Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В пробирке и в естественных моделей для изучения роговичный эндотелий мезенхимальных перехода

7.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54329

⸱

20 августа 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Far Eastern Memorial Hospital, 2Institute of Clinical Medicine, National Taiwan University, 3Department of Ophthalmology, National Taiwan University Hospital, 4College of Medicine, National Taiwan University

В этой статье

Краткое содержание

Первичная культура бычьих роговичных эндотелиальных клеток использовали для исследования механизма роговицы эндотелиальной-мезенхимальных перехода. Кроме того, эндотелий роговицы модель криоповреждений крыс использовали для демонстрации роговицы переход эндотелиальной-мезенхимальных в естественных условиях.

Аннотация

Эндотелиальные клетки роговицы (ЦЭК) играют решающую роль в поддержании чистоты роговицы за счет активной накачки. Снижение количества CEC может привести к отеку роговицы и снижению остроты зрения. Тем не менее, ЦЭК человека склонны к нарушенному пролиферативному потенциалу. Кроме того, стимуляция роста клеток часто осложняется постепенным эндотелиально-мезенхимальным переходом (ЭнМТ). Таким образом, понимание механизма EnMT необходимо для содействия регенерации CEC с компетентной функцией. В этом исследовании мы подготовили первичную культуру КЭК крупного рогатого скота путем отшелушивания КЭК с десцеметовой мембраной от пуговика роговицы и продемонстрировали, что ЦЭК крупного рогатого скота проявляют процесс EnMT, включая фенотипические изменения, ядерную транслокацию β-катенина и регуляторы ЭМП улитки и слизня, в культуре in vitro. Кроме того, мы использовали модель криоповреждения эндотелия роговицы крысы для демонстрации процесса EnMT in vivo. В совокупности первичная культура ЦЭК крупного рогатого скота in vitro и модели криотравмы эндотелия роговицы крыс in vivo предлагают полезные платформы для исследования механизма EnMT.

Введение

Эндотелиальные клетки роговицы (CEC) играют жизненно важную роль в поддержании чистоты роговицы и, следовательно, остроты зрения, регулируя статус гидратации стромы роговицы посредством активной накачки1. Из-за ограниченного пролиферативного потенциала CEC человека количество клеток уменьшается с возрастом, и восстановление эндотелиальных ран роговицы после повреждения обычно достигается за счет увеличения и миграции клеток, а не клеточного митоза. Когда количество CEC снижается ниже порогового значения примерно 500 клеток/мм2, дегидратационный статус стромы роговицы не может быть поддержан, что приводит к буллезной кератопатии и ухудшениюзрения3,4.

Ограниченный пролиферативный потенциал CEC человека был связан с несколькими факторами, включая снижение экспрессии эпидермального фактора роста и его рецептора в стареющих клетках5, антипролиферативный TGFβ2 в водянистой влаге6 и контактное ингибирование2,7. Хотя некоторые факторы роста, такие как основной фактор роста фибробластов (bFGF), могут увеличивать пролиферацию в культивируемом эндотелии роговицы человека, эффективность культивирования остается ограниченной8,9. Кроме того, ЦЭК могут претерпевать фенотипические изменения во время экспансии ex vivo, напоминающие эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП)10-13. Эндотелиально-мезенхимальный переход (ЭнМТ) характеризуется дестабилизацией клеточного соединения, потерей апикально-базальной полярности, цитоскелетной перестройкой, экспрессией альфа-гладкомышечного актина и секрецией коллагена I типа14. Все эти характеристики могут нарушать нормальную функцию ЦЭК, препятствуя использованию культивируемых ex vivo КЭК в тканевой инженерии. Кроме того, EnMT была связана с патогенезом нескольких эндотелиальных заболеваний роговицы, включая эндотелиальную дистрофию роговицы по Фуксу и образование ретророгнеальных мембран15,16. Таким образом, понимание механизма EnMT может помочь в манипулировании процессом EnMT и способствовать регенерации CEC для обеспечения компетентного функционирования.

