Методическая статья

Изготовление Перевернутый коллоидный кристалл поли (этиленгликоль) строительные леса: трехмерная Cell Culture платформа для печени тканевой инженерии

9.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54331

⸱

27 августа 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

В этой статье

Краткое содержание

В этой рукописи представлен подробный протокол изготовления новой трехмерной платформы для культивирования гепатоцитов, инвертированного коллоидного кристаллического каркаса и сопутствующих методов оценки поведения гепатоцитов. Контролируемые по размеру поры, взаимосвязанность и способность конъюгировать белки внеклеточного матрикса с каркасом полиэтиленгликоля (ПЭГ) повышают производительность клеток Huh-7.5.

Аннотация

Способность поддерживать функцию гепатоцитов в пробирке, для целей тестирования цитотоксичности ксенобиотиков, изучение вирусной инфекции и разработки лекарств , нацеленных на печень, требует платформу , в которой клетки получают соответствующие биохимические и механические сигналы. Последние ткани печени инженерные системы использовали трехмерные (3D) каркасы, состоящие из синтетических или натуральных гидрогели, учитывая их высокую задержку воды и их способность обеспечивать механические стимулы, необходимые клетками. Там было растущий интерес к перевернутой коллоидный кристалл (ICC) эшафот, новейшая разработка, которая обеспечивает высокую пространственную организацию, однотипны и взаимодействие гетеротипичной клеток, а также матрицу взаимодействия (ECM) клеточно-внеклеточный. В данном случае мы опишем протокол для изготовления строительных лесов ICC с использованием поли (этиленгликоль) диакрилат (PEGDA) и метод выщелачивания частиц. Если коротко, то решетка изготовлена ​​из частиц микросфер, после чего предварительно polymeR раствор добавляют, правильно полимеризуется, а частицы затем удаляются, или выщелоченные, с использованием органического растворителя (например, тетрагидрофуран). Растворение результатов решетки в сильно пористом помост с контролируемым размером пор и interconnectivities, которые позволяют медиа достичь клетки более легко. Эта уникальная структура позволяет большую площадь поверхности для клеток придерживаться, а также легкой связи между порами, а также возможность покрыть ICC эшафот PEGDA с белками также показывает заметное влияние на производительность клеток. Мы анализируем морфологии эшафот, а также гепатокарциномой клетки поведения (Хух-7,5) с точки зрения жизнеспособности и функции для изучения влияния структуры ICC и ECM покрытий. В целом, этот документ содержит подробный протокол формирующейся строительных лесов, который имеет широкое применение в тканевой инженерии, особенно печени тканевой инженерии.

Введение

Печень является насыщена сосудами орган с множеством функций, в том числе детоксикацию крови, метаболизма ксенобиотиков, а также при производстве сывороточных белков. Ткань печени имеет сложную трехмерную (3D) микроструктуру, состоящий из нескольких типов клеток, желчные канальцы, синусоиды и зон различного состава BIOMATRIX и различных концентраций кислорода. Учитывая эту сложную структуру, было трудно создать правильную модель печени в пробирке 1. Тем не менее, существует растущий спрос на функционал в моделях пробирке хостинг гепатоцитов человека в качестве платформ для тестирования лекарственной токсичности 2 и изучение заболеваний , связанных с печенью 3.

Текущий ткани печени инженерные платформы упростили сложность печени путем выделения одного или сосредоточив внимание на некоторые из них, параметров печени, а именно совместное культивирование клеток 4, биохимический состав гопал микросреды 5, динамика 6,7 потока и конфигурация биоматрицы 8. Конфигурация биоматрицы можно разбить на такие параметры, как каркасные материалы, состав внеклеточного матрикса (ЕСМ) белки, матрица жесткости, а также конструкции и структуры строительных лесов. Там было увеличение инженерных исследований тканей с использованием синтетических гидрогели, особенно поли (этиленгликоль) (ПЭГ) гидрогели 9, принимая во внимание возможность настраивать механические свойства, биологическая активность и скорость разложения гидрогеля в. Что касается печени исследований , связанных, биосовместимый гидрогель был применен для исследования вирусной инфекции заболевания печени 3. В конструкции платформы гепатоцитов, многочисленные исследования использовали гепатоцитов сэндвич культур 10,11 и клеток герметизацию в гидрогель 12,13 , чтобы обеспечить 3D окружающей среды и клеток-ECM и взаимодействия клетка-клетка , которые имеют важное значение , чтобы имитировать в естественных условиях микросреды. ХауВер, эти платформы не обладают высокой степенью контроля и пространственной организации, что приводит к неравномерной свойств через строительные леса 14.

Перевернутый кристалл коллоидный (ICC) 14 строительных лесов является высоко организованной 3D эшафот для культивирования клеток , которая была впервые введена в начале 2000 - х годов. уникальная структура эшафот можно отнести к простому процессу изготовления с использованием коллоидного кристалл, упорядоченную решетку коллоидных частиц переменного диаметра. В кратком изложении, чтобы подвести итог процесса, частицы аккуратно уложенные и отжигают с использованием тепла, образуя решетку. Выщелачивание этой решетки, органическим растворителем, в полимеризованной приводит гидрогелевых в шестиугольника упакованная сферических полостей 15 с высокой площадью поверхности. Это высокоупорядоченную подмости были ранее с обеих синтетических и натуральных материалов, в том числе , но не ограничиваясь ими поли (акриламид) , 16-21, поли (молочной-гликолевой кислоты) 15,22-30, Поли (этиленгликоль) , 31,32, поли (2-гидроксиэтилметакрилат) 21,33-35, и хитозан 36-39. Каркасы из ICC не обрастания материалов , как правило, способствуют клеточные сфероидов внутри полостей 14,23,40. Несколько типов клеток было показано , что успешно пролиферировать, дифференцироваться и функционировать в рамках этой конфигурации, в том числе хондроцитами 41, костный мозг стромальные клетки 42, и стволовые клетки 43,44. Что касается гепатоцитов, были проведены исследования с МТП каркасах из Na 2 SiO 3 и поли (акриламид), но не PEG. С помощью простых стратегий биоконъюгации (т.е. амин связи через EDC / NHS), ECM белки-сопряженными каркасы ПЭГ-основе могут быть изготовлены, которые могут доказать , сайты связывания более клеток , чтобы быть более в естественных условиях , как окружающая среда и улучшать функцию печени.

В этой рукописи и связанной с ним видео, мы подробно изготовление эшафот ICCс использованием поли (этиленгликоль) диакрилат (PEGDA) гидрогеля и полистирольных микросфер решетку, оптимизированный для гепатокарциномой (Хух-7,5) культуры. Показано, различия между голыми в целом неадгезивных каркасы ICC PEGDA и коллагеновой покрытием PEGDA МТП эшафот с точки зрения топологии строительных лесов и производительности клеток. Жизнеспособность клеток и функции измеряются качественно и количественно оценить поведение клеток Huh-7.5.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. МТП Эшафот Fabrication (Рисунок 1)

  1. Подготовьте полистирол (PS) решетки (диаметр = 6 мм; 8-13 слои шариков).
    1. Чтобы подготовить почву, отрезать кончики от от 0,2 мл кипячения доказательство микропробирок на уровне 40 мкл. Приклейте верхнюю часть срезанных труб до 24 х 60 мм 2 микроскопа покровного стекла промахов с водонепроницаемым клеем.
    2. Помещенный сферы PS (диаметр = 140 мкм), содержащиеся в водной суспензии в мл флакон 20, осторожно пипеткой по подвесу воды, и добавить 18 мл 70% -ного раствора этанола в пробирке. Помещенный решение сферы в ультразвуковой ванне, чтобы ослабить агрегированные сферы. Повторите эту стадию промывки несколько раз для того, чтобы удалить воду и водорастворимые компоненты полностью.
    3. Пипетировать 100 мкл этанола в пресс-формы.
    4. Отрежьте верхнюю часть 200 мкл микропипетки наконечник на 4 мм. Пипетка 25 мкл сфер в пресс-форму в два раза с использованием 200 мкл микропипетки для достиженияобщий объем 50 мкл в каждую пресс-форму.
    5. Поместите формы на ротационном шейкере при 120 оборотов в минуту в течение ночи.
    6. Проверьте расположение сфер в каждой пресс-форме под оптическим микроскопом. Если сферы не упорядочены шестиугольной, добавить 50 мкл 70% этанола и встряхивают вручную в продольном и поперечном направлении оси, чтобы исправить расположение.
    7. Пусть испариться этанол, при комнатной температуре (RT) в течение двух ночей. Поместите форму и бусинка комплекс в C печи 130 ° в течение 6 ч для отжига PS бусинки.
  2. Подготовка и босые ECM покрытием каркасы PEGDA.
    1. Обобщить PEGDA макромеры с использованием установленных протоколов 45,46 для acrylating линейных ПЭГ макромеры (M W = 4,6 кДа).
    2. Готовят 50% (вес / объем) раствор PEGDA в деионизованной (ДИ) воды и позволяют макромер правильно растворить центрифугированием при 4,713 XG, пока он полностью не растворится.
      1. Для ECM, конъюгированный каркасах ICC, растворите дополнительный10% (вес / объем) акрилоил-ПЭГ-НГС (М ш = 3,4 кД) в 50% -ном растворе PEGDA.
    3. Приготовьте 20% (вес / об) маточного раствора 2-гидрокси-4 '- (2-гидроксиэтокси) -2-метилпропиофенон (PI) в 70% этаноле.
    4. Добавляют 50 мкл 20% (вес / объем) PI маточного раствора на 1 мл 50% (вес / объем) PEGDA. Отрегулировать необходимое количество PI исходного раствора, основанного на молекулярной массе PEGDA.
    5. Вихревой смесь в центрифужной пробирке в течение 1 мин, чтобы достичь однородного раствора.
    6. Очистите формы от предметное стекло (со стадии 1.1.7), удалить клей из пресс-форм, раздвинуть решетки тщательно с помощью шпателя и поместите каждый из них в 1,5 мл трубки. Пипеток 300 мкл раствора PEGDA и центрифуге при 845 мкг в течение 5 мин, чтобы обеспечить надлежащее PEGDA решение инфильтрации в решетке.
    7. Удалите решетку из трубки с помощью пинцета и тщательно промокните сухой избыток раствора PEGDA на перчатках. Поместите решетку на парафиновой пленки, покрытой стеклом с плоской CIRлярных поверхность лицевой стороной вверх.
    8. Выставляют решение PEGDA пропитанную леску до 365 нм ультрафиолетового (УФ) излучения (10,84 мВт / см 2) в течение 5 мин с использованием УФ - спот лампа.
    9. Поместите PEGDA-полимеризованные кристаллические решетки в новых флаконах (около 10 решеток на флакон) и добавляют 20 мл тетрагидрофурана (ТГФ). Встряхнуть чаш на орбитальном шейкере со скоростью 300 оборотов в минуту. Изменение ТГФ по меньшей мере, 3 раза с интервалом 1-2 ч.
      Примечание: Не удалить ТГФ полностью при изменении ТГФ, чтобы предотвратить пузыри от попадания строительные леса, которые, в свою очередь, может привести к неполному удалению PS. Оставьте достаточно раствора для покрытия решетки и добавить новую ТГФ.
      Внимание: ТГФ является токсичным. Надевайте перчатки, лабораторный халат и защитные очки. Избегайте вдыхания при работе под вытяжкой.
    10. Проверьте, если сферы PS растворяются, помещая воду в использованный раствор ТГФ и наблюдая цвет раствора. Повторите шаг 1.2.9, если сферы PS должным образом не растворится.
      Примечание: цветовое решение изменитсябелый, если есть какие-либо оставшиеся PS сферы.
  3. Очистите каркасы в шкафу биологической безопасности (BSC).
    1. Стерилизовать каркасы, готовят 50 мл центрифужные пробирки с 2 мл 70% этанола на строительные леса и поместить подмости в трубе с помощью шпателя. Разрешить каркасы, чтобы впитать в этаноле в течение 1 часа. От этого шага вперед, проводить все процедуры в BSC.
    2. Аккуратно влить этанол и заменить фосфатным буферным солевым раствором (PBS) (2 мл на помосте) и центрифуге при 524 х г в течение 3 мин, чтобы удалить пузырьки. Храните его в холодильнике и изменить PBS несколько раз с интервалом 1-2 ч.
      1. Для получения коллагена типа I с покрытием подмости, подготовить другой центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую коллаген типа 1 исходный раствор (1 мл на помосте), перенос простерилизованные подмости в эту трубку с помощью шпателя и центрифуге при 524 х г в течение 3 мин. Встряхнуть строительные леса при 400 оборотах в минуту на орбитальном шейкере в течение 30 мин и держать трубку в холодильнымили на ночь.
      2. Вымойте каркасы с PBS дважды перед использованием погружая строительных лесов в свежем PBS, а затем аспирационных PBS.
        Примечание: Другие белки ECM также могут быть использованы вместо I типа коллагена , потому что химия НСЗ требует аминогруппы с образованием связь (рисунок 2).

