Method Article

Совокупный размер Оптимизация в Микролунки, для подвески на основе сердечной дифференциации человеческого плюрипотентные стволовые клетки

DOI:

10.3791/54308

⸱

September 25th, 2016

 ,  , 
1Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, 2Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, University of Calgary

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обычные методы для инициирования Суспензия на основе совокупного сердечной дифференциацию человеческих плюрипотентных клеток (стебли hPSCs) являются сталкивалась с культурой гетерогенности по отношению к совокупной форме и размеру. Здесь мы опишем надежный метод для сердечной дифференциации с использованием миропланшет генерировать размер контролируемых HPSC агрегатов культивируют в условиях, способствующих сердечных.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сердечная дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs) обычно проводится в агрегатах суспензионных клеток. Традиционное образование агрегатов hPSCs включает в себя диссоциацию клеточных колоний на более мелкие сгустки, при этом контроль размера сгустков грубо контролируется пипетированием клеточной суспензии до тех пор, пока не будет достигнут желаемый размер сгустка. Одна из основных проблем традиционной кардиологической дифференцировки ПСК на основе агрегатов заключается в том, что гетерогенность культуры и пространственная дезорганизация приводят к переменному и неэффективному выходу кардиомиоцитов. Мы и другие ранее сообщали о том, что совокупный размер человеческих эмбриональных стволовых клеток (hESC) может быть модулирован для оптимизации эффективности сердечной индукции. Мы решили эту проблему, применив масштабируемый подход, основанный на микролунках, для контроля физических параметров образования заполнителя, в частности, размера и формы заполнителя. Описываемый нами метод заключается в принудительной агрегации определенных номеров hPSC в микролунках и последующем культивировании этих агрегатов в условиях, которые направляют индукцию сердца. Этот протокол может быть легко масштабирован в зависимости от размера и количества используемых скважин. Используя этот метод, мы можем последовательно достигать выходов культуры с частотой кардиомиоцитов более 70%.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В пробирке культуре клеток может быть выполнена в соответствии с рядом условий, но , как правило , осуществляется либо в двумерных прилипших условиях или в трехмерных условиях подвески , которые более полно резюмировать в системах естественных условиях. Следовательно, существует растущая тенденция во многих областях исследований с целью разработки надежных методов для создания трехмерных конструкций ткани. В ситуациях , когда типы и клеточные процессы требуют поддерживающих внеклеточного матрикса (ЕСМ) прилипание поверхности и сигналы, трехмерная культура может быть включена с помощью scaffolded конструктов, где клетки культивируют на или в экзогенный поддерживающей матрицы 1. Клетки и процессы , которые не требуют адгезии к поддерживающей матрицы может быть выполнена в виде суспензии в качестве unscaffolded систем , состоящих в основном или исключительно из клеток (которые могут затем перейти к генерировать свои собственные эндогенные матрицы) 2,3. Здесь мы приводим протокол для сердечной дифференциации OF человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs - стволовые клетки, способные стать любым типом клеток в организме, будь то из эмбриональных или других источников) по размеру контролируемой, униформы, unscaffolded агрегатов.

Дифференциация hPSCs в виде суспензии агрегатов страдает от значительных колебаний совокупного размера как в пределах пробега и между пробегами. Эта изменчивость является следствием метода, обычно используемых для создания этих агрегатов, которая включает в себя механическую диссоциации клеточных колоний. Чтобы уменьшить эту изменчивость, ряд подходов, которые были использованы для контроля количества клеток на совокупности, а также совокупный диаметр и однородность. Примеры включают в себя образование агрегатов в микропробирок 4 или висячей капли 5, micropatterning определены двумерные HPSC колонии 6 , которые затем могут быть перенесены в суспензии или центрифугирование клеток в U- или V-дно мульти-луночных планшетах 7,8, 9. Тем не менее, все эти проверoaches ограничены их низкой пропускной способностью совокупного поколения. Системы обоснованному используют аналогичный подход к системам V-образным дном, однако меньший размер лунках (в данном протоколе каждый из которых имеет ширину 400 мкм) позволяет поколение большего числа однородных агрегатов из одной культуры-плашки (стандартный диаметр ~ 15,5 мм , содержащих ~ 1200 миропланшет) , чем будет генерироваться из целого V-образным дном 10. Образование агрегатов Хорошо основе был использован в ряде установок , включая дифференциацию hPSCs до Эктодермальные 11, энтодермальная 12, 13 и Мезодермальные внеэмбриональной 14 судьбами; хондрогенез из мезенхимальных стволовых клеток 15; формирование единых подложек для токсикологического скрининга 16; и исследования mechanobiology 17.

