Method Article

Микрожидкостных буфера обмена для Помехоустойчивое Micro / клеточной инженерии наночастиц

DOI:

10.3791/54327

⸱

July 10th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, 2School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University, 3NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine, Nanyang Technological University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает использование инерциальной микрофлюидики на основе стратегии буфер обмена для очистки микро / наночастиц сконструированные клетки с эффективным истощению несвязанных частиц.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инженерные клетки с активным ингредиентом загруженным микро / наночастиц (NPS) становится все более популярным методом для повышения нативные терапевтические свойства, позволяют био визуализации и контроля клеточного фенотипа. Критическим еще недостаточно поставленный вопрос, является значительное количество частиц, которые остаются несвязанными после мечения клеток, которые не могут быть легко удалены с помощью обычного центрифугирования. Это приводит к увеличению био фонового изображения шума и могут придавать трансформирующие эффекты на соседние не-клеток-мишеней. В этом протоколе, мы представляем инерциальную микрофлюидики стратегию на основе буфера обмена называется, как Дин Flow фракционирования (DFF) эффективно отделить меченые клетки от свободных NPs в высокой пропускной способности способом. Разработанная спираль Микроприбор облегчает непрерывный сбор (> 90% восстановления клеток) очищенных клеток (THP-1 и МСК), взвешенных в новом буферном растворе, при достижении> 95% истощение несвязанного флуоресцентного красителя или красителя загружены NPs (SilВСА или PLGA). Этот одноступенчатый, размер на основе стратегии очистки кювет позволяет использовать пропускную способность обработки высокой клетки (10 6 клеток / мин) и является весьма полезным для очистки клеток большого объема микро / наночастиц инженерии клеток для достижения без помех клинического применения.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инженерной клетки агентом загруженным микро / наночастиц (NPS) представляет собой простой, геномная интеграция свободной и универсальный метод для повышения способности биоимиджинга и увеличить / дополнить свои собственные лечебные свойства в регенеративной медицине. 1-3 Клеточные модификации достигается путем маркировки плазменной мембраны или цитоплазмы с избыточной концентрацией агента загружены NPs насытить сайты связывания. Тем не менее, основным недостатком этого метода является значительное количество несвязанных частиц , оставшихся в растворе после процессов маркировки клеток, которые потенциально могут посрамить точной идентификации частиц инженер....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Наночастицы (NPS) Маркировка мезенхимальных стволовых клеток и моноцитов

  1. Культура мезенхимальные стволовые клетки (МСК) в среде Игла в модификации Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и антибиотиков до ≥80% сплошности до маркировки. Точно так же, культура ТНР-1 клетки (ATCC) в Институте Roswell Park Memorial (RPMI) 1640 , дополненной 10% FBS до плотности ~ 10 6 клеток / мл.
  2. Нагрузка кремнезема NPs (~ 500 мкм) с раствором кальцеин красителя (200 мкМ) с использованием перемешивания в течение ночи. Изготовить PLGA-кальцеина AM (CAM) с использованием протокола , описанного ранее. 22
    1. Раствори....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После мечения клетки с био визуализации агента загруженным NPs в течение ночи, меченые клетки (содержащие свободные частицы) собирают и очищают с помощью DFF спиральной микроустройство для удаления свободных NPS в одном процессе шаг (рисунок 1А). 2-впуск, 2-розетка спиральная Микроканал разработан инженерного программного обеспечения и микроизготовленном использованием SU-8 фоторезиста. Узорной кремниевой пластины затем используется в качестве шаблона для PDMS реплики фо.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Технология очистки клеток ДФФ, описанные здесь обеспечивает быстрое и непрерывное разделение меченых клеток в высокой пропускной способности способом. Такой подход разделения идеально подходит для большого объема образца или высокой концентрации клеток в обработке образцов, и лучше, чем обычные мембранной фильтрации на основе который подвержен засорению после длительного использования. Точно так же, аффинность на основе магнитной сепарации требует дополнительных стадий мечения клеток, которые являются трудоемкими и доро.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Добрый подарок в виде клеток THP-1 от доктора Марка Чонга и помощь в микропроизводстве от доктора Юэцзюнь Канга и доктора Нишанта В. Менона (Школа химической и биомедицинской инженерии, Наньянский технологический университет) были высоко оценены. Этот проект финансировался НТУ-Северо-Западным институтом наномедицины (Наньянский технологический университет). H.W.H. был поддержан стипендией Медицинской школы Ли Конг Чиан (LKCMedicine) для постдокторантуры.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Lines & Медиа
мезенхимальные стволовые клетки (МСК)LonzaPT-2501
Dulbecco' s модифицированный Eagle' s среда (DMEM)Lonza12-614F
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Gibco10270-106
THP-1 моноцитарные клетки (THP-1)ATCCTIB-202
Мемориальный институт Розуэлл Парк (RPMI) 1640 медиаLonza12-702F
<стронг>реагенты и реагенты и Материалы
0,01% поли-L-лизин (PLL)Sigma-AldrichP8920
3 мл ШприцBD302113Шприц 3 мл Люер-Лок
60 мл ШприцBD309653Шприц 60 мл Люэр-Лок
Бычья сыворотка Альбумин (БСА)BiowestP6154-100GR
Кальцеин, AM (CAM)Life TechnologiesC1430
КальцеинСигма-ОлдричC0875
изопропанолFisher Chemical#P/7507/17ВЭЖХ Класс 2,5 л
фосфатно-солевой буфер (PBS)Lonza17-516Q/12
Предметные стекла для микроскопаFisher ScientificFIS#12-550D75 x 25 x 1 мм3
Полидиметилсилоксан (PDMS)Dow CorningSYLGARD® 184
Скотч3М2120070204418 мм x 25 м
Silica NPs (∼ 200 μ m)Sigma-Aldrich748161Размер пор 4 нм
Наконечник шприцаJEC Technology701830223 г 0,013 x 0,25
Трипсин-ЭДТА (0,25%)Life Technologies25200-056
Tygon TubingSpectra-Teknik06419-010,02 x 0,06" 100
Poly (D,L-лактид-ко-гликолид) (PLGA; 50:50)Sigma-AldrichP2191
Equipment
Biopsy PunchHarris Uni-Core69036-151,50 мм
DessicatorScienceware111/4 IN OD
Высокоскоростная камераPhantom V9.1
Инвертированный фазово-контрастный микроскоп ПлазменныйEclipse Ti
HarrickPDC-002
ChemyxCX Fusion 200
очиститель Nikon Шприцевой насос

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wiraja, C., et al. Aptamer technology for tracking cells' status & function. Mol. Cell. Ther. 2, 33(2014).
  2. Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. Nanosensors for Regenerative Medicine. J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).
  3. Naumova, A. V., Modo, M., ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic Buffer ExchangeDean Flow FractionationNanoparticle Cell EngineeringSpiral MicrodeviceCell PurificationFlow CytometryInertial FocusingHigh Throughput ProcessingUnbound Nanoparticle RemovalSize Based Separation

Related Articles