Методическая статья

Быстрое Молекулярная Обнаружение и дифференциация вирусов гриппа А и В

15.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54312

⸱

30 января 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем быстрый, молекулярный основе гриппа A и B анализа. Гриппа тест определяет каждую мишень в течение 15 мин с использованием изотермического амплификации с гриппом специфических праймеров с последующим обнаружения цели с зондами молекулярных радиомаяка. И В анализе гриппа А удобно и требует минимальных практического времени для выполнения.

Аннотация

Грипп является респираторное заболевание, вызываемое вирусами гриппа А и В в организме человека и вызывает значительное количество заболеваемости и смертности ежегодно. Гриппа A и B для анализа был первый тест молекулярного быстрого гриппа ОРСУ-отказ от имеющихся. Испытание гриппа A и B работает с использованием изотермического амплификации с гриппом специфических праймеров с последующим обнаружения цели с зондами молекулярных радиомаяка. При этом производительность гриппа A и B для анализа на замороженное, архивируются носоглотки тампон (NPS) образцов, хранящийся в вирусной транспортной среде (VTM) сравнивали с анализом респираторного панели.

Производительность А и В анализе гриппа оценивали путем сравнения результатов с эталонной панели методом респираторной. Чувствительность к общей вируса гриппа А составила 67,5% (95% ДИ (ДИ), 56.6-78.5) и специфичность 86,9% (CI, 71.0-100). Для тестирования вируса гриппа B, чувствительность и специфичность составили 90,2% (ДИ 68.5-100) И 98,8% (ДИ 68.5-100), соответственно.

Эта система имеет преимущество значительно более короткого времени испытания, чем любой другой доступный в настоящее время молекулярного анализа и простой, пипеткой свободной процедуры работает на полностью интегрированной, закрытая, система малой площади. В целом, гриппа A и B оценивали анализ в данном исследовании, имеет потенциал, чтобы служить в качестве диагностического теста быстрого гриппа точки оказания медицинской помощи.

Введение

Вирус гриппа инфекции приводят к значительному количеству заболеваемости и смертности каждый год 1, 2, 3. Несложный гриппа характеризуется конституционными и респираторные симптомы , такие как лихорадка, миалгии, головная боль и непродуктивный кашель 4, 5. Люди старшего возраста, детей младшего возраста, пациентов с ослабленным иммунитетом, а также у пациентов с сопутствующими заболеваниями , лежащих в основе находятся на более высоком риске для серьезных осложнений , таких как пневмония, миокардит, заболевания центральной нервной системы, или смерти 6, 7.

Инфекция гриппа является уникальным от других респираторных вирусов в том , что быстрое введения противовирусной терапии в течение 48 часов после появления симптомов может уменьшить тяжесть заболевания и длину 8. Быстрая идентификация гриппа также былапоказано , чтобы уменьшить использование ненужных антибиотиков 9, 10. Кроме того, госпитализированных пациентов с инфекцией гриппа должны быть размещены в изолированных помещениях с соответствующими мер инфекционного контроля. Тем не менее, респираторные заболевания, вызванные вирусами гриппа, не может быть трудно клинически отличить от гриппа. По этой причине, быстрого и точного диагностического тестирования на грипп является очень важным для клинического лечения пациента.

Некоторые анализы доступны для обнаружения и идентификации вирусов гриппа. Экспресс - тесты для выявления антигенов гриппа (RIDTs) широко используются в клинической практике в качестве точки оказания медицинской помощи тестов , потому что они просты в использовании и обеспечивают результаты в течение от 15 до 30 мин 11, 12; Тем не менее, их чувствительность широко (10-80%) в зависимости от производителя и населения испытывается различаются, и типа гриппа и subtyре 13, 14, 15. Прямые анализы флуоресценции (ДКА) обеспечивают превосходные чувствительность над RIDTs, но время обработки больше (~ 3 ч) и должны быть завершены квалифицированными технологами 16, 17. Вирусная культура была золотым стандартом для диагностики гриппа и улучшилась чувствительность в отношении обоих RIDTs и ДКА 18. Тем не менее, грипп вирусная культура может занять от 2-14 г до завершения, уменьшая его полезность в помощи лечения пациента 19. И, наконец, тесты амплификации нуклеиновых кислот (NAAT) заменили методы культуры в качестве нового золотого стандарта в диагностике гриппа. NAAT считаются имеющими наибольшую чувствительность для обнаружения гриппа в течение нескольких часов. Однако NAAT самые дорогие анализы и требуют специализированного оборудования и технологов для выполнения 5 , 20, 21, 22, 23, 24, 25.