Одной из основных проблем в разработке надежных протоколов производства для производства HPSC-производного cardiomyocytes было отсутствие воспроизводимости в сердечной эффективности дифференциации между запусками. Ранее мы показали , что эта изменчивость может быть отнесена к неоднородности в исходной популяции HPSC, который включает оба самообновлению hPSCs и дифференциации клеток , которые экспрессируют гены , связанные с эндодермы и нервной дифференцировки 6,18. Сигналы, секретируемые этими дифференцирующихся клеток влияют на сердечную индукцию. В частности, внезародышевый энтодерма способствует сердечной индукции, в то время как нервные клетки-предшественники подавляют сердечной индукции. При агрегации HPSC, клетки в пределах общей дифференцироваться и организоваться , чтобы недифференцированные hPSCs окружены слоем внеэмбриональные эндодермы клеток , которые развиваются на поверхности агрегата 13. Контролируя совокупный размер, мы можем модулировать соотношение количества сердечных индуцирующих эндодермы клеток к недифференцированных hPSCs (площадь поверхности к объему) , и оптимизировать это отношение для максимального сердечного индукции 13.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка компонентов среды

  1. Приготовьте промывочный Medium. На 100 мл DMEM / F12, прибавляют 1 мл 100х пенициллина / стрептомицина (Pen / Strep), 1 мл 100x L-глутамина, и 5 мл замены сыворотки.
  2. Подготовьте химически определенную Базальная Сердечный индукционной среде в соответствии с инструкциями изготовителя.
  3. Подготовьте следующие акции реагенты для средств массовой информации, которые будут использоваться в данном протоколе.
    1. L-аскорбиновая кислота: Готовят раствор 5 мг на мл в 4 ° С, стерильный сверхчистой дистиллированной воды в конической трубе.
      1. Оставьте это решение на льду и вихревой трубки периодически, пока растворенное вещество полностью не растворится. Фильтр-стерилизовать Аскорбиновая кислотного раствора с помощью шприца 0,22 мкм фильтр.
      2. Подготовка 1 мл аликвоты раствора аскорбиновой кислоты и хранить эти аликвот при -20 ° С. Используйте свеже талой аликвоты готовят каждый раз, когда среда.
    2. В день средней подготовки, Развести 13 мкл монотиоглицерина (MTG) в 1 мл базальной кардиохирургии индукционной среде. Отбросить неиспользуемые, разбавленный MTG.
    3. Готовят аликвот объемом 1 мл трансферрина (30 мг / мл), чтобы хранить при -20 ° С. Хранить оттаивают аликвот при 4 ° С в течение 3-х месяцев.
    4. Готовят 4 мМ соляной кислоты (HCl), содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА). В вытяжном шкафу, добавляют 30 мкл 6,0 N раствора HCl в 50 мл сверхчистой дистиллированной воды. Фильтр-стерилизовать раствор с помощью шприца 0,22 мкм фильтр. Добавляют 2 мл 25% раствора БСА в растворе HCl в 50 мл.
    5. Готовят фосфатно-буферном солевом растворе (ФБР), содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина. Добавьте 20 мкл 25% раствора БСА на мл PBS.
    6. Готовят кости человека морфогенетического белка 4 (BMP-4) маточного раствора (10 нг / мкл). Растворить 10 мкг лиофилизованных ВМР-4 в 1 мл раствора 4 мМ буфера HCl, содержащем 0,1% бычьего сывороточного альбумина. Готовят 50 мкл аликвоты для хранения при -20 ° С.
    7. Приготовьте Человеческий фактор роста фибробластов 2 (bFGF) маточного раствора(10 нг / мкл). Растворить 10 мкг лиофилизированного bFGF в 1 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), содержащим 0,1% бычьего сывороточного альбумина. Готовят 50 мкл аликвоты для хранения при -20 ° С.
    8. Приготовьте сосудистый эндотелиальный фактор роста человека (VEGF) маточного раствора (5 нг / мкл). Растворяют 5 мкг лиофилизированного СЭФР в 1 мл PBS, содержащим 0,1% бычьего сывороточного альбумина. Готовят 50 мкл аликвоты для хранения при -20 ° С.
    9. Подготовка активин маточного раствора (10 нг / мкл). Растворить 10 мкг лиофилизованных активин А на 1 мл PBS, содержащем 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА). Готовят 50 мкл аликвоты для хранения при -20 ° С.
    10. Готовят Ингибитор Wnt Production-2 (IWP-2) маточного раствора (10 мМ). Растворите 2 мг ИВП-2 в 429 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Готовят 10 мкл аликвоты для хранения при -80 ° С.
  4. Подготовить полный Сердечный индукционной среде. К 100 мл базальной кардиохирургии индукционной среде, добавляют 1 мл 100x Pen / Strep 1 мл 100x L-глутамина, 500 мкл трансферрина, 1мл свежей талой аскорбиновой кислоты и 300 мкл MTG. Отбросить неиспользуемые среды.