figure-protocol-1
Рисунок 1. Обзор изготовления ICC. Каркасы ICC на основе ПЭГ изготовлены с использованием методов микротехнологий и без ECM-функционализации. ECM-покрытием каркасы ICC требуют PEG-NHS, а также PEGDA (как подробно описано на рисунке 2). Решетка PS имеет диаметр 6 мм и высотой 8-13 бусин слоев. PS, полистирол; PEGDA, поли (этиленгликоль) диакрилат; УФ, ультрафиолетовый; ТГФ тетрагидрофуран; ECM, внеклеточный матрикс. Эта цифра была изменена и использована с разрешения WiЛей 47. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

2. Структура Характеристика МТП

  1. Для анализа структуры ICC с или без конъюгированных белков, используют сканирующей электронной микроскопии (SEM) 47.
    1. Закрепить подмости 4% параформальдегида (PFA), последовательно обезвоживают их в 25, 50, 75, 95 и 100% этанола решений, и хранить их при температуре -80 ° С до тех пор, пока не испарится этанол полностью.
    2. Сухие образцы в сублимационной сушилке в течение 48 часов.
    3. Наклейте образец на держатель образца с помощью копировальной ленты и поместите его в распыл для нанесения покрытий.
    4. После автоматической уборки пылесосом, пальто с пленкой Pt толщиной 10 нм с помощью распыления в течение 60 сек при 20 мА.
    5. Подмости изображения ICC помощью сканирующего электронного микроскопа при напряжении 5 кВ (Фигура 3А, 4А).
  2. Для измерения пор идиаметр взаимосвязь полостей, анализировать SEM микрофотографии с помощью программного обеспечения для анализа изображений 48 (например, ImageJ, рисунок 3B, C).
  3. Для того, чтобы визуализировать сопряженную коллаген на эшафот без клеток флуоресцентно тег коллаген с использованием антител (1: 100) против коллагена типа I и изображения с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии 47 (CLSM; Рисунок 4B).

3. Хух-7,5 Культура клеток и Посев

  1. Культура Ха-7,5 клеток при плотности высева 2-2,5 × 10 6 клеток / мл в 100 - мм чашки для культивирования клеток с 10 мл Дульбекко модифицированной Игла среде (DMEM) , дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 100 ед / мл пенициллин-стрептомицина (питательная среда) при температуре 37 ° с и 5% CO 2. Изменение СМИ через каждые три дня в КБС , пока они не достигли 75-80% слитности.
  2. Подготовьте каркасы для посева клеток в BSC.
    1. Осторожно поместите Scaffлетних в 24-луночный планшет с плоской поверхностью лицевой стороной вверх.
    2. Мыть эшафоте, пипеткой 2 мл PBS в каждую лунку, содержащую леску. Аспирируйте PBS и пипетки 2 мл свежего PBS в каждую лунку.
    3. Аспирируйте PBS и пипетки 2 мл питательной среды (см шаг 3.1) и оставить на 30 мин. Аспирата средств массовой информации и позволяют подмости высохнуть в течение 1 часа.
  3. Отделить вырожденные клетки Huh-7,5 (с шагом 3.1) из культуральной пластины в BSC с использованием трипсина метода пищеварения.
    1. Аспирируйте средств массовой информации из пластины, добавьте 4 мл PBS, чтобы вымыть прилипшие клетки, а затем аспирация PBS.
    2. Пипетка 0,75-1 мл 0,25% трипсина и место в инкубаторе при температуре 37 ° С, 5% СО 2 в течение 3 мин.
    3. Удалить пластины из инкубатора и пипеткой 5 мл среды, чтобы остановить реакцию трипсина. Пипетка средства массовой информации, отдельные клетки, и трипсин смеси в 15 мл пробирку.
    4. Центрифуга при 524 х г в течение 3 мин, удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 5 мл среды.
  4. Граф клеток с использованием гемоцитометра и рассчитать объем клеточной суспензии, содержащей клетки в целевом количестве, N 0, в 25 мкл (для стандартного эксперимента, N 0 составляет 1 × 10 6 клеток).
    Объем клеточной суспензии = (целевое число клеток) / (концентрация суспензии клеток)
  5. Медленно пипеткой 25 мкл клеточной суспензии (содержащей N 0 ячеек) непосредственно на верхней части каждой помост (со стадии 3.1.4). Поместите 24-луночный планшет в инкубаторе.
  6. Через 12 ч, передают подмости тщательно с использованием шпателя в новый 24-луночный планшет и пипеткой 2 мл среды в каждую лунку. Поместите 24-луночный планшет в инкубаторе.
  7. Изменение среды каждые 3 дня или в зависимости от того, когда средства массовой информации собирается для анализа секреции белков (см шаг 5.1).