Анализ гриппа А и В, описанный здесь первый ОРСУ-отказ от молекулярного экспресс-тест гриппа, который легко доступен. Этот анализ работает с использованием реакция перекреста Эндонуклеаза Amplification (Near), который использует изотермический амплификации с гриппом специфических праймеров с последующим обнаружения цели с зондами молекулярных радиомаяка. Этот анализ отличает гриппа A от B, требуется 2 минуты, чтобы установить и обработать один образец, и требует в общей сложности 15 минут, чтобы закончить.

Здесь мы представляем протокол для анализа гриппа A & B. Кроме того, мы предлагаем образец набора данных сравнения характеристик вируса гриппа A и B анализа на архивизированных носоглотки тампон (NPS) экземпляры хранятся в вирусной транспортной среде (VTМ) к другому респираторного анализа возбудитель панели.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ЭТИКА ЗАЯВЛЕНИЕ: Использование левой более клинических образцов одобрен и соответствует рекомендациям Совета по Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Review.

1. Перед запуском Пробирной

ПРИМЕЧАНИЕ: Грипп A и B анализ одобрен для носоглотки образцов мазков и носоглотки мазков, хранящихся в вирусных транспортных средств массовой информации. Тампоны включены в комплект и должны быть использованы для обеспечения оптимальной производительности. Тем не менее, искусственный шелк, пена, стекались тампоны или полиэфирной назальные мазки также могут быть использованы для сбора носовых мазков.

  1. Для того, чтобы собрать образец тампон из носа, вставьте тампон в ноздрю, которая имеет наиболее видимый дренаж или, что является наиболее перегруженным. С легким вращением, толкать тампон в ноздрю, пока сопротивление не будет выполнено и повернуть несколько раз против носовой стенки перед медленным удалением из ноздрей. Храните тампоны и транспортировать их в пробирки, содержащие 3 мл вирусной транспортной среды (VTM).
    Примечание: Внимательное отношение к approprIate сбор проб должны быть приняты в качестве неадекватного сбора образцов может привести к ошибочным результатам.
    Примечание: образцы мазков должны быть проверены как можно скорее после сбора. Тем не менее, они могут храниться при комнатной температуре в течение до 2 часов или в холодильнике при температуре 2-8 ° С в течение до 24 часов, если тестирование не доступна немедленно. Свежесобранные образцы идеально подходят для оптимальной производительности тестирования. Неправильное обращение образца, хранения и / или транспортировки может привести к ошибочным результатам.
    Примечание: В качестве меры предосторожности, лица, выполняющие этот тест должен рассматривать все образцы как потенциально инфекционные, следуя универсальных мер предосторожности при работе с образцами.
  2. Доведите все образцы до комнатной температуры перед тестированием.
    Примечание: Все компоненты теста предназначены только для одноразового использования и не должны использоваться для выполнения нескольких тестов. Не следует смешивать компоненты набора из разных партий. Не используйте реагенты с истекшим сроком годности.
  3. Принесите синий приемник образца в РООм Температура до тестирования. Оранжевый тест база может быть проверена без необходимости нагреться до комнатной температуры.
  4. Оставьте все испытательные образцы в упаковке из фольги непосредственно перед использованием. Включите прибор, нажав на кнопку питания на боковой панели прибора. Введите идентификатор пользователя и нажмите "OK".

2. Запуск теста

  1. Для того, чтобы начать процесс тестирования, нажмите "Run Test" на экране прибора. Введите идентификатор пациента с помощью экранной клавиатуры или сканера штрих-кода и нажмите "OK". Откройте крышку и вставьте испытательную базу Orange в держатель испытательной базы Orange.
  2. Убедитесь, что корректный тест отображается на экране и нажмите "OK". Вставьте синий образец приемника в держатель образца синего приемника.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не открывайте приемник образца перед размещением в приборе, так как это позволит предотвратить элюирующего буфера от достижения правильной рабочей температуры и может повлиять на результаты теста.
  3. Подождите, пока образец приемника, чтобы разогреть. При появлении прибора, снимите уплотнение из фольги и поместить тампон тестируемых пациентов в приемник образца.
    Примечание: При удалении фольги, поместите два пальца на краю образца приемника для того чтобы убедиться, что он остается на месте.
  4. Энергично смешать тампон в жидкости в течение 10 сек, нажав на головку тампоном против стороны образца приемника, как вы смешиваете его, чтобы помочь сместить образец от тампона. Нажмите 'OK' для продолжения. Если тестирование тампоны, хранящиеся в вирусной транспортной среде, вихрь VTM в течение 10 сек затем добавить 200 мкл к приемнику образца.
  5. Нажмите белую передачи картридж в голубой приемник образца. Продолжайте нажимать на приемнике образца, пока оранжевый индикатор не поднимается.
  6. Поднимите, а затем подключить передаточный картридж к испытательной базы. Обратите внимание на оранжевый индикатор опускаются, как только передача картридж правильно установлен. Закройте крышку и не открываются, пока "Test Complete"на экране появится соответствующее сообщение.