В этом исследовании мы описали метод выделения CEC крупного рогатого скота из роговичного пуговика. В первичной культуре in vitro наблюдался процесс EnMT, включающий фенотипическое изменение, ядерную транслокацию β-катенина и регуляторы ЭМП улитки и слизня. Далее мы описали метод демонстрации EnMT in vivo с использованием модели криоповреждения эндотелия роговицы крысы. Используя эти 2 модели, мы продемонстрировали, что маримастат, ингибитор матриксной металлопротеиназы (ММП) широкого спектра действия, может подавлять процесс EnMT. Описанные протоколы облегчают детальный анализ механизма EnMT и разработку стратегий манипулирования процессом EnMT для дальнейшего клинического применения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры, применяемые в данном исследовании был предоставлен с Ассоциацией по исследованиям в области зрения и офтальмологии Заявление для использования животных в офтальмологических и Vision Research и были одобрены Institutional Animal Care и использование комитета Национальной больницы Тайваньского университета путем.

1. Выделение, первичная культура Подготовка и Иммунологическое бычьего центральноевропейских стран

  1. Приобретайте свежие бычьи глаза от местной скотобойни.
  2. Лечить глаза в 10% вес / об повидон-йода в течение 3 мин. Промыть их раствором с фосфатным буфером (PBS).
  3. Заготавливают кнопку роговичный скальпелем и ножницами в стерильных условиях. Мембрана Пил Десцеметова с пинцетом под микроскопом рассекает (обратите внимание, что в данном исследовании, бычьего глаза были энуклеировали местной скотобойни, поэтому первая процедура исследования была дезинфекция preenucleated глаз в лаборатории).
  4. Инкубируйте мембраны Десцеметова в 1 мл попыткиpsin при 37 ° С в течение 30 мин. Собрать бычьей CECS центрифугированием при 112 мкг в течение 5 мин. Ресуспендируют клеток в 1 мл дополненной гормонального эпителиальной среды (SHEM), содержащий равные объемы HEPES-забуференной модифицированной среде Дульбекко орла и среды F12 Хэма, дополненной 5% фетальной бычьей сыворотки, 0,5% диметилсульфоксида, 2 нг / мл человеческого эпидермального фактора роста, 5 мг / мл инсулина, 5 мг / мл трансферрина, 5 нг / мл селена, 1 нмоль / л холерного токсина, 50 мг / мл гентамицина, и 1,25 мг / мл амфотерицина B.
  5. Семенной клетки (приблизительно 1 × 10 5 клеток на глаз) в 6 см чашку. Культура их в Шем. Инкубируйте блюдо при 37 ° С в атмосфере 5% CO 2 в воздухе. Изменение культуральной среды каждые 3 дня.
  6. Когда клетки достигают слияния, промыть их в PBS и инкубируют их в 1 мл трипсина при 37 ° С в течение 5 мин. Собирают их центрифугированием при 112 х г в течение 5 мин. Повторное приостановить осадок клеток в 1 мл Шем.
    1. Граф клеток в гемоцитометра. Семенной клетки на крышке скользит при плотности 1 × 10 4 на лунку в 24-луночного планшета и культуры клеток в Шем. Для исследования EnMT подавляющий эффект маримастату, инкубировать клетки в SHEM с 10 мкМ маримастату добавлены в культуральную среду, и изменение культуральной среды через каждые 3 дня.
  7. Зафиксировать клетки, на указанный момент времени 250 мкл 4% параформальдегида, рН 7,4, в течение 30 мин при комнатной температуре. Проницаемыми с 250 мкл 0,5% Тритона Х-100 в течение 5 мин. Блок с 10% бычьего сывороточного альбумина в течение 30 мин.
  8. Инкубируйте клетки с первичными антителами против активного бета-катенина (ABC), улитка, и слизня в течение ночи при температуре 4 ° С. Разбавление первичных антител составляет 1: 200. Антитела разводят в разбавителе антитела, состоящего из 10 мМ PBS, 1% вес / об бычий сывороточный альбумин, и 0,09% вес / об азид натрия.
  9. Вымойте клетки дважды с PBS в течение 15 мин и инкубироватьм с Alexa Fluor-конъюгированного вторичного антитела (1: 100 в разбавителе антител) при комнатной температуре в течение 1 часа.
  10. Проводят контрастное ядро ​​клетки путем покрытия клеток с 2 мкг / мл 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола, промыть клетки дважды с PBS в течение 15 мин, и смонтировать их с анти-выцветанию решение для монтажа.
  11. Получить иммунофлуоресцентного изображения при возбуждении длинами волн 405 и 488 нм с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с 20X объективным увеличением.

2. Крыса эндотелий роговицы криоповреждений Модель и внутрикамерное Инъекции

  1. Обезболить 12-недельных крыс-самцов Sprague-Dawley с внутримышечных инъекций 2% ксилазином (5,6 мг / кг) и tiletamine плюс zolazepam (18 мг / кг). Аккуратно ущипнуть кожу животных, чтобы подтвердить правильность анестезии при отсутствии подергивание кожи.
  2. Закапывание одну каплю 0,5% пропаракаина гидрохлорида в правый глаз каждой крысы, чтобы свести к минимуму боль глаза и рефлекс моргания. внушатьмазь тетрациклина в левый глаз, чтобы предотвратить сухость роговицы.
  3. Охлаждают зонд из нержавеющей стали (диаметр = 3 мм) в жидком азоте. Нанести стального зонда из нержавеющей к центральной роговицы правого глаза в течение 30 сек. Часто привить PBS в правый глаз во время процедуры, чтобы предотвратить сухость роговицы.
  4. Закапывание 0,1% атропин и 0,3% сульфата гентамицина сразу после криоповреждений и один раз в день, чтобы уменьшить глазной боли в результате цилиарного спазма и предотвратить инфекцию.
    1. После процедуры, держать крыс подогреть с помощью тепла лампы, и наблюдать за их восстановление через каждые 15 мин после анестезии, пока они не восстановить контроль двигателя. Кроме того, применяют мазь тетрациклина в правый глаз, чтобы предотвратить сухость роговицы в течение периода восстановления.
  5. Повторите роговой криоповреждений в течение 3 дней подряд.
  6. Для доставки маримастату или bFGF в переднюю камеру глаза крыс, анестезию крыс, как описано выше. Привить одну каплю0,5% пропаракаина гидрохлорида в правый глаз, чтобы свести к минимуму боль в глазах и рефлекс моргания.
  7. Промывать глазную поверхность стерильным PBS. Выполнение передней камеры парацентез под операционным микроскопом, вставляя иглу 30 G, прикрепленную к 1 мл шприца в paralimbal прозрачного роговицы в плоскости и располагалась параллельно радужки.
  8. Поверните иглу скосом вверх, и слегка нажмите на рану роговицы, чтобы слить некоторый водный юмор и снизить внутриглазное давление. Вводят 0,02 мл препарата intracamerally. Аккуратно сжать иглы тракта с наконечником хлопка во время снятия иглы.
  9. Сфотографируйте внешний глаз на указанный момент времени под операционным микроскопом.

3. Сбор Крыса Роговичная Баттон и Иммунологическое

  1. Для эвтаназии крыс, поместите их в эвтаназии камере и влить 100% CO 2 при скорости заполнения 10-30% от объема камеры в минуту. Поддерживать CO 2 инфузии в течениедополнительная минута после отсутствия дыхания и выцветшие глаза.
  2. Проникнуть глаз крысы у лимба с острым лезвием. Вырезать роговицу ножницами вдоль роговицы лимба. Свести роговицу на слайде. Сделайте дополнительные радиальные надрезы, если роговица свернуться.
  3. Закрепить роговицу с 250 мкл 4% параформальдегида, рН 7,4, в течение 30 мин при комнатной температуре. Проницаемыми с 250 мкл 0,5% Тритона Х-100 в течение 5 мин, и блок с 10% бычьего сывороточного альбумина в течение 30 мин.
  4. Выдержите в роговицу с первичными антителами против ABC в течение ночи при 4 ° С с разбавлением 1: 200 в разбавителе антител. Промыть роговицу дважды с PBS в течение 15 мин, и инкубировать их с вторичным антителом (1: 100 в разбавителе антител) при комнатной температуре в течение 1 часа. Проводят контрастное ядро ​​клетки путем покрытия клеток с 2 мкг / мл 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола, и промыть клетки дважды с PBS в течение 15 мин.
  5. Установите роговицу в анти-выцветания решение для монтажа. ОбьТайн в иммунофлуоресцентного изображения при возбуждении длинами волн 405 и 561 нм с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии при увеличении 20Х объективного.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После выделения крупного рогатого скота центральноевропейских стран, клетки культивировали в пробирке. На рисунке 1 представлены фазовый контраст изображения говяжьих центральноевропейских стран. Шестиугольная форма клеток при слиянии показали , что клетки не были загрязнены роговичной стромы фибробластами во время выделения клеток. Рисунок 2 изображает иммунным , которая была выполнена с использованием антител против ABC, улитка, и слизня на ук...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

CECs известны своей склонностью к претерпевать EnMT во время пролиферации клеток. Для того, чтобы разработать стратегии для подавления процесса EnMT в терапевтических целях, глубокое понимание механизма EnMT необходимо. Мы описали 2 модели для исследования EnMT, а именно ЦИК крупного рогатого скота в пробирке модель культуры и крысы эндотелий роговицы модели криоповреждений. Наши результаты продемонстрировали процесс EnMT в обеих моделях. Кроме того, EnMT подавляющий эффект маримастату был воспроизведен в обеих...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов, о которых они могли бы заявить.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников Второй основной лаборатории, Отделения медицинских исследований, Национальной университетской больницы Тайваня за их техническую поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
трипсинThermoFisher Scientific12604-013
Dulbecco' s модифицированная среда Eagle и среда Ham's F12ThermoFisher Scientific11330
фетальная бычья сывороткаThermoFisher Scientific26140-079
диметилсульфоксидSigmaD2650
эпидермальный фактор роста человекаThermoFisher ScientificPHG0311
инсулин, трансферрин, селен ThermoFisher Scientific41400-045
холерный токсинSigmaC8052-1MG
гентамицинThermoFisher Scientific15750-060
амфотерицин BThermoFisher Scientific15290-026
параформальдегидэлектронная микроскопия Sciences111219
Triton X-100SigmaT8787 
бычья сыворотка альбуминSigmaA7906
маримастатSigmaM2699-25MG
антиактивное антитело бета-катенинMillpore05-665
антитело против улиткиSanta cruzsc28199
антитело против слизнейSanta cruzsc15391
козье антитело против мыши IgG (H+L) вторичное антителоThermoFisher ScientificA-11001для окрашивания ABC бычьих CEC
козы против мыши IgG (H+L) вторичное антителоThermoFisher ScientificA-11003для окрашивания ABC крысы эндотелия роговицы
козы антикролика IgG (H+L) вторичное антителоThermoFisher ScientificA-11008для окрашивания улитки и слизняка бычьего CEC
антитела разбавитель антителGenemed Биотехнологии10-0001
4',6-диамидино-2-фенилиндолThermoFisher ScientificD1306
монтажный носительVector LaboratoriesH-1000
лазерный сканирующий конфокальный микроскопZEISSLSM510
ксилазин BayerN/A тилетамин
плюс золазепамVirbacN/A Ветеринарныйпрепарат
пропаракаина гидрохлорид офтальмологический растворAlconN/Aветеринарный препарат
0,1% атропинWu-Fu Laboratories Co., LtdН/Дклинический препарат 
0,3% гентамицина сульфатСинфар ГруппаН/Дклинический препарат
базовый фактор роста фибробластовThermoFisher ScientificPHG0024клинический препарат 