4. Жизнеспособность клеток

  1. Для того, чтобы качественно проанализировать жизнеспособность клеток, использовать флуоресцентные живые / мертвые комплекты окрашивания для окрашивания клеток и изображения с помощью CLSM.
    1. Следуя инструкции комплекта, приготовить раствор с 4 мкМ кальцеина AM и 8 мкМ этидия гомодимер-1 в средствах массовой информации (см шаг 3.1.3).
      Примечание: Оптимизация в зависимости от числа клеток. Используйте двойное количество реагента, если клетки пролиферируют и дважды в количестве (около 2 млн).
    2. В BSC, аспирата средств массовой информации в каждую лунку с леской (шаг 3.7) и пипеткой 500 мкл приготовленного раствора. Инкубируйте образцов в C инкубаторе 37 ° в течение 1 часа.
    3. Покрывал пластины в фольгой для защиты образцов от света при снятии пластины из инкубатора. Образцы изображений с использованием CLSM49.
  2. Для количественной оценки жизнеспособности клеток, измерение ферментативной активности (в живых клетках) с использованием колориметрического анализа 50 (то есть, 2- (2-метокси-4-нитрофенил) -3- (4-нитрофенил) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-тетразолия (мононатриевая-солевой реагент)).
    1. Создайте стандартную кривую для платформы ICC (т.е. график оптической плотности (OD) Versus заданное число клеток).
      Примечание: Cell высева не на 100% эффективнее по сравнению с другими платформами, так как клетки могут проходить через полости строительные леса.
      1. Определить число клеток высева, N 0 , которые будут использоваться , чтобы сделать стандартную кривую.
        Примечание: Выберите диапазон, который включает в себя количество клеток, которые оцениваются в эксперименте. Например, если начальное число клеток 5 × 10 5 клеток и существует , по оценкам , ~ 3 кратное увеличение в последний день эксперимента, выбрать 2,5 х 10 5, 5 х 10 5, 1 × 10 6, и 2 х 10 6 клеток в качестве N 0.
      2. Выполните посев клеток в каркасах ICC (один N 0 на помосте с объемом высева 25 мкл) , как описано в пунктах 3.1-3.6.
      3. Через 6 ч, передают подмости на другой 24-луночный планшет хорошо. Выберите время, которое позволяет присоединение клеток, но не пролиферации клеток.
      4. Выполнить подсчет клеток на переданный эшафот ICC.
        1. Развести 10x мононатриевая-солевой раствор реагента (MSR) до 1 раза со средствами массовой информации в BSC и пипеткой 500 мкл раствора 1x MSR в каждую лунку с леской. Выдержите 24-луночный планшет при 37 ° С в течение 1 часа.
        2. Из каждой лунки, передавать по 100 мкл в 96-луночный планшет хорошо. В качестве заготовки, пипеткой 100 мкл свежего раствора реагента 1x мононатрия-соль в разные лунки на 96-луночный планшет. Вручную удалите пузырьки присутствуют с помощью сухой пипетки и покрывают 96-луночного планшета в фольгу, чтобы защитить его от света.
        3. Мера OD при λ = 450 нм считывание с использованием спектрофотометра. Вычтите пустой OD от других значений , чтобы найти точную OD 51.
      5. Подсчитайте количество клеток (N L) , оставшегося в скважине после переноса на эшафот (этап 4.2.1.3) с помощью гемоцитометра.
        Примечание: Используйте 300 мкл трипсина Trypsinize клеток.
      6. Вычислить фактическое число клеток, N A.
        фактические =Первоначальный - левый в хорошо
        N A = N 0 -N L
      7. Сделать стандартную кривую оптической плотности , полученного на стадии 4.2.1.4.3 против фактического числа клеток (N A) и использовать эту функцию для оценки количества клеток в экспериментах.
        Примечание: Создать новую стандартную кривую , если какие - либо параметры ICC (т.е. размер порообразователь, размеры эшафота, ECM белок и т.д.) меняются.