3. Контроль качества

  1. Нажмите 'Run Test QC' на главном экране. Выберите Test QC для запуска. Подтвердите тип теста, чтобы соответствовать образец QC, предназначенный для тестирования, нажав «ОК» и следуя инструкциям на экране для завершения тестирования.

4. Результат Интерпретация

  1. После того, как тестовый прогон завершен, наблюдать результаты теста, отображаемого на экране с интерпретациями на наличие вируса гриппа А, В, неизвестных подтипов. Для получения неверных результатов повторите тест.

5. Обслуживание и чистка

  1. Прибор очистить и окружающее пространство скамейка ежедневно с помощью 70% этанола или 10% раствором хлорной извести. Спрей чистящий раствор на влажной тканью без ворса, чтобы очистить. Не выливать растворы непосредственно на приборе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом исследовании, заархивированные образцы NPS собирали из стационарных больных, представляющих с гриппоподобными симптомами в Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC) во время вспышки гриппа в период с 15 декабря 2012 года и 1 марта 2013 г. Образцы NPS были представлены в 3 мл СУДС и проходят в рамках рутинной клинической практике с молекулярным анализом, который обнаруживает группу респираторных вирусов (RP), в том числе гриппа а, а-1, а-3, и В. за исследуемый период, 3,675 NP...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Вирусы гриппа значительные мировые причины заболеваемости и смертности. Быстрый и точный диагноз гриппа является одним из основных ключей к управлению во время вспышки гриппа респираторного сезона. Другие тесты антиген на основе являются быстрым и легким для выполнения; Тем не менее, они имеют низкую чувствительность 13. С другой стороны, традиционные молекулярные тесты улучшили чувствительность, но требуют более опытных лабораторных технологов для выполнения и являются более дорогостоящими. Анал...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников Службы клинической микробиологии Мемориального онкологического центра Слоуна-Кеттеринга за помощь в сборе клинических образцов. Это исследование было частично поддержано соглашением об исследованиях между MSKCC и Alere Scarborough (SK2013-0262).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Alere i InstrumentAlereNAT-000 (Global), NAT-024 (US)
Alere i Influenza A & B 24 Тестовый наборAlere425-000 (Глобальный), 425-024 (США)
Сканер штрих-кодов Alere iУниверсальный принтер AlereEQ001001
Универсальный принтерAlere55115 (Глобальный), alereiprinter ( США)
200 &микро; l Прецизионный пипетка
200 & микро; l одноразовые наконечники
Вирусный транспортный носительRemelM4-RT
для пипеток

Ссылки

  1. Prevention control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices--United States, 2013-2014. , Report No. 1057-5987 1-43 (2013).
  2. Poehling, K. A., et al. The Underrecognized Burden of Influenza in Young Children. New England Journal of Medicine. 355 (1), 31-40 (2006).
  3. Estimates of Deaths Associated with Seasonal Influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. 59 (33), 1057-1089 (2010).
  4. Agrawal, A. S., et al. Comparative evaluation of real-time PCR and conventional RT-PCR during a 2 year surveillance for influenza and respiratory syncytial virus among children with acute respiratory infections in Kolkata, India, reveals a distinct seasonality of infection. Journal of Medical Microbiology. 58 (12), 1616-1622 (2009).
  5. Ginocchio, C. C. Strengths and Weaknesses of FDA-Approved/Cleared Diagnostic Devices for the Molecular Detection of Respiratory Pathogens. Clinical Infectious Diseases. 52, suppl 4 312-325 (2011).
  6. Grohskopf, L. A., et al. Prevention and control of seasonal influenza with vaccines: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices-United States, 2013-2014. MMWR Recomm Rep. 62 (07), 1-43 (2013).
  7. Molinari, N. -A. M., et al. The annual impact of seasonal influenza in the US: measuring disease burden and costs. Vaccine. 25 (27), 5086-5096 (2007).
  8. Aoki, F. Y., et al. Early administration of oral oseltamivir increases the benefits of influenza treatment. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 51 (1), 123-129 (2003).
  9. Noyola, D. E., Demmler, G. J. Effect of rapid diagnosis on management of influenza A infections. The Pediatric infectious disease journal. 19 (4), 303-307 (2000).
  10. Sharma, V., Dowd, M., Slaughter, A. J., Simon, S. D. EFfect of rapid diagnosis of influenza virus type a on the emergency department management of febrile infants and toddlers. Archives of Pediatrics & Adolescent Medicine. 156 (1), 41-43 (2002).
  11. Dale, S. E., Mayer, C., Mayer, M. C., Menegus, M. A. Analytical and clinical sensitivity of the 3M rapid detection influenza A+B assay. J Clin Microbiol. 46 (11), 3804-3807 (2008).
  12. van Doorn, H. R., et al. Clinical validation of a point-of-care multiplexed in vitro immunoassay using monoclonal antibodies (the MSD influenza test) in four hospitals in Vietnam. J Clin Microbiol. 50 (5), 1621-1625 (2012).
  13. Hurt, A. C., Alexander, R., Hibbert, J., Deed, N., Barr, I. G. Performance of six influenza rapid tests in detecting human influenza in clinical specimens. Journal of Clinical Virology. 39 (2), 132-135 (2007).
  14. Fiore, A. E., et al. Antiviral agents for the treatment and chemoprophylaxis of influenza --- recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). MMWR Recomm Rep. 60 (1), 1-24 (2011).
  15. Harper, S. A., et al. Seasonal influenza in adults and children--diagnosis, treatment, chemoprophylaxis, and institutional outbreak management: clinical practice guidelines of the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis. 48 (8), 1003-1032 (2009).
  16. Hannoun, C., Tumova, B. Survey on influenza laboratory diagnostic and surveillance methods in Europe. European Journal of Epidemiology. 16 (3), 217-222 (2000).
  17. Leonardi, G. P. Rapid identification of 2009 H1N1 influenza A virus using fluorescent antibody methods. Am J Clin Pathol. 134 (6), 910-914 (2010).
  18. Chartrand, C., Leeflang, M. M. G., Minion, J., Brewer, T., Pai, M. Accuracy of Rapid Influenza Diagnostic TestsA Meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 156 (7), 500-511 (2012).
  19. Lee, G. C., et al. Evaluation of a rapid diagnostic test, NanoSign(R) Influenza A/B Antigen, for detection of the 2009 pandemic influenza A/H1N1 viruses. Virol J. 7, 244(2010).
  20. Tang, Y. W., et al. Clinical accuracy of a PLEX-ID flu device for simultaneous detection and identification of influenza viruses A and B. J Clin Microbiol. 51 (1), 40-45 (2013).
  21. Bandt, D., et al. Economic high-throughput-identification of influenza A subtypes from clinical specimens with a DNA-oligonucleotide microarray in an outbreak situation. Molecular and Cellular Probes. 26 (1), 6-10 (2012).
  22. Pierce, V. M., Elkan, M., Leet, M., McGowan, K. L., Hodinka, R. L. Comparison of the Idaho Technology FilmArray system to real-time PCR for detection of respiratory pathogens in children. J Clin Microbiol. 50 (2), 364-371 (2012).
  23. Teo, J., et al. VereFlu™: an integrated multiplex RT-PCR and microarray assay for rapid detection and identification of human influenza A and B viruses using lab-on-chip technology. Archives of Virology. 156 (8), 1371-1378 (2011).
  24. Babady, N. E., et al. Comparison of the Luminex xTAG RVP Fast assay and the Idaho Technology FilmArray RP assay for detection of respiratory viruses in pediatric patients at a cancer hospital. J Clin Microbiol. 50 (7), 2282-2288 (2012).
  25. Chidlow, G., et al. Duplex real-time reverse transcriptase PCR assays for rapid detection and identification of pandemic (H1N1) 2009 and seasonal influenza A/H1, A/H3, and B viruses. J Clin Microbiol. 48 (3), 862-866 (2010).
  26. Bell, J. J., Selvarangan, R. Evaluation of the Alere I influenza A&B nucleic acid amplification test by use of respiratory specimens collected in viral transport medium. J Clin Microbiol. 52 (11), 3992-3995 (2014).
  27. Nie, S., et al. Evaluation of Alere i Influenza A&B for Rapid Detection of Influenza Viruses A and B. Journal of Clinical Microbiology. 52 (9), 3339-3344 (2014).
  28. Chapin, K. C., Flores-Cortez, E. J. Performance of the Molecular Alere i Influenza A&B Test Compared to That of the Xpert Flu A/B Assay. Journal of Clinical Microbiology. 53 (2), 706-709 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

A B

Похожие статьи