2. Подготовка плиты Microwell

Примечание: Все шаги должны быть выполнены в кабинете биологической безопасности.

  1. Добавить 0,5 мл промывочным раствором (набор компонентов) в каждую лунку, которая будет использоваться на пластине. Для того, чтобы гарантировать, что раствор контактирует по всей поверхности внутри каждого микролунку, центрифугировать планшет при 840 х г в течение 2 мин.
  2. Инкубируйте планшет в течение 30 до 60 минут при комнатной температуре.
  3. Аспирируйте промывочным раствором из лунок. Промыть каждую лунку дважды следующим образом : Добавьте 1 мл PBS в каждую лунку, центрифуга планшет при 840 х г в течение 2 мин, а затем отсасывает PBS.

3. Формирование HPSC Агрегирует в пластине Microwell

Примечание: Все шаги должны быть выполнены в кабинете биологической безопасности.

  1. Поместите Wash среды в C водяной бане при 37 °.
    Примечание: Объем требуется = 1 мл х количество скважин НрСК, которые будут диссоциированы.
  2. Диссоциируют hPSCs в одиночных камерах
    Примечание: Эти шаги описывают диссоциации клеток, культивируемых на 6-луночные планшеты - объемы реагентов можно масштабировать пропорционально для различных форматов культуры.
    1. Аспирируйте культуральной среды из каждой культуры HPSC хорошо для диссоциации. Промыть каждую лунку с 1 мл диссоциации фермента, а затем сразу же аспирация диссоциации фермента из каждой лунки.
      Примечание: Остаточное диссоциации фермент должен быть достаточным, чтобы отделить клетки.
    2. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение 3 мин.
    3. Добавить 1 мл промывочного среды в каждую лунку и механически диссоциируют клетки с поверхности для культивирования тканей с помощью пипетки при стирке среде с P1000 микропипетки над поверхностью для культуры ткани. Если диссоциация оказывается неполным и сгустки клеток остаются, проходят суспензии через сито в этой точке.
    4. Передачи клеточной суспензии в коническую пробирку объемом 15 мл и храняттрубка в инкубаторе в то время как количество клеток выполняется в следующем шаге.
    5. Выполните подсчет клеток:
      1. Возьмите пробу 10 мкл суспензии клеток, собранных на предыдущем этапе. Добавьте 30 мкл трипанового синего и смешать суспензию хорошо пипеткой.
      2. Перенесите 10 мкл трипанового синего-окрашенных клеток в каждой камере гемоцитометра и визуализировать под инвертированным микроскопом с целью 10X. Граф клеток.
    6. Из результатов подсчета клеток, вычислить , сколько скважин могут быть посеяны на 1,2 × 10 6 клеток на лунку планшете. Подсчитайте Агрегирование среды, необходимой для семян клеток в количестве 1 мл на каждую лунку.
    7. Приготовьте агрегации среды. На 10 мл полной Cardiac индукционной среде, добавьте 0,5 мкл BMP4 исходного раствора (конечная концентрация = 0,5 нг / мл) и Y-27632 ROCK ингибитора (конечная концентрация = 10 мкМ).
    8. Удалите коническую пробирку, содержащую hPSCs из инкубатора и centrifuGE трубка при 200g в течение 5 мин. Аспирируйте промывочной среды и клетки вновь суспендируют в среде агрегации при плотности 1,2 × 10 6 клеток на мл.
    9. Аспирируйте промывочного раствора PBS из каждой лунки на планшете. Использование P1000 микропипетки, равномерно распределить и семенные 1 мл клеточной суспензии в каждую лунку на планшете. Потомству большое количество скважин, периодически вихрь клеточной суспензии для предотвращения осаждения.
    10. Центрифуга пластину при 200g в течение 5 мин. Обратите внимание на пластину под микроскопом, чтобы подтвердить клетки отжимается в нижней части каждого микролунку.
    11. Инкубируйте планшет в течение 24 ч при 37 ° С в 5% СО 2, 5% O 2 (гипоксическая) инкубаторе.

4. Сердечная Индукция 1-й этап

  1. Один день после агрегации (1 день), подготовить необходимый объем Этап 1 индукционная среды (для 24-луночного планшета, объем = 1 мл х количество лунок). Для получения 1 мл полнойсердечный индукционной среде, добавить 1 мкл BMP4 исходного раствора (конечная концентрация = 10 нг / мл), 0,5 мкл bFGF исходного раствора (конечная концентрация = 5 нг / мл) и 0,6 мкл активин А (конечная концентрация = 6 нг / мл). Поместите среду в C водяной бане при 37 ° в течение не менее 15 мин.
  2. Удалите Микропланшетный из инкубатора. Осмотрите агрегаты под микроскопом. По сравнению с агрегацией сразу после центрифуге, они должны появиться нетронутыми с гладкими краями (более круглым и меньше площади, чем в предыдущий день).
  3. Удалить супернатант, не нарушая агрегатов внутри лунках:
    1. Удерживая Микропланшетный по горизонтали уровень (то есть., Не наклоняйте его). Для каждой лунки на планшете, поместите кончик P1000 микропипетки на поверхности культуральной среды и против края колодца.
    2. Медленно снимите среду, соблюдая осторожность, чтобы не нарушить агрегаты в нижней части лунках. После уменьшения тон средний уровень приблизительно от 1 до 2 мм от текстурированной поверхности микропланештным, медленно наклонить пластину для сбора среды на одной стороне скважины (когда объем является достаточно низким, движение жидкости значительно снижается, и его легче избежать агрегатов получения поднятый из их индивидуальных лунках). Медленно пипетку из оставшейся среды в скважине.
  4. Чтобы добавить свежий Этап 1 индукционной среде, обеспечивая при этом агрегаты остаются в своих отдельных лунках: Draw 1 мл 1 этап индукционной среде с P1000 микропипетки. Удерживать наконечник пипетки на внутренней кромке колодца и очень медленно дозировать среды к внутренней стенке колодца. Повторите эти действия для остальных скважин.
  5. Возвращение пластины в инкубатор при гипоксических условиях в течение 3 -х дней.

5. Сердечная Индукция 2-й этап

  1. На 4-й день, место моют среду (объем = число скважин х 2 мл) в водяной бане при 37 ° C в течение минимум 15 мин.
  2. Подготовьте необходимый объем Этап 2 индукционной среде (объем = количество лунок × 1 мл): в мл полной сердечной индукционной среде, добавьте 2 мкл VEGF исходного раствора (конечная концентрация = 10 нг / мл) и 0,5 мкл ИВП-2 Исходный раствор (конечная концентрация = 5 мкМ). Поместите подготовленный Стадия 2 индукционные среды в водяной бане C 37 ° в течение как минимум 15 мин.
  3. С помощью 5 мл серологической пипеткой, собирают агрегаты из каждой лунки микропланшета пластины и собрать совокупную суспензию в 15 мл коническую трубку (получить до 10 скважин в 15 мл пробирку).
  4. Разрешить агрегаты обосноваться в течение 15 мин в гипоксического инкубаторе.
    Примечание: Этот шаг важен для разделения отдельных клеток и клеточных остатков из неповрежденных агрегатов.
  5. Тщательно Аспирируйте супернатант и ресуспендирования агрегатов в 10 мл подогретого промывочного среды для удаления остаточных индуктивные цитокины (например, активин А является мощным сигнальной молекулой , даже при очень низком сотрудничествеncentrations).
  6. Центрифуга агрегаты при 50 мкг в течение 2 мин. Аспирируйте супернатант. Ресуспендируют гранулированные агрегаты в подогретого Induction 2 средних.
  7. Перенести совокупный суспензии в 24-луночные сверхнизким крепление (ULA) пластины в количестве 1 мл на каждую лунку. Обратите внимание на агрегаты под микроскопом в форме, плотных клеточных кластеров. Инкубируйте в условиях гипоксии до 6 -й день.

6. Сердечная Индукция 3 этап

  1. На 6-й день, подготовить необходимый объем Этап 3 индукционной среде (объем = количество лунок × 1 мл). Для получения 1 мл полной Cardiac индукционной среде, добавьте 2 мкл СЭФР маточного раствора (конечная концентрация = 10 нг / мл) и 0,5 мкл bFGF исходного раствора (конечная концентрация = 5 нг / мл). Уготовано место Стадия 3 индукционную среду в водяной бане C 37 ° в течение как минимум 15 мин.
  2. С помощью 5 мл серологические пипетки для передачи заполнителей до 15 мл конические пробирки, объединяют до 10 мл агрегатныйна одной трубе.
  3. Разрешить 10 мин для агрегатов осесть. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования агрегатов в подогретого Этап 3 индукционной среде. С помощью 5 мл серологические пипетки, перераспределить агрегаты в пластину 24-луночного БАУ в количестве 1 мл на лунку.
  4. На 10-й день, подготовить необходимый объем Этап 3 индукционной среде (объем = количество лунок х 1 мл), как на шаге 6.1.
  5. С помощью 5 мл серологические пипетки для передачи заполнителей до 15 мл конические пробирки, объединяют до 10 мл на пробирку агрегатов.
  6. Разрешить 10 мин для агрегатов осесть. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования агрегаты на стадии 3 индукционной среде. С помощью 5 мл серологические пипетки, перераспределить агрегаты в пластину 24-луночного БАУ в количестве 1 мл на лунку.
  7. Инкубируют при гипоксических условиях в течение двух дней. На 12 -й день начинают инкубацию клеток при нормоксических уровней кислорода в течение оставшегося периода культивирования (37 ° C, 20% O 2, 5% СО 2).
    ЗАМЕТКА:После этого периода точки, клетки больше не культивируют в условиях гипоксии.
  8. Повторите эту полную среду обмена (этапы 6.2 и 6.3) каждые 4 дня, начинаясь 14-й день до сбора урожая клеток (как правило, пиковые концентрации кардиомиоцитов наблюдаются после того, как 14-й день дифференцировки).

