Здесь вводится оригинальная экспериментальная установка для нагрева клеток в культуральной чаше с использованием лазерного излучения непрерывной волны 1,94 мкм. Используя этот метод, можно исследовать биологические реакции эпителиальных клеток эпителия сетчатки (РПЭ) после различных термических воздействий.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Непрерывный волновой тулиевый лазер для нагревательных клеток, предназначенных для исследования клеточных тепловых эффектов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Здесь вводится оригинальный метод нагрева культивируемых клеток с использованием непрерывного волнового лазера с непрерывной волной 1,94 мкм для биологической оценки. Тулиевое лазерное излучение сильно поглощается водой, а клетки на дне культуральной чашки нагреваются посредством тепловой диффузии. Лазерное волокно диаметром 365 мкм устанавливается около 12 см над культуральной чашкой без какой-либо оптики, так что диаметр лазерного луча почти эквивалентен внутреннему диаметру культуральной тарелки (30 мм). Сохраняя постоянное количество культуральной среды в каждом эксперименте, можно облучать клетки с сильно воспроизводимым повышением температуры.
Для калибровки увеличения температуры и ее распределения в одной чашке для культивирования клеток для каждой установки мощности измеряли температуру в течение 10 с облучения в разных положениях и на клеточном уровне. Распределение температуры было представлено с использованием программного обеспечения для математической графикиПрограмма, и ее образец в блюде культуры был в гауссовой форме. После лазерного облучения можно было провести различные биологические эксперименты для оценки зависимых от температуры реакций клеток. В этой рукописи вводится окраска жизнеспособности ( т. Е. Различение живых, апоптотических и мертвых клеток), чтобы помочь определить пороговые температуры для апоптоза клеток и смерти после разных точек времени.
Достоинствами этого метода являются точность температуры и времени нагрева, а также ее высокая эффективность в нагревании ячеек в блюде культуры целых клеток. Кроме того, он позволяет проводить исследования с широким диапазоном температур и продолжительности времени, которые могут быть хорошо контролируемыми компьютеризированной операционной системой.
Введение
Понимание зависимых от температуры клеточных биологических реакций имеет большое значение для успешного лечения гипертермии. Лазерная фотокоагуляция сетчатки с термическим лазером, используемая в офтальмологии, является одним из наиболее известных методов лечения лазеров в медицине. Видимый свет, в основном от зеленой до желтой длины волны, используется при лазерной обработке сетчатки. Свет сильно поглощается меланином в эпителиальных клетках сетчатки сетчатки (РПЭ), которые образуют внешний клеточный монослой сетчатки. Недавно среди врачей и исследователей был интерес к очень мягкому термическому облучению (субвидимая фотокоагуляция) в качестве новой терапевтической....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Культура клеток RPE
- Выделение клеток РПЭ из глаз свиней
- Получите свежевыраженные глаза с свиней с местной бойни. Держите их прохладно (4 ° C) и в темной среде.
- Удалите внеклеточные ткани с помощью ножниц и промойте глаза в антисептическом растворе в течение 5 мин.
- Поместите глаза в стерилизованный забуференный фосфатом физиологический раствор без кальция и магния (PBS (-)) до использования.
- Используя скальпель, пронизывайте склеру примерно на 5 мм позади лимбомы роговицы. Резекция всей передней части глаза, разрезая ножницами на всем пути, параллельно роговице лимба.
- Удалите переднюю част....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Распределение температуры после различных настроек мощности
Все температурные изменения для каждого отдельного облучения контролировались при калибровке температуры. Из этих данных была получена максимальная температура в измеренной точке и определена как T max (° C). Как показано на фиг.3А , программа была выполнена в момент времени, когда блюдо для культуры было помещено на нагревательну.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
При обсуждении связанных с температурой биологических клеточных реакций важна не только температура, но также и продолжительность времени повышенной температуры, поскольку большинство биохимических процессов зависят от времени. В частности, в области лазерной гипертермии в офтальмологии из-за короткого промежутка времени - от миллисекунд до нескольких секунд - трудно исследовать клеточные тепловые эффекты с точным контролем температуры. Поэтому желательна установка лазерного облучения, подходящая для модели клеточной ку.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом исследования Федерального министерства образования и исследований Германии (BMBF) (грант № 13GW0043C) и Европейского бюро аэрокосмических исследований и разработок (EOARD, грант # FA9550-15-1-0443)
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>Реагенты | |||
| Дульбекко' s Модифицированный Eagle' s Средний - высокий уровень глюкозы | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | Добавить (2)-(4) перед использованием. Тепло в 37 градусов; C водяной баней перед использованием. |
| Антимикотический раствор антибиотика (100&раз;) | Sigma-Aldrich | A5955-100ML | Содержит 10 000 единиц пенициллина, 10 мг стрептомицина и 25 мкм; g Амфотерицин В в 1 мл. Добавьте 5,5 мл в средний флакон объемом 500 мл (1) перед использованием. |
| Пируват натрия (100 мМ) | Sigma-Aldrich | S8636-100ML | Добавьте 5,5 мл в средний флакон объемом 500 мл (1) перед использованием (конечная концентрация: 1 мМ) |
| Сыворотка для свиней | Sigma-Aldrich | 12736C-500ML | Добавьте 50 мл в 500 мл среднего боттола (1) перед использованием (конечный: 10%) |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Трипсин из поджелудочной железы свиньи | Sigma-Aldrich | T4799-25G | |
| Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
| Человеческий VEGF Quantikine ELISA Kit | R& D System | DVE00 | |
| Oxiselect Набор для анализа на общий глутатион | Cell Biolabs, Inc | STA-312 | |
| Набор для обнаружения апоптотических/некротических/здоровых клеток | PromoKine | PK-CA707-30018 | |
| Название | Company | Номер в каталоге | Комментарии |
| Equipment | |||
| Thulium лазер | Starmedtec GmbH | Прототип | 0-20 Вт |
| 365 мм диаметр сердечника волоконные | ЛАЗЕРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ Германия | CF01493-52 | |
| Термопара | Omega Engineering Inc | HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M | |
| Нагревательная пластина | MEDAX | ||
| Считыватель микропластин ( спектрофлуориметр) | Молекулярное устройство | : гомогенизатор клеток Spectramax M4 | |
| QIAGEN | TissueLyser LT | ||
| флуоресцентный микроскоп | Nikon | ECLIPSE, Ti | |
| математическая программа | The Mathworks. Inc | MATLAB Release 2015b | |
| платформа для проектирования систем | National Instrument | Labview | Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench |
Ссылки
- Inagaki, K., et al. Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema. Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).
- Roider, J., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