5. Функция Cell

  1. Анализ секреции белка клетками Ха-7,5 (то есть, альбумин, мочевина) из собранных средств массовой информации (со стадии 3.7) с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) 52.
    Примечание: Развести носитель, в зависимости от количества клеток, посеянных и количества собранных средств массовой информации. Для 5 × 10 5 клеток высевали в МУС, использовать ~ 1: соотношение 25, перед введением ее в антитело , предварительно покрытые лунки.
  2. Для того, чтобы качественно проанализировать функции клеток, immunostain специфические внутриклеточные белки(То есть, альбумин), ферменты (например, CYP450), окрашивают структурные компоненты (то есть сотовая актин), а также ядра и изображения с помощью КЛСМ 49.
    1. Аспирируйте СМИ (со стадии 3.7) и пипеткой 2 мл PBS мыть клетки нагруженных строительных лесов ICC.
    2. Пипетка 1 мл 4% PFA и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре для фиксации.
    3. Промыть 3 раза с 2 мл PBS.
    4. Проницаемыми мембранами путем инкубирования подмости в 1 мл 0,1% 4- (1,1,3,3-тетраметилбутил) фенил-полиэтиленгликоль (поверхностно-активное вещество) в течение 30 мин.
    5. Промыть 3 раза с 2 мл PBS, чтобы удалить протекшие белки.
    6. Пипетка 500 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч, чтобы блокировать неспецифическое связывание.
    7. Подготовить разбавленный первичного антитела (т.е., альбумин, CYP450) раствора.
      1. Пипетка 500 мкл 1% раствора БСА в 15 мл пробирку и добавляют 4,5 мл 0,1% раствора поверхностно-активного подготовить общую 5 мл 0,1% бычьего сывороточного альбумина раствор.
      2. Пипетка 98 мкл 0,1% раствора БСА в микроцентрифужных пробирку 200 мкл и 2 мкл первичного антитела с получением 1:50 (первичное антитело: 0,1% бычьего сывороточного альбумина) раствора первичного антитела.
    8. Пипеток 40 мкл раствора первичного антитела на помост и покрывают субстрат с парафиновой пленки. Обертка 24-луночный планшет с алюминиевой фольгой и хранить посуду при температуре 4 ° С в течение ночи.
    9. Вымойте 3x с 2 мл PBS и встряхните планшет слегка между стиркой.
    10. Подготовить разбавленный биотинилированного вторичного антитела (т.е. антитела против мышиных антител) исходного раствора.
      1. Пипетка 198 мкл 0,1% раствора БСА и 2 мкл второго антитела с получением 1: 100 (вторичное антитело: 0,1% бычьего сывороточного альбумина) вторичного раствора антител.
      2. Приготовьте 0,1% исходного раствора родамина или флуоресцеина меченых фаллоидином (для окрашивания клеточных нитей актина) в 0,1% растворе БСА.
      3. Внесите 25 мкл каждого раствора в трубке и перемешать шELL.
    11. 50 мкл вторичного антитела маточного раствора на строительные леса. Накройте леску с парафиновой пленкой, завернуть блюдо с алюминиевой фольгой и хранить при комнатной температуре в течение 2 часов.
    12. Промыть 3 раза с 2 мл PBS.
    13. Пипетка 200 мкл 0,2% 4'-6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI; ядро ​​морилки) раствор на эшафоте и держать при комнатной температуре в течение 2-3 мин. Закройте планшет с алюминиевой фольгой.
    14. Мытье 2x с 2 мл PBS.
    15. Используя пипетку, поместите каплю монтажных сред на подложке.
    16. Осторожно эшафот на предметное стекло и изображения , используя CLSM 47.
  3. Оценка экспрессии генов в режиме реального времени полимеразной цепной реакции (КПЦР). Используйте стандартные наборы для обратной транскриптазы ПЦР (RT-PCR) 53 и кПЦР 54 в соответствии с инструкциями изготовителя. Извлечение РНК из клеток, как описано ниже.
    1. Поместите на эшафот (со стадии 3.7) в микроцентрифужных пробирку 1,5 мл.
    2. Пипетка 1 мл раствора для экстракции РНК в пробирку и хранить в ультразвуковом в течение 5 мин при комнатной температуре.
    3. Пипетировать 200 мкл хлороформа в каждую пробирку микроцентрифужных и трясти трубку энергично в руке в течение 15-20 сек. Храните пробирки при комнатной температуре в течение ~ 3 мин, пока фазы не отделяют.
    4. Центрифуга образца при 13000 х г, 4 & deg; С в течение 15 мин и осторожно удалите трубки таким образом, что фазы не перемешиваются.
    5. Тщательно пипеткой 500-600 мкл верхней водной фазы от первой трубки во вторую пробирку микроцентрифужных.
    6. Добавьте эквивалентный объем (500-600 мкл) изопропилового спирта к этой второй трубки.
    7. Переверните пробирку 3-5 раз и оставить трубку, стоя при комнатной температуре в течение 10 мин.
    8. Центрифуга образца при 13000 х г, 4 & deg; С в течение 15 мин.
      1. Если осадок не виден в нижней части трубки, центрифуга снова в течение 5 мин.
        Примечание: Если не существует до сих пор не видно осадок, количество РНК может быть недостаточной.
    9. яnvert трубки с крышкой открытой отказаться от супернатанта и пипетку в 1 мл 70% этанола, разведенного в воде DEPC в трубку.
    10. Слегка вихревой трубы, поэтому осадок отсоединяется от стенки трубы, а затем дайте трубке высохнуть на воздухе.
    11. Добавляют 50 мкл DPEC воды в ресуспендируют осадок.
    12. Хранить пипетирования до гранул не растворится.
    13. Хранить в течение 10 мин при 55 ° С для того, чтобы денатурации двухцепочечной РНК в одноцепочечной РНК.
    14. Слегка барабан пальцы на дне трубки, а затем центрифугировать Пробирки кратковременно (7,500 XG, 4 мин, 4 ° С).
    15. Хранить пробирки во льду до выполнения обратной транскриптазы 55 и ПЦР в реальном времени , как описано в 56.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Представительные результаты для структурной характеристики эшафота ICC и сравнения эффективности каждого ICC подмости условие в культивировании печеночных клеток показаны и объяснены ниже. Условия подмости МТП, используемые в этих результатов являются коллагеновые покрытия из 0 мкг / мл (Bare), 20 мкг / мл (Коллагеновые 20), 200 мкг / мл (Коллагеновые 200) и 400 мкг / мл (Коллагеновые 400) и первоначальной Ха-7,5 клеток посевом номер 1x10 6.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Тканевая инженерия каркасы быстро развиваются , чтобы обеспечить все физические и биохимические сигналы , необходимые для восстановления, поддержания или ремонта тканей для применения замены органов, изучение болезней, разработки лекарств, и многие другие 57. В печени тканевой инженерии, первичные гепатоциты человека быстро теряют свои метаболические функции, как только выделенные из организма, создавая большую потребность в инженерных строительных лесов и создания платформ для поддержания функции печени. В н...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов, которые можно было бы раскрыть.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить признательность поддержку от Национального исследовательского фонда стипендий (NRF -NRFF2011-01) и конкурентоспособных исследований программы (СРН-CRP10-2012-07).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 мл ПЦР-пробиркаAxygen ScientificPCR-02D-CУстойчивый к кипячению
клей GorillaGlue Gorilla Glue, Inc.Зависит от поставщика. Он был куплен в местном магазине.
Стеклянные горкиVWR631-1575Размеры: в 24 раза; 60 мм2
Сферы из полистиролаFisher ScientificTSS#4314AДиаметр = 140 &; m; 3x104 частиц на миллилитр и 1,4% распределения по размерам
ЭтанолMerck1.00983.1011абсолютный для анализа EMSURE; Разбавить до 70% водой Milli-Q
Ультразвуковая ваннаElmaS10HОборудованная
печьNaberthermN7/HEquipment
200 &микро; l наконечник для пипеткиAxygen ScientificT-210-Y-R-S
Качалочный шейкерVWR444-0142
Полиэтиленгликоль (ПЭГ)Merck1.09727.0100Mw= 4 кДа; акрилирование мономеров PEG и очистка образующегося осадка дает макромер PEGDA с Mw = 4,6  kDa
ЦентрифугаBeckman Coulter392932оборудование
Акрилат-поли(этиленгликоль) - сукцинимидилвалератLaysan BioACRL-PEG-SVA-3400-1gmw = 3,4 кДа
2-гидрокси-4'-(2-гидроксиэтокси)-2-метилпропиофенонSigma Aldrich410896
VortexVWR58816-123Оборудование
МикроцентрифугаEppendorf5404 000.413
Парафиновая пленка ПарапленкаM #PM996Выдерживается при 9" с допустимой интенсивностью 10,84  мВт/см<суп>2
Bluewave 200 УФ-прожекторBlaze Technology 120008, 122300
Тетрагидрофуран (ТГФ)Merck
Heidolph543-123120-00-5
Коллаген типа ISigma AldrichC3867-1VLОт крысы 1x, без CaCl2 & MgCl2; pH = 7,2
фосфатно-солевой буфер (PBS)Gibco20012-02716% W/V AQ. 10 x 10  мл
ПараформальдегидVWR43368.9MОборудование
Freezone 4.5 Сублимационная сушилкаLabconco7750020Оборудование
Sputter coaterJeol Ltd.JFC-1600Оборудование
Сканирующий электронный микроскопJeol Ltd.JSM 5310
Первичные антитела против мышиного типа против коллагена IAbcamab6308
Вторичное антитело против мыши, конъюгированное с Alexa Fluor 488Life TechnologiesA21121
Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon) Bio-Rev PTE LTD3820-024
Модифицированная орлиная среда Dulbecco's (DMEM)
2,5 г/л глюкозы с L-Gln		Lonza12-604F
Фетальная бычья сыворотка (FBS)GibcoA15-151
Пенициллин-стрептомицин (P/S)Life Tchnologies15140-122 E
100 мм Corning необработанные питательные чашкиSigma AldrichCLS430591
0,25% Трипсин-ЭДТАGibco25200-056Оборудование; 37  ° C, 5% влажности
Forma Steri-cycle CO2 ИнкубаторыThermofisher Scientific371
Hausser Bright-line Phase HemacytometerThermofisher Scientific02-671-6
Набор для жизнеспособности/цитотоксичности живых/мертвых клеток млекопитающихLife TechnologiesL3224 
CCK-8 AssayDojindo LaboratoriesCK04-11Мононатрий-солевой реагент (MSR)
Считыватель микропланшетов Infinite 200 PRO Набор
Albumin для человекаAbcamab108788
Triton X-100Bio-Rad#1610407
Альбумин бычьей сыворотки (BSA)Sigma-AldrichA2153-50G
Антимышиные первичные антитела (против CYP3A4, альбумин)Santa Cruz Biotechnologysc-53850; sc-271605
DAPILife TechnologiesD3571
Alexa Fluor 555 меченый фаллоидинLife TechnologiesA34055
ТризолЛайф Технолоджис15596-026
ХлороформVWR22706.326
ИзопропанолFisher Scientific67-63-0
DPEC водаThermofisher ScientificAM9916
Nanodrop 2000c СпектрофотометрThermofisher ScientificND-2000
iScript Обратная транскрипция Supermix Bio-Rad Laboratories1708840
SYBR выбрать мастер-смесь для CFXLife Technology4472937
Праймеры (будут выбраны)
CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal CyclerBio Rad LaboratoriesSOFT-CFX-31-PATCH 
Орбитальный шейкер 107025 для ИФА Tecan

Ссылки

  1. Yamada, M., et al. Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions. Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).
  2. Abboud, G., Kaplowitz, N. Drug-induced liver injury. Drug Safety. 30 (4), 277-294 (2007).
  3. Cho, N. J., et al. Viral infection of human progenitor and liver-derived cells encapsulated in three-dimensional PEG-based hydrogel. Biomed Mater. 4 (1), (2009).
  4. Revzin, A., et al. Designing a hepatocellular microenvironment with protein microarraying and poly (ethylene glycol) photolithography. Langmuir. 20 (8), 2999-3005 (2004).
  5. Sato, A., Kadokura, K., Uchida, H., Tsukada, K. An in vitro hepatic zonation model with a continuous oxygen gradient in a microdevice. Biochem Bioph Res Com. 453 (4), 767-771 (2014).
  6. Domansky, K., et al. Perfused multiwell plate for 3D liver tissue engineering. Lab Chip. 10 (1), 51-58 (2010).
  7. Hegde, M., et al. Dynamic interplay of flow and collagen stabilizes primary hepatocytes culture in a microfluidic platform. Lab Chip. 14 (12), 2033-2039 (2014).
  8. Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat methods. 2 (2), 119-125 (2005).
  9. Underhill, G. H., Chen, A. A., Albrecht, D. R., Bhatia, S. N. Assessment of hepatocellular function within PEG hydrogels. Biomaterials. 28 (2), 256-270 (2007).
  10. Dunn, J., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Hepatocytes in collagen sandwich: evidence for transcriptional and translational regulation. J cell biol. 116 (4), 1043-1053 (1992).
  11. Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration. Biotechnol progr. 7 (3), 237-245 (1991).
  12. Ling, Y., et al. A cell-laden microfluidic hydrogel. Lab Chip. 7 (6), 756-762 (2007).
  13. Kim, M., Lee, J. Y., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31 (13), 3596-3603 (2010).
  14. Kotov, N. A., et al. Inverted Colloidal Crystals as Three-Dimensional Cell Scaffolds. Langmuir. 20 (19), 7887-7892 (2004).
  15. Shanbhag, S., Woo Lee, J., Kotov, N. Diffusion in three-dimensionally ordered scaffolds with inverted colloidal crystal geometry. Biomaterials. 26 (27), 5581-5585 (2005).
  16. Lee, Y. H., Huang, J. R., Wang, Y. K., Lin, K. H. Three-dimensional fibroblast morphology on compliant substrates of controlled negative curvature. Integr Biol. 5, 1447-1455 (2013).
  17. da Silva, J., Lautenschlager, F., Kuo, C. H. R., Guck, J., Sivaniah, E. 3D inverted colloidal crystals in realistic cell migration assays for drug screening applications. Integr Biol. 3, 1202-1206 (2011).
  18. da Silva, J., Lautenschlager, F., Sivaniah, E., Guck, J. R. The cavity-to-cavity migration of leukaemic cells through 3D honey-combed hydrogels with adjustable internal dimension and stiffness. Biomaterials. 31, 2201-2208 (2010).
  19. Lee, J., Lilly, G. D., Doty, R. C., Podsiadlo, P., Kotov, N. A. In vitro toxicity testing of nanoparticles in 3D cell culture. Small. 5, 1213-1221 (2009).
  20. Lee, J., Kotov, N. A. Notch ligand presenting acellular 3D microenvironments for ex vivo human hematopoietic stem-cell culture made by layer-by-layer assembly. Small. 5, 1008-1013 (2009).
  21. Liu, Y., et al. Rapid aqueous photo-polymerization route to polymer and polymer-composite hydrogel 3D inverted colloidal crystal scaffolds. J Biomed Mater Res. Part A. 83, 1-9 (2007).
  22. Ma, P. X., Choi, J. W. Biodegradable polymer scaffolds with well-defined interconnected spherical pore network. Tissue Eng. 7, 23-33 (2001).
  23. Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Poly (lactic-co-glycolic acid) bone scaffolds with inverted colloidal crystal geometry. Tissue Eng Part A. 14, 1639-1649 (2008).
  24. Choi, S. W., Zhang, Y., Xia, Y. Three-dimensional scaffolds for tissue engineering: the importance of uniformity in pore size and structure. Langmuir. 26, 19001-19006 (2010).
  25. Choi, S. W., Zhang, Y., Thomopoulos, S., Xia, Y. In vitro mineralization by preosteoblasts in poly(DL-lactide-co-glycolide) inverse opal scaffolds reinforced with hydroxyapatite nanoparticles. Langmuir. 26, 12126-12131 (2010).
  26. Choi, S. W., Zhang, Y., Macewan, M. R., Xia, Y. Neovascularization in biodegradable inverse opal scaffolds with uniform and precisely controlled pore sizes. Adv Healthc Mater. 2, 145-154 (2013).
  27. Zhang, Y., Choi, S. W., Xia, Y. Modifying the Pores of an Inverse Opal Scaffold With Chitosan Microstructures for Truly Three-Dimensional Cell Culture. Macromol Rapid Commun. 33, 296-301 (2012).
  28. Cai, X., et al. Investigation of neovascularization in three-dimensional porous scaffolds in vivo by a combination of multiscale photoacoustic microscopy and optical coherence tomography. Tissue Eng. Part C, Meth. 19, 196-204 (2013).
  29. Zhang, Y. S., Yao, J., Wang, L. V., Xia, Y. Fabrication of Cell Patches Using Biodegradable Scaffolds with a Hexagonal Array of Interconnected Pores (SHAIPs). Polymer. 55, 445-452 (2014).
  30. Zhang, Y. S., Regan, K. P., Xia, Y. Controlling the Pore Sizes and Related Properties of Inverse Opal Scaffolds for Tissue Engineering Applications. Macromol Rapid Commun. 34, 485-491 (2013).
  31. Stachowiak, A. N., Bershteyn, A., Tzatzalos, E., Irvine, D. J. Bioactive Hydrogels with an Ordered Cellular Structure Combine Interconnected Macroporosity and Robust Mechanical Properties. Adv Mater. 17, 399-403 (2005).
  32. Stachowiak, A. N., Irvine, D. J. Inverse opal hydrogel-collagen composite scaffolds as a supportive microenvironment for immune cell migration. J Biomed Mater Res. Part A. 85, 815-828 (2008).
  33. Liu, Y., Wang, S. 3D inverted opal hydrogel scaffolds with oxygen sensing capability. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 58, 8-13 (2007).
  34. Bryant, S. J., Cuy, J. L., Hauch, K. D., Ratner, B. D. Photo-patterning of porous hydrogels for tissue engineering. Biomaterials. 28, 2978-2986 (2007).
  35. Bhrany, A. D., Irvin, C. A., Fujitani, K., Liu, Z., Ratner, B. D. Evaluation of a sphere-templated polymeric scaffold as a subcutaneous implant. JAMA facial plastic surgery. 15, 29-33 (2013).
  36. Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Inverted colloidal crystal scaffolds with laminin-derived peptides for neuronal differentiation of bone marrow stromal cells. Biomaterials. 32 (3), 819-831 (2011).
  37. Yang, J. T., Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Peptide-modified inverted colloidal crystal scaffolds with bone marrow stromal cells in the treatment for spinal cord injury. Colloids Surf. B, Biointerfaces. 84, 198-205 (2011).
  38. Kuo, Y. C., Tsai, Y. T. Inverted colloidal crystal scaffolds for uniform cartilage regeneration. Biomacromolecules. 11, 731-739 (2010).
  39. Choi, S. W., Xie, J., Xia, Y. Chitosan-Based Inverse Opals: Three-Dimensional Scaffolds with Uniform Pore Structures for Cell Culture. Adv Mater. 21, 2997-3001 (2009).
  40. Long, T. J., Sprenger, C. C., Plymate, S. R., Ratner, B. D. Prostate cancer xenografts engineered from 3D precision-porous poly(2-hydroxyethyl methacrylate) hydrogels as models for tumorigenesis and dormancy escape. Biomaterials. 35, 8164-8174 (2014).
  41. Kuo, Y. C., Tsai, Y. T. Inverted colloidal crystal scaffolds for uniform cartilage regeneration. Biomacromolecules. 11, 731-739 (2010).
  42. Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Inverted colloidal crystal scaffolds with laminin-derived peptides for neuronal differentiation of bone marrow stromal cells. Biomaterials. 32, 819-831 (2011).
  43. Lee, J., Cuddihy, M. J., Cater, G. M., Kotov, N. A. Engineering liver tissue spheroids with inverted colloidal crystal scaffolds. Biomaterials. 30 (27), 4687-4694 (2009).
  44. Galperin, A., et al. Integrated bi-layered scaffold for osteochondral tissue engineering. Adv Healthc Mater. 2, 872-883 (2013).
  45. Waters, D. J., et al. Morphology of Photopolymerized End-linked Poly(ethylene glycol) Hydrogels by Small Angle X-ray Scattering. Macromolecules. 43 (16), 6861-6870 (2010).
  46. Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Conjugate addition reactions combined with free-radical cross-linking for the design of materials for tissue engineering. Biomacromolecules. 2 (2), 430-441 (2001).
  47. Kim, M. H., et al. Biofunctionalized Hydrogel Microscaffolds Promote Three-Dimensional Hepatic Sheet Morphology. Macromol Biosci. , (2015).
  48. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. , http://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html#toc-Subsection-30.1 (2012).
  49. JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Introduction to Fluorescence Microscopy. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
  50. Tominaga, H., et al. A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay. Anal Commun. 36 (2), 47-50 (1999).
  51. JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Introduction to the Microplate Reader. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
  52. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
  53. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1, 1559-1582 (2006).
  54. JoVE Science Education Database. Essentials of Environmental Microbiology. RNA Analysis of Environmental Samples Using RT-PCR. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
  55. JoVE Science Education. Essentials of Environmental Microbiology. , JoVE. (2015).
  56. Jeong, S., et al. The evolution of gene regulation underlies a morphological difference between two Drosophila sister species. Cell. 132 (5), 783-793 (2008).
  57. Griffith, L. G., Naughton, G. Tissue engineering--current challenges and expanding opportunities. Science. 295 (5557), 1009-1014 (2002).
  58. Hegde, M., et al. Dynamic Interplay of Flow and Collagen Stabilizes Primary Hepatocytes Culture in a Microfluidic Platform. Lab Chip. 14, 2033-2039 (2014).
  59. Kim, Y., Lasher, C. D., Milford, L. M., Murali, T., Rajagopalan, P. A comparative study of genome-wide transcriptional profiles of primary hepatocytes in collagen sandwich and monolayer cultures. Tissue Eng Pt C. 16 (6), 1449-1460 (2010).
  60. Baimakhanov, Z., et al. Efficacy of multi-layered hepatocyte sheet transplantation for radiation-induced liver damage and partial hepatectomy in a rat model. Cell Transplant. , (2015).
  61. Li, C. Y., et al. Micropatterned Cell-Cell Interactions Enable Functional Encapsulation of Primary Hepatocytes in Hydrogel Microtissues. Tissue Eng Pt A. 20 (15-16), 2200-2212 (2014).
  62. Shlomai, A., et al. Modeling host interactions with hepatitis B virus using primary and induced pluripotent stem cell-derived hepatocellular systems. P Natl A Sci USA. 111 (33), 12193-12198 (2014).
  63. Curcio, E., et al. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).
  64. Martinez-Hernandez, A., Amenta, P. The hepatic extracellular matrix. Vichows Archiv A Pathol Anat. 423, 1-11 (1993).
  65. Liu, Y., Wang, S., Lee, J. W., Kotov, N. A. A Floating Self-Assembly Route to Colloidal Crystal Templates for 3D Cell Scaffolds. Chem Mater. 17 (20), 4918-4924 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Huh 7 5

Похожие статьи