Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Совместное культивирование жизни микробиомом с Microengineered человека ворсинок кишечника в Gut-на-чипе микрожидкостных устройств

22.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54344

⸱

30 августа 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, The University of Texas at Austin, 2Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering at Harvard University, 3Vascular Biology Program, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 4John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University

В этой статье

Краткое содержание

Описывается протокол в пробирке для совместного культивирования кишечной микробиомом и ворсинок кишечника в течение длительного периода , используя человеческую microphysiological систему кишка-на-чипе.

Аннотация

Здесь мы опишем протокол для выполнения долгосрочного сотрудничества культуры нескольких видов человеческого кишечника микробиомом с microengineered кишечных ворсинок в кишечнике человека-на-чипе microphysiological устройства. Резюмируем просвете кишечника-капиллярные интерфейс ткани в микрожидком устройстве, где физиологические механические деформации и сдвигового течения жидкости постоянно применяются для имитации перистальтику. В просвете микроканалов, кишечные эпителиальные клетки Сасо-2 человека культивируют с образованием "стерилен" ворсинок эпителия и регенерации тонкого кишечника ворсинки. Предварительно культивированный микробные клетки инокулируют в сторону светового потока, чтобы установить хост-микробных экосистему. После того, как микробные клетки прилипают к апикальной поверхности ворсинок, поток текучей среды, и механические деформации возобновили производить стационарную микросреду, в котором свежая культуральная среда постоянно подается и несвязанные бактерии (а также бактериальные отходы), непрерывно удаляются. После длительного совместного культивирования FROM дней до нескольких недель, несколько микроколонии оказываются случайным образом расположены между ворсинками, и как микробный и эпителиальные клетки остаются жизнеспