Флуоресцентные Ортотопическая Мышь Модель панкреатического рака

Краткое содержание

Здесь представлена процедура ортотопической имплантации зеленых флуоресцентных клеток рака поджелудочной железы (PANC-1 GFP) в поджелудочную железу мышей Balb-c Ola Hsd-Fox1nu для оценки прогрессирования опухоли и метастазирования.

Аннотация

Рак поджелудочной железы остается одним из видов рака, для которых выживание не значительно улучшилось за последние несколько десятилетий. Только 7% диагностированных пациентов проживут дольше, чем через пять лет. Для того, чтобы понять и имитируют микроокружение опухоли поджелудочной железы, мы использовали мышиную модель ортотопической рака поджелудочной железы, который позволяет неинвазивной визуализации прогрессии опухоли в режиме реального времени. Рак поджелудочной железы клетки , экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок (PANC-1 GFP) суспендировали в матрице базальной мембраны, высокой концентрации (например, Матригель HC) с бессывороточной средой и затем вводили в хвост поджелудочной железы через лапаротомию. Суспензию клеток в матрице высокой концентрации базальной мембраны становится гелеобразной вещество, как только он достигнет комнатной температуры; Поэтому, гели, когда он вступает в контакт с поджелудочную железу, создавая уплотнение в месте инъекции и предотвратить утечку клеток. Рост опухоли и метастазирование в другие органы контролируются в прямом эфиреживотных с помощью флуоресценции. Очень важно использовать соответствующие фильтры для возбуждения и испускания GFP. Шаги для ортотопической имплантации подробно описаны в этой статье, так что исследователи могут легко повторить процедуру у голых мышей. Основные этапы этого протокола подготовка клеточной суспензии, хирургической имплантации, а также в целом флуоресцентный тела в естественных изображений. Эта ортотопическая модель предназначена для изучения эффективности новых терапевтических средств на первичных и метастатических опухолей.

Введение

Рак поджелудочной железы диагностируется с повышенной частотой по сравнению с другими видами рака и является 4 - ^й ведущей причиной смертности от онкологических заболеваний в Соединенных Штатах. С момента постановки диагноза, более 90% пациентов умирают в течение пяти лет ^1,2. В настоящее время хирургическое удаление опухоли является единственным лекарством от рака поджелудочной железы, но менее чем у 20% пациентов имеют право пройти операцию , главным образом потому , что в момент постановки диагноза болезнь находится на продвинутой стадии и метастазами ^3,4. Отсутствие конкретных симптомов делает рак поджелудочной железы молчком заболевание; некоторые симптомы включают боль в животе, боли в спине, потеря аппетита, желтуха и тошнота; которые могут быть легко интерпретированы как обычные заболеваний пищеварительного тракта ^4. По этой причине важно разработать новые инструменты фармакологические, чтобы помочь в диагностике и лечении рака поджелудочной железы.

Использование животных моделей позволяет нам понять биологию pancreATIC рака и дает представление о применении этих знаний для человека. Ксенотрансплантатных Ортотопическая модели рака поджелудочной железы являются реалистичными, поскольку опухоли растут в органе происхождения ^5. В отличие от моделей гетеротопных, где клеточные линии или фрагменты опухоли имплантируют подкожно, ортотопическая моделирование позволяет воссоздание микросреды опухоли и мимике взаимодействие опухолевых клеток с окружающей средой ^6. Модель ксенотрансплантата описанная здесь происходит от опухоли поджелудочной железы человека линии клеток рака PANC-1 GFP, который с помощью генной инженерии, чтобы выразить зеленый флуоресцентный белок (GFP). Обнаружение GFP позволяет для неинвазивной визуализации и мониторинга роста опухоли и метастаз ^7. Развитие опухоли происходит быстро, спонтанно, и близко напоминает первичных опухолей больных раком поджелудочной железы человека ^8. Ортотопической модели обеспечивают более точное предсказание эффективности лекарственного средства в ответ на терапевтических агентов, в то время какимитируя микросреды опухоли.