Ссылки

  1. Maurice, D. M. The location of the fluid pump in the cornea. J Physiol. 221 (1), 43-54 (1972).
  2. Joyce, N. Proliferative capacity of the corneal endothelium. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (3), 359-389 (2003).
  3. Morishige, N., Sonoda, K. H. Bullous keratopathy as a progressive disease: evidence from clinical and laboratory imaging studies. Cornea. 32, Suppl 1 77-83 (2013).
  4. Bates, A. K., Cheng, H., Hiorns, R. W. Pseudophakic bullous keratopathy: relationship with endothelial cell density and use of a predictive cell loss model. A preliminary report. Curr Eye Res. 5 (5), 363-366 (1986).
  5. Wilson, S. E., Lloyd, S. A. Epidermal growth factor and its receptor, basic fibroblast growth factor, transforming growth factor beta-1, and interleukin-1 alpha messenger RNA production in human corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 32 (10), 2747-2756 (1991).
  6. Chen, K. H., Harris, D. L., Joyce, N. C. TGF-beta2 in aqueous humor suppresses S-phase entry in cultured corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40 (11), 2513-2519 (1999).
  7. Senoo, T., Obara, Y., Joyce, N. C. EDTA: a promoter of proliferation in human corneal endothelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (10), 2930-2935 (2000).
  8. Yue, B. Y., Sugar, J., Gilboy, J. E., Elvart, J. L. Growth of human corneal endothelial cells in culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (2), 248-253 (1989).
  9. Peh, G. S., Beuerman, R. W., Colman, A., Tan, D. T., Mehta, J. S. Human corneal endothelial cell expansion for corneal endothelium transplantation: an overview. Transplantation. 91 (8), 811-819 (2011).
  10. Zhu, C., Rawe, I., Joyce, N. C. Differential protein expression in human corneal endothelial cells cultured from young and older donors. Mol Vis. 14, 1805-1814 (2008).
  11. Ko, M. K., Kay, E. P. Regulatory role of FGF-2 on type I collagen expression during endothelial mesenchymal transformation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4495-4503 (2005).
  12. Lee, H. T., Kay, E. P. FGF-2 induced reorganization and disruption of actin cytoskeleton through PI 3-kinase, Rho, and Cdc42 in corneal endothelial cells. Mol Vis. 9, 624-634 (2003).
  13. Pipparelli, A., et al. ROCK Inhibitor Enhances Adhesion and Wound Healing of Human Corneal Endothelial Cells. PloS one. 8 (4), e62095(2013).
  14. Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Theriault, M., Proulx, S. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1228-1237 (2015).
  15. Jakobiec, F. A., Bhat, P. Retrocorneal membranes: a comparative immunohistochemical analysis of keratocytic, endothelial, and epithelial origins. Am J Ophthalmol. 150 (2), 230-242 (2010).
  16. Okumura, N., et al. Involvement of ZEB1 and Snail1 in excessive production of extracellular matrix in Fuchs endothelial corneal dystrophy. Lab Invest. 95 (11), 1291-1304 (2015).
  17. Okumura, N., et al. Enhancement on primate corneal endothelial cell survival in vitro by a ROCK inhibitor. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3680-3687 (2009).
  18. Zhu, Y. T., Chen, H. C., Chen, S. Y., Tseng, S. C. G. Nuclear p120 catenin unlocks mitotic block of contact-inhibited human corneal endothelial monolayers without disrupting adherent junctions. J Cell Sci. 125 (15), 3636-3648 (2012).
  19. Ho, W. T., et al. Inhibition of Matrix Metalloproteinase Activity Reverses Corneal Endothelial-Mesenchymal Transition. Am J Pathol. 185 (8), 2158-2167 (2015).
  20. Kay, E. D., Cheung, C. C., Jester, J. V., Nimni, M. E., Smith, R. E. Type I collagen and fibronectin synthesis by retrocorneal fibrous membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 22 (2), 200-212 (1982).
  21. Li, C., et al. Notch Signal Regulates Corneal Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Am J Pathol. 183 (3), 786-795 (2013).
  22. Okumura, N., et al. The ROCK Inhibitor Eye Drop Accelerates Corneal Endothelium Wound Healing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (4), 2493-2502 (2013).
  23. Mannermaa, E., Vellonen, K. S., Urtti, A. Drug transport in corneal epithelium and blood-retina barrier: emerging role of transporters in ocular pharmacokinetics. Adv Drug Deliv Rev. 58 (11), 1136-1163 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

in vitroin vivoFGF
В пробирке и в естественных моделей для изучения роговичный эндотелий мезенхимальных перехода
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.