7. Проточная цитометрия Анализ сердечного тропонина Т (cTnT) Выражение Частота Микропланшетная культуры Выход

  1. Диссоциируют агрегаты следующим образом:
    1. Используйте 5 мл серологические пипетки для передачи 1 скважины агрегатов в 15 мл коническую трубку. Центрифуга агрегатов при 50 мкг в течение 2 мин и тщательно аспирата супернатант.
    2. Добавляют 1 мл свеже растворенного раствора 1 мг / мл коллагеназы типа II для агрегатов. Перенести совокупную суспензию до 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Инкубируйте агрегатов в коллагеназы типа II в течение ночи при комнатной температуре.
    3. На следующий день, используйте P1000 микропипетки осторожно диссоциируют агрегатыв гомогенную суспензии отдельных клеток. Если агрегаты не легко диссоциируют, располагаются агрегаты, аспирация супернатант и инкубировать агрегатов в 700 мкл разобщения фермента в течение от 1 до 2 мин при комнатной температуре. Аккуратно пипеткой агрегатов от 1 до 2 раз с P1000 микропипетки диссоциировать.
    4. Развести диссоциации фермента: Добавьте 700 мкл промывочного питательной среде, содержащей 14 мкл 1 мг / мл ДНКазы исходного раствора. Взять пробу 10 мкл для выполнения подсчета клеток, и центрифугировать Оставшуюся суспензию, используя стендовые микроцентрифужными при 300 х г в течение 2 мин.
  2. Выполните подсчет клеток: Пятно 10 мкл образца подсчета с равным объемом трипанового синего и считать с помощью гемоцитометра.
  3. Снимите трубку микроцентрифужных 1,5 мл, содержащую оставшиеся клетки из микроцентрифуге. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток, при концентрации от 200000 до 500000 клеток на 100 мкл, в Hanks сбалансированный солевой раствор, содержащий2% фетальной бычьей сыворотки (HF).
  4. Для каждого состояния, передача 100 мкл клеточной суспензии на лунку в 2 лунки 96-луночного планшета (одна скважина будет окрашивали антителом cTnT, а другой будет контроль вторичным антителом).
  5. Центрифуга пластины при 300 х г в течение 2 мин. Удалить супернатант с многоканальным микропипетки.
  6. Закрепить клетки: Добавьте 200 мкл раствора фиксирующих (набор компонентов) на лунку и инкубируйте в течение 15 мин при комнатной температуре.
  7. Центрифуга пластины при 300 х г в течение 2 мин. С помощью многоканального микропипетки осторожно вывести супернатант из лунок. Утилизацию супернатант в контейнер параформальдегид отходов.
  8. Вымойте фиксированные клетки дважды: Добавьте 200 мкл HF в каждую лунку. Центрифуга пластины при 300 х г в течение 2 мин. Аспирируйте супернатант и повторите шаг стирки еще раз. Фиксированные клетки могут храниться в течение одной недели в HF при температуре 4 ° С.
  9. Клетки проницаемыми:
    1. Центрифуга планшет при 300XG в течение 2 мин.
    2. Добавьте 100 мкл раствора пермеабилизирующего (набор компонентов) в каждую лунку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин.
    3. Центрифуга пластины при 300 х г в течение 2 мин и аспирата супернатант.
  10. Подготовка мастер сочетание анти-cTnT в HF при оптимальной концентрации для данного номера партии (Оптимальное разведение должно быть определено путем титрования и обычно находится в диапазоне от 1: 500 до 1: 2000).
  11. Для каждого условия (2 скважины в состоянии), добавляют 100 мкл мастер смеси в одну лунку (окрашивали образец) и 100 мкл простого HF в другую скважину (вторичный контроль антител). Инкубацию клеток при температуре 4 ° С в течение 30 мин.
  12. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 2 мин. Аспирируйте супернатант и добавить 200 мкл на лунку HF. Повторите этот шаг мыть еще один раз.
  13. Подготовьте основной смеси вторичного антитела. Передача объема HF, который соответствует 100 мкл для каждой скважины (контроль вторичного антитела иcTnT окрашенных), подлежащего лечению. Добавить 1 мкл козьего антитела против мышиного APC вторичного антитела на 200 мкл HF (1: 200 разбавление).
  14. Пятно образцов. Добавляют 100 мкл окрашивающего раствора в каждую лунку (как контроль над вторичным антителом и анти-cTnT-запачканные скважин). Инкубируйте клетки в темноте при 4 ° С в течение 30 мин (держать пластину, покрытую или в темноте после добавления флуоресцентного вторичного антитела, чтобы избежать фотообесцвечивания).
  15. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 2 мин. Аспирируйте супернатант и добавить 200 мкл на лунку HF. Повторите этот шаг мыть еще один раз.
  16. Передача пробы до 5 мл с круглым дном проточной цитометрии анализа труб и выполнения проточной цитометрии для сигнала в канале APC с использованием стандартных протоколов для инструмента 19.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Контролировали по размеру агрегаты hPSCs эффективно могут быть сформированы с использованием системы микропланештным, зависит только от концентрации клеток и площади поверхности микропланештным. После короткого центрифугирования, соответствующие количества клеток (1000 в данном протоколе) сведены вместе в каждом микролуночным (рис 1А). Важно отметить, что эти клетки восстановить внутриклеточные соединения в течение 24 ч, и больше не должны заполнять скважину, но появляются в виде компактных агрегатов с гладкими краями (рис 1В). Эти агрегаты обеспечивают исходные материалы для дальнейшей дифференциации к сердечной судьбы. Если клетки не образуют плотные кластеры, это говорит о том возможную гибель клеток после диссоциации и реагрегация, а также пригодность единичных концентраций клеток пассирования и ингибитором ROCK для конкретной клеточной линии должны быть проверены. Следующие три дня в лунках показывают незначительные изменения в совокупности морфология, хотя некоторый рост налицо. Когда удаляется из лунках, агрегаты должны сохранять свою круглую, плотно упакованную морфологии и быть такого же размера , как друг к другу (рис 1C). Культура в ULA 24-луночные планшеты позволит дальнейшее расширение и рост клеток.

К 8 -й день, после воздействия первого на передачу сигналов активина и Wnt торможения, агрегаты начнут появляться , как больше и ярче агрегатов (рис 1D). В этот период значительный клеточный дебрис будет видно в нижней части каждой лунки и должны быть удалены, позволяя заполнители обосноваться перед удалением носителя. Время от времени, многие агрегаты сольются. Это не будет препятствовать дифференциацию других агрегатов в скважине, хотя эти "супер агрегатами", как правило, не проявляют морфологические изменения, наблюдаемые при меньших агрегатов и менее вероятно, происходит полная дифференциации.

"Jove_content" ВОК: Keep-together.within-страницу = "1"> Продолжение результаты дифференциации в заметных морфологических изменений в агрегатах с увеличенным размером и появлением организованных волокнистых регионов. К 12-й день, можно наблюдать договаривающиеся агрегаты. Они будут всегда состоять из больших, прозрачных клеток и часто включают в себя обширный внеклеточный матрикс вне агрегата (рисунок 2). В то время как совокупный масштабах сокращений указывают на успешную дифференциацию, выражение сердечный маркер также может наблюдаться в агрегатах, которые не появляются сокращаться. После диссоциации агрегатов и иммунноокрашивания, большинство клеток будет положительным для маркера кардиомиоцитов cTnT методом проточной цитометрии (рисунок 3). Выражение этого маркера стабилен в клетках и может наблюдаться в агрегатах, как в конце 19-й день дифференциации.

1.jpg "/>
Рисунок 1: Хронология HPSC дифференцированы по отношению к сердечной судьбы Сразу после агрегации, клетки почти Заполните каждую лунку (A).. Через день, агрегаты появляются конденсируются и гладкими (В). Эта морфология сохраняется даже тогда , когда агрегаты удаляются из лунках и высевают в лунки планшетов (C). К 8 -й день, агрегаты начинают расширяться и появляются более светлого цвета (D). Шкала бар:. 250 мкм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-1
Рисунок 2: Совокупные Begin сократившись на 12 день дифференциации После шести дней в кардиохирургии Induction Этап 3 средних наблюдались, силовые агрегатные для всей схватки (верхнюю панель:. Расслабитьсявания, средняя панель: сокращение). Нижняя панель получена вычитанием верхний и средний панелей, при этом большинство существенных отличий, появляющихся в виде черных или белых (наконечниками). Шкала бар:. 250 мкм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рис . 3: иммунноокрашивания для сердечного тропонина Т в дифференцированной hPSCs На 17 -й день, большинство клеток являются позитивными для сердечного тропонина Т с помощью проточной цитометрии (заполняется гистограмма). Также показаны клетки окрашивали только вторичным антителом (незаполненными гистограмма). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Было отмечено, что эффективная сердечная дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток является весьма переменной процесса. В то время как это не удивительно , что различные клеточные линии показывают различные наклонности к дифференцировке способности к определенным типам клеток, было обнаружено , что сердечная эффективность дифференциации резко колеблется между прогонов с использованием повторности ту же клеточную линию 6. Протокол, описанный здесь обращается один главный источник этой изменчивости путем непосредственного управления числом входных клеток на агрегат. Для дальнейшего уменьшения вариабельности между прогонами, рекомендуется HPSC линии , приспособленные для одной ячейки пассирования используются, так как эта форма результатов HPSC расширения и технического обслуживания в более последовательных плюрипотентных населения в отношении экспрессии частот маркеров плюрипотентности (например, Oct4, Nanog, TRA-1-60 и др.).

Протокол, как написано здесь, определяет совокупный размер 1000 ячеек для оptimal сердечной индукции из эмбриональных стволовых клеток линии HES-2. Чтобы применить этот протокол для различных клеточных линий, очень важно, чтобы начальный экран размер агрегата производится для определения клеточной линии конкретного оптимального совокупного размера. В то время как это непосредственно не влияет на процедуры, которым необходимо следовать здесь, напомним, что изменения в совокупном размере и общей плотности клеток, как ожидается, влияют на доставку кислорода. Это может стать существенным фактором в последующих применений. Кроме того, апоптическая гибель клеток вызывает беспокойство во время диссоциации hPSCs до отдельных клеток. Поэтому крайне важно, чтобы гарантировать, что ингибитор ROCK присутствует во время агрегации принудительному клеток в лунках. И, наконец, очень важно, что на 4-й день дифференциации агрегаты хорошо промывают для удаления следов активин А, присутствующий в Индукционная 1 средний, до ресуспендирования в индукционных 2 средних. После того, как 4-й день дифференциации, активин А способствует дифференциации энтодермы за счет мезоDerm индукция 20.

Основное применение этой методики заключается в скрининге агрегатные размеры, которые способствуют эффективному сердечной дифференциации. Тем не менее, одним из недостатков текущего метода заключается в том, что она является сложной задачей для масштабирования сердца производства до клинически значимых уровней с использованием Планшетный. Шкала до сердечной дифференциации , как правило , осуществляют в массе условиях культивирования в биореакторах перемешиваемой суспензии 21. Поэтому, как только система Микропланшетная была использована для определения допустимых диапазонов размеров агрегатов для эффективной сердечной индукции, следующий шаг для расширения заключается в определении скорости биореактор рабочего колеса, которые могут генерировать требуемый размер ячейки заполнителя.

Одним из существенных отличий этого метода в отношении других методов агрегатного на основе сердечной дифференциации является то, что она позволяет прямые исследования в модулирующий действие эндогенных сигналов в агрегатах, а такжесовместное культивирование индуктивных / типов ингибирующих ткани с hPSCs в совокупности 13. Эти виды исследований могут информировать развитие процесс крупномасштабного производства сердца.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.U. имеет финансовую заинтересованность в базовой технологии микроскважин.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим доктора Питера Зандстра, в лаборатории которого был разработан этот протокол, и докторов Марка Гальярди и Гордона Келлера, которые оказали помощь в установлении первоначальных методов, на которых был основан этот процесс. Разработка протокола была поддержана стипендией Онтарио для выпускников в области науки и технологий для C.B. и грантом от Фонда сердца и инсульта Онтарио для Питера Зандстры.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
биологической безопасности
Пипетки серологические
пипетки (от 5 до 25 мл)
Аспиратор
Аспиратор или пипетки Пастера
Вытяжной
шкаф
0,22 &; m шприцевой фильтр
5% CO2, 5% O2, и инкубатор для клеточных культур с контролируемой влажностью Гипоксический инкубатор (с низким содержанием кислорода)
5% CO2, 20% O2, и инкубатор для клеточных культур с контролируемой влажностью 
Низкоскоростная центрифуга с качающимся ротором ковша, оснащенная держателем пластины;
Микропипетки P2, P20, P200 и P1000 и связанные с ними наконечники 
Инвертированный микроскоп с 4-кратным, 10-кратным и 20-кратным фазовыми объективами 
Сверхнизкое крепление (ULA) 24-луночные планшеты Corning/Costar3473
для микроцентрифуг 1,5 мл
Настольная микроцентрифуга
L-Аскорбиновая кислотаSigma-AldrichA4403
Стерильная Сверхчистая дистиллированная водаSigma-AldrichW3500
Vortex
Ice
-20 °°; C морозильная камера
МонотиоглицеринSigma-AldrichM6145Toxic; Настоятельно рекомендуется использовать аликвотирование MTG для минимизации окисления из-за многократного вскрытия. Аликвоты можно хранить при 4°°; C на срок до 3 месяцев, -20 ° C рекомендуется для длительного хранения.
StemPro-34 MediumThermo Fisher Scientific10639-011Базальная среда для индукции сердца; Добавка хранится при температуре -20°С; С и базальная среда при 4°С.
TransferrinRoche10652202001
БМП-4R& D Technologies314-BP
bFGFR& D Technologies233-FB
VEGFR& D Technologies293-VE
Activin AR& D Technologies338-AC
IWP-2Реагенты Direct57-G89
Фосфатный буферный раствор (PBS)Thermo Fisher Scientific14190
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Thermo Fisher Scientific15561
Соляная кислота Sigma-Aldrich258148Коррозионный
диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma-AldrichD2650
DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12660
100x Пенициллин/СтрептомицинThermo Fisher Scientific15140
100x L-глутаминThermo Fisher Scientific25030
Замена нокаутирующей сывороткиThermo Fisher Scientific10828010
TrypLE Select ThermoFisher Scientific12563Фермент диссоциативный
гемоцитометр
Trypan Blue
Aggrewell 400 планшетовStemCell Technologies27845Микролуночные планшеты
Aggrewell Промывочный растворStemCell Technologies7010Раствор для промывки микролунок
Y-27632 ROCK ингибиторTocris1254
коллагеназа типа IISigma-AldrichC6885 
Сбалансированный солевой раствор ХэнкаThermo Fisher Scientific14025092
фетальная сыворотка крупного рогатого скотаThermo Fisher Scientific12483
96 луночный планшет (для окрашивания FACS)
Интрапреп ПермеабилизацияРеагент Beckman CoulterIM2389Набор из 2 частей: Фиксирующий раствор и Раствор для пермеабилизации; Неомаркеры токсичных
антител к cTnT MS-295
козий антимышиный антитело IgG APCПрощупы ThermoFisherMolecular ProbesA865
5 мл пробирки для проточной цитометрии с круглым дномFACS машинозависимые
Шкаф 15 и 50 мл конические пробирки Пробирки

