается значительный импульс уделяется разработке трансгенных культур для преодоления различных заболеваний ^1, наделяют устойчивость к гербицидам ^2, придают засуху ^3,4 и солеустойчивости ^5, предотвратить herbivory ^6, увеличить выход биомассы ^7, и уменьшение клеточной стенки упрямство ^8. Эта тенденция способствовала развитию новых молекулярных инструментов для создания трансгенных растений, в том числе генома редактирования с использованием CRISPR и Таленс ⁹ и молчанием генов через дсРНК ^10, микроРНК ¹¹ и миРНК ^12. Несмотря на т....

Protocol

1. Создание суспензионных клеточных культур

1. Готовят жидкость × 2 сред путем добавления 4,43 г Linsmaier & Скоог основных сред, 30 г сахарозы, 200 мг KH ₂ PO _4, и 200 мкг 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D) до 900 мл дистиллированной воды и рН до 5,8 с помощью 0,1 М КОН. После доведения рН, регулировать конечный объем до 1000 мл дистиллированной водой и автоклаве. Средства массовой информации могут храниться до 2-х недель при 4 ° С.
2. Привить колбу 250 мл Эрленмейера с 100 мл жидкости-2 СМИ и одного куска BY-2 каллуса (> 1 см в диаметре), выращенных на твердом теле-2 сред (жидкости-2 средах с добавлением 1% агар) и печать....

Results

В текущем исследовании, удвоение скорости BY-2 изменялась от 14-18 ч в зависимости от температуры, при которой инкубировались культуры, в соответствии с предыдущими сообщениями о средней продолжительности клеточного цикла 15 ч. При этом скорость удвоения, 1: 100, начиная прививочный материал был использован для инициации культур, что приводит к культурам с гематокрита (PCV) 50% в течение 5-7 дней. В текущем протоколе, в котором культуры выращивают в 200 мл носителе, PCV 100 мл сгенериров.......

Discussion

Протокол, описанный выше, был успешно проверен для выделения протопластов, перечисления и трансформации с использованием табака культуры суспензии клеток BY-2; Тем не менее, протокол может быть легко расширена на любое растение подвески культуры. В настоящее время протопластов выделение и преобразование было достигнуто во многих растениях, в том числе кукурузы (Zea MAYS) ^10, морковь (морковь дикая) ^32, тополь (тополь евфратский) ^33, винограда (Vitis винифер.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orbitor RS Микропланшетный движитель	Thermo Scientific
Bravo Обработчик жидкостей	Многорежимный
Synergy H1 Многорежимный диспенсер	BioTek
MultiFlo FX Многорежимный диспенсер	BioTek
Teleshake	Inheco	3800048
CPAC Ultraflat Нагреватель/охладитель	Inheco
Программное обеспечение Vworks Automation	Программное обеспечение Agilent		используемое для управления и написания протоколов для Agilent Bravo
Momentum Software	Thermo Scientific		Программное обеспечение для планирования задач для управления Orbiter RS
Liquid Handling Control 2.17 Программное обеспечение	Biotek		используемое для управления и написания протоколов для
инвертированного микроскопа MultiFlo FX IX81	Olympus
Zyla 3-Tap Микроскоп	камера Andor
ET-CY3/TRITC Набор фильтров	Chroma Technology Corp	49004
Rohament CL	AB Enzymes	бутылка для образцов	недорогая целлюлаза
Rohapect UF	AB Enzymes	для образца	для образца недорогая пектиназа
Rohapect 10L	AB Enzymes	бутылка для образца	недорогая пектиназа/арабиназа
Linsmaier & Skoog Basal Medium	Phytotechnology Laboratories	L689
2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота	Phytotechnology Laboratories	D295
пропидиум йодид	Sigma Aldrich	P4170
Poly(этиленгликоль) 4000	Sigma Aldrich	95904-250G-F	ранее Fluka PEG
Propidium Iodide	Fisher Scientific	25535-16-4	Акрос Органик
CaCl2	Sigma Aldrich	C7902-1KG
Ацетат натрия	Fisher Scientific	BP333-500
Mannitol	Sigma Aldrich	M1902-1KG
Сахароза	Fisher Scientific	S5-3
KH2PO4	Fisher Scientific	AC424205000
KOH	Sigma Aldrich	P1767
Gelzan CM	Sigma Aldrich	G1910-250G
6-луночная пластина	Thermo Scientific	103184
96-луночная пластина глубиной 1,2 мл Thermo	Scientific	AB-0564
96-луночная оптическая нижняя пластина	Thermo Scientific	165305
Finntip 1000 Наконечники для пипеток	с широким отверстиемThermo Scientific	9405 163
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
KCl	Sigma Aldrich	P4504-1KG
MES	Fisher Scientific	AC17259-5000
MgCl2	Fisher Scientific	M33-500