Коррелятивное свето- и электронной микроскопии с помощью Quantum Dot Наночастицы

Summary

Описан метод, с помощью которого наночастицы квантовых точек (QD) могут быть использованы для коррелятивных иммуноцитохимических исследований эпоксидной встроенной ткани патологии человека. Мы используем коммерческие квантовые точки, сопряженные с фрагментами антител, которые визуализируются с помощью широкопольной флуоресцентной световой микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии.

Abstract

Способ описан в котором квантовые точки (КТ) наночастицы могут быть использованы для корреляционного иммуноцитохимических исследований ткани патологии человека с использованием Widefield флуоресцентной световой микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Чтобы продемонстрировать протокол мы immunolabeled ультратонких эпоксидные участки опухоли соматостатинома человека с использованием первичных антител к соматостатин, с последующим биотинилированного вторичного антитела и визуализации стрептавидином, конъюгированного 585 нм кадмий-селен (CdSe) квантовых точек (КТ). Секции монтируются на образце сетки ПЭМ затем помещали на предметное стекло для наблюдения с помощью Widefield флуоресценции световой микроскопии. Световая микроскопия показывает 585 нм QD маркировке ярко-оранжевой флуоресценции, образуя зернистую картину внутри опухолевых клеток цитоплазмы. При низкой до середины диапазона увеличения с помощью световой микроскопии образец маркировки можно легко распознать и уровень неспецифической или фоновой маркировки оценены. Это критическийшаг для последующей интерпретации картины иммунноокрашивания методом просвечивающей электронной микроскопии и оценки морфологического контекста. В этом же разделе затем высушены и просмотрены с помощью ПЭМ. QD зонды видно быть прикреплены к аморфным материалом, содержащимся в отдельных секреторных гранул. Изображения получены из той же области интереса (ROI), видно с помощью световой микроскопии для корреляционного анализа. Соответствующие образы из каждой модальности могут затем быть смешаны для наложения данных флуоресценции на ТЕМ ультраструктуры соответствующего региона.

Introduction

Коррелятивное свето- и электронная микроскопия (CLEM) является мощным подходом для анализа переходных динамических событий ^1, редких событий ^{2, 3} и ⁴ сложных систем. Есть много различных технических перестановками доступных ⁵ в зависимости от того , какой вопрос однако общим требованием является то , что та же самая структура , в одном образце ⁶ проецируется множественными модальностей микроскопии. Наш особый подход к CLEM был разработан для изучения архивных ткани патологии человека и при используемой здесь было хорошо охарактеризованы и опубликованы ранее ^7. Цель состояла в том, во-первых, чтобы макс....

Protocol

1. Ткань Вскрытие и Фиксацию

1. Ткань Вскрытие
   1. Рассеките кусочки ткани из опухоли хирургическим путем резекцию образца ткани или биопсии.
      Примечание: Ткань используемая в этом исследовании было обычно фиксировали в формалине, но свежей ткани также подходит. Мы выбрали область подтверждена и о котором сообщает патологоанатом содержать опухоль соматостатинома после последующего гистологического окрашивания и анти-соматостатин иммунное (не показан).
   2. Используйте кусочки ткани размером не более приблизительно 1,0 мм ^3.
2. Какодилатном буфере Получение
   1. Подготовка исходн....

Results

Опухолевые соматостатинома образцы, используемые для этого исследования состоит опухолевые клетки, образующие структуры протоков, смешанные с коллагеновой stomal ткани. По флуоресцентной световой микроскопии, отдельные опухолевые клетки, которые содержали обильные секреторных гранул показали положительную маркировку для соматостатина гормона. Ядра появились темные дыры с минимальным неспецифического мечения обнаружению (рисунок 1). При низких увеличениях, переменно интен.......

Discussion

Это исследование продемонстрировало потенциальную полезность в качестве универсальных квантовых точек зондов для исследования Клем. 585 нм наночастицы, используемые QD показали яркую и стабильную флуоресценцию при просмотре Widefield световой микроскопии и были легко наблюдать с помощью ПЭМ. Предыдущее исследование одним из авторов показал также КТ быть пригодны для сверхвысокого разрешения световой микроскопии ^7. Их светостойкость было особенно полезно в течение длительных периодов просмотра и длительных экс.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Какодилат натрия	Proscitech	C0205	Вредное химическое вещество
Тетраоксид осмия	Proscitech	C010	Использование только в вытяжном шкафу
Уранилацетат	Univar-Ajax	569	Опасное химическое вещество
Этанол 100%	Фронин	JJ008
Ацетон 100%	Фронин	JJ006
ERL 4221	Proscitech	C056
DER 732	Proscitech	C047
NSA	Proscitech	C059
DMAE	Proscitech	C050
Метапериодат натрия	Analar BDH	10259
антисоматостатиновые антитела	Dako	A0566
Разбавитель антител	Dako	S3022
Qdot 585 Стрептавидин Конъюгат	Invitrogen	Q10113MP
Биотинилированная козья анти-кроличья антитела IgG	Sigma	B7389-1ML
Глутаральдегид 50%	EMS	16320
Нормальная козья сыворотка	Invitrogen	PCN5000
PBS "Dulbecco A"	Oxoid
BSAc (10%)	Aurion	900.022
Парапленка	Pechiney PP	M
индикаторные полоски pH (pH 2.0 - 9.0)	Merck	1.09584.0001
Микроформы	Proscitech	RL063
Алмазный нож	Diatome	Ultra 45
Пропускающий электронный микроскоп	FEI	Morgagni 268D
Флуоресцентный световой микроскоп	Carl Zeiss	Axioscope A1
Сетки 300 меш никель (тонкий стержень)	Agar Scientific	G2740N
Ультрамикротом	RMC	Powertome
TEM программное обеспечение для управления камерой	Soft Imaging System	AnalySIS	Version 3.0
Программное обеспечение для обработки изображений	Adobe Systems Встроенный	Photoshop CS2