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wintermantel, E., et al. Tissue engineering scaffolds using superstructures. Biomaterials. 17, 83-91 (1996).
  2. Lazar, A., et al. Formation of porcine hepatocyte spheroids for use in a bioartificial liver. Cell Transplant. 4, 259-268 (1995).
  3. Sachlos, E., Auguste, D. T. Embryoid body morphology influences diffusive transport of inductive biochemicals: a strategy for stem cell differentiation. Biomaterials. 29, 4471-4480 (2008).
  4. Johnstone, B., Hering, T. M., Caplan, A. I., Goldberg, V. M., Yoo, J. U. In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Exp. Cell Res. 238, 265-272 (1998).
  5. Steinberg, M. S. Does differential adhesion govern self-assembly processes in histogenesis? Equilibrium configurations and the emergence of a hierarchy among populations of embryonic cells. J. Exp. Zool. 173, 395-433 (1970).
  6. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells Dayt. Ohio. 26, 2300-2310 (2008).
  7. Koike, M., Kurosawa, H., Amano, Y. A Round-bottom 96-well Polystyrene Plate Coated with 2-methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine as an Effective Tool for Embryoid Body Formation. Cytotechnology. 47, 3-10 (2005).
  8. Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106, 1601-1603 (2005).
  9. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells Dayt. Ohio. 25, 929-938 (2007).
  10. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PloS One. 3, e1565(2008).
  11. Kozhich, O. A., Hamilton, R. S., Mallon, B. S. Standardized generation and differentiation of neural precursor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 9, 531-536 (2013).
  12. Ungrin, M. D., et al. Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics. Biotechnol. Bioeng. 109, 853-866 (2012).
  13. Bauwens, C. L., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 17, 1901-1909 (2011).
  14. Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reprod. Camb. Engl. 140, 3-9 (2010).
  15. Markway, B. D., et al. Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures. Cell Transplant. 19, 29-42 (2010).
  16. Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell. Toxicol. Sci. Off. J. Soc. Toxicol. 127, 403-411 (2012).
  17. Wallace, L., Reichelt, J. Using 3D culture to investigate the role of mechanical signaling in keratinocyte stem cells. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 989, 153-164 (2013).
  18. Ungrin, M., O'Connor, M., Eaves, C., Zandstra, P. W. Phenotypic analysis of human embryonic stem cells. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. , (2007).
  19. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. JoVE. , e52010(2014).
  20. Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFβ family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Dev. Camb. Engl. 138, 861-871 (2011).
  21. Niebruegge, S., et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol. Bioeng. 102, 493-507 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cardiac DifferentiationHuman Pluripotent Stem CellsMicrowell AggregationAggregate Size ControlHypoxic IncubationFlow CytometryCardiac Troponin TStage Induction MediumUltra Low Attachment PlateParacrine Signaling

Related Articles