Как уже упоминалось выше, эта модель животного позволяет флуоресцентной детекции роста опухоли и метастаз в реальном масштабе времени. Флуоресцентные обнаружение позволяет более прямой / живого изображения по сравнению с люминесценцией. С помощью флуоресценции излучаемый свет является результатом возбуждения другим светом более короткой длиной волны; в то время как в люминесценции, излучаемый свет является результатом химической реакции и не может иметь сильное излучение ^9. Кроме того, все тело в естественных условиях флуоресцентной визуализации не наносит ущерба животному и позволяет исследователям контролировать рост опухоли с течением времени в ответ на терапевтические процедуры.

Протокол

Протокол, описанный ниже, выполняется под руководством и утверждения животных по уходу и использованию комитета Западного университета. Все эксперименты выполняются в соответствии со всеми соответствующих руководящих принципов, правил и регулирующих органов.

1. Культура клеток

1. Приготовление полной среды
   1. Использование биологической безопасности II класса, подготовить полную среду путем добавления асептических фетальной бычьей сыворотки (FBS) и пенициллин стрептомицин (P / S) в 500 мл бутылка RPMI среды. Осторожно перемешать с помощью закрученного. Конечная концентрация каждого дополнения составляет 10% FBS и 1% P / S (об / об). Например, дополнить 500 мл среды с 56 мл FBS и 6 мл P / S.
   2. Поместите полную среду на водяной бане при 37 ° С.
2. Размораживание и распространяющихся клетки
   1. Получение PANC-1 GFP клеток из жидкого азота. Разморозьте флакон при осторожном перемешивании в водяной бане при 37 ° С.
      Заметка:Размораживание должно быть быстрым (примерно 2 - 3 мин).
   2. Этикетка Т-75 колб для использования с (а) название клеточной линии, дата (б) номер прохода, (с) и инициалов (D) исследователя.
   3. Протрите флакон с 70% этанола и переноса флакона в шкафу биологической безопасности.
   4. Размножать клетки, добавляют 9,0 мл полной среды в 15 мл коническую трубку. С помощью 1,0 мл пипетки, тщательно передачи клеточной суспензии и подвесить его в 9 мл полной среды.
   5. Центрифуга при 125 мкг в течение 8 минут при комнатной температуре. Передача коническую флакон в шкафу биологической безопасности и аспирата супернатант, не нарушая гранул.
   6. Приостановить осадок в 10 мл свежей полной среды, осторожно пипеткой суспензию вверх и вниз.
   7. Граф клеток с гемоцитометра и пластины их в Т-75 колб при плотности 2,1 × 10 ⁶ клеток / колбу. Поместите колбу в термостате при температуре 37 ° С и 5% СО _2.
   8. Монитор клетки ежедневно на глаз и под микроскопом. Если гриппID требуется обновление, асептически аспирация полную ростовую среду из колбы и выбросить. Добавить равный объем свежей полной среды.
3. Размножение клеток
   1. Консерванта удалить среду из колбы. Добавляют 5 мл фосфатного буферного солевого раствора Дульбекко (DPBS) ополаскивать клетки и выбросить.
   2. Открепления клеток из колбы путем добавления 3 мл 0,25% трипсина. Выдержите в колбу , содержащую трипсин при 37 ° С и 5% СО ₂ в течение от 5 до 10 мин.
   3. Заметим клетки под микроскопом (10-кратным увеличением) и убедитесь, что они имеют круглую форму и смещаются.
   4. Нейтрализовать трипсина путем добавления равного объема полной среды и разбить комки, осторожно пипеткой вверх и вниз.
   5. Граф клеток с помощью гемоцитометра и передать соответствующий объем клеточной суспензии, к новым флаконах при плотности клеток, указанной в 1.2.7; добавить достаточно свежую среду, так что конечный объем 10 мл на колбу.
4. Клеточные SuspensПодготовка ионов для инъекций
   Примечание: Поскольку мембрана матрица подвал, высокая концентрация, затвердевает при комнатной температуре, хранить все материалы на льду. Поместите все стерильные наконечники пипеток и флаконов в морозильной камере в течение ночи, и держать на льду во время работы над подвеской.
   1. Держите бутылку RPMI СМИ без каких-либо добавок на льду. Оттепель матрицу базальной мембраны, высокую концентрацию, следуя инструкциям производителя. Предпочтительно, чтобы аликвоты на более мелкие пузырьки , чтобы избежать многократных циклов ¹⁰ замораживания-оттаивания.
   2. Аспирируйте средств массовой информации из всех колб и промыть 5 мл ДЗФР. Повторите все шаги на предыдущем разделе до шага 1.3.4.
   3. Перенесите содержимое в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируют при 125 х г в течение 8 мин при комнатной температуре. Передача коническую флакон с биозащитой и повторно приостанавливать осадок в 10 мл ДЗФР.
   4. Аккуратно пипеткой подвеску вверх и вниз, чтобы разбить осадок. Граф клеток с использованием гемоцитометра.
   5. снова центрифуге, как указано в секундахТЭП 1.4.3. Отберите супернатант и в зависимости от количества клеток, добавить соответствующий разбавитель с получением 3 х 10 ⁶ клеток в объеме 50 мкл. Разбавитель будет представлять собой смесь бессывороточной среды и высокой концентрацией подвальный матрицы мембраны в 1: (об / об) соотношении 1.
   6. Vortex суспензию осторожно и держать на льду во все времена. Подвеска теперь готов к инъекции.
5. Хирургическая имплантация
   Примечание: Убедитесь, что все хирургические материалы и инструменты стерильны. Практика асептики во все времена.
   1. Поместите грелку на стол и накрыть стерильной драпировки. Установите наркозный аппарат и убедитесь, что все поставки находятся в пределах досягаемости руки.
   2. Поместите морду животного в маску анестезии и установить наркоз до 1 л / мин кислорода и 2,5% изофлуран.
   3. Аккуратно скраб фланг животного с йодом, и промыть 70% -ным этанолом. Повторите три раза.
   4. Подтвердитьживотное полностью под наркозом, зажимая заднюю лапу. Животное полностью под наркозом и готов к операции, если не наблюдается никакого ответа. Тем не менее, если животное вздрагивает, обеспечения достаточно эффективной анестезии в испарителем и позволить животному больше времени, чтобы пройти полностью под наркозом.
   5. Нагрузка приблизительно по 200 мкл суспензии клеток в 1,0 мл ТБ шприц с иглой 18 G (предварительно охлажденного). Заменить иглу с 27 G иглой и возвращают на лед, пока готов к использованию.
   6. Найдите общую область селезенки (левый верхний квадрант живота) и с помощью щипцов ущипнуть кожу на верхней части этого региона. Используя хирургические ножницы, делают надрез приблизительно 1,0 см, чтобы создать карман. Точно так же, зажать гладкие мышцы в верхней части селезенки и прорезать для того, чтобы получить доступ в брюшную полость.
   7. Осторожно возьмите Хвостовой конец селезенки и вытащить его из тела. Поджелудочная железа будет прикреплен к селезенке. Распространение поджелудочной железы с помощью влажной улerile Q-Tip и найти хвост поджелудочной железы.
   8. Доставьте инъекцию 50 мкл в хвост поджелудочной железы, оставьте иглу в течение 10 секунд и медленно вращать иглу из поджелудочной железы. Успешная имплантация будет выглядеть как поверхностный пузырь без каких-либо утечек.
   9. Возвращение поджелудочной железы и селезенки в брюшную полость. Сначала необходимо заключить мышцу, а затем приложите кожу отдельно. Используйте 6-0 шовного или скрепку, чтобы закрыть разрез. Для того, чтобы избежать боли в животном, администрировать кетопрофен подкожно (SC) (5 мг / кг) в течение 24 часов. В качестве альтернативы, управлять бупренорфин SC (0,05 - 0,1 мг / кг) через каждые 12 ч в течение периода 36 ч.
   10. Восстановить животное от наркоза и вернуть его в клетку. Также монитор для боли. Животные должны быть обеспечены облегчения боли во время (или даже до - упреждающий) хирургии. Дополнительное облегчение боли должна быть предоставлена ​​животных, которые испытывают боль в соответствии с IACCUC-протоколу или, как это предписано встремящейся к ветеринару или исполняющему.
6. В естественных изображений
   Примечание: Захват изображения был выполнен с использованием коммерческой системы формирования изображения, оснащенного темной камерой и соответствующими фильтрами для визуализации GFP. Получение изображений осуществляли с использованием ПЗС-камеры и оптическую систему, состоящую из сменных объективов возбуждения / испускания (возбуждение: 455 - 495 нм; Излучение: 513 - 557 нм). Яркие образы полей были захвачены без фильтра на 1 х 1 биннинга для каждой временной точки. Возбуждение GFP используется ксеноновая мультиспектральных источник света. Животных содержали под наркозом в течение всего процесса формирования изображения, подключив машина анестезии к газовой анестезии коллектор интегрирован в темную камеру системы формирования изображения.
   1. Обезболить животное, как указано в 1.5.2. Маска анестезия в интерьере темной камере коммерческого системы формирования изображения для того, чтобы держать животное под наркозом во время визуализацииобработать.
   2. Настройка правильного возбуждения и эмиссии фильтров.
   3. Начните с получения исходного изображения, используя только белый свет. Держите ту же позицию животного в течение всей сессии визуализации и переключиться на GFP фильтров, чтобы занять второе изображение.
   4. Для достижения наилучших результатов накладываться оба изображения. Анализ изображения для флуоресцентной области и интенсивности.

Результаты

Этот метод описан хирургический ортотопической имплантации флуоресцентных человека клеток рака поджелудочной железы, сосредоточив внимание на подготовке клеточной суспензии для инъекций, надлежащей анестезии для грызунов, поставка клеточной суспензии через лапаротомии, а также использование флуоресцентного в естественных условиях небольшого изображения животных. Обнаружение зеленого сигнала флуоресценции (GFP сигнала) между двумя и три недели после имплантации, обеспечивает иссл...

Обсуждение

Мы описываем ортотопической мышиной модели рака поджелудочной железы , который выражает GFP, таким образом , позволяя неинвазивный мониторинг роста опухоли с использованием всего тела в естественных условиях флуоресцентной визуализации (Рисунок 1). Этот метод позволяет контролировать развитие опухоли в режиме реального времени (рисунок 3); это может быть важным инструментом для исследователей для изучения терапевтической эффективности новых препаратов против рака поджелудочной ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
RPMI media 1640	Caisson Labs	RPL03-500ML
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота	Gibco	10437-077
Пенициллин стрептомицин	Thermo Ficher Sci	15140-122
Matrigel HC базальная мембрана, высокая концентрация	Corning	354248
SutureVet PGA 6-0 PGA	Henry Schein	39010
Alcare или вспененный антисептик для рук	Steris	639680
DPBS (Фосфатно-солевой буфер Dubelcco)	Шприц Thermo Ficher Sci	21300025
TB 27 г 1/2	Becton Dickinson	305620
Isoflurane	Blutler Schein	50562
Кетопрофен	Fort Dodge Animal Health
Хирургические ножницы, 5,5 дюйма прямой майонез;	Henry Schein	22-1600
PANC-1 GFP клеточная линия	Anticancer, Inc
Система визуализации мелких животных: iBox Scientia	UVP, LLC. Апленд, Калифорния.		Система визуализации мелких животных для наблюдения за флуоресцентной опухолью у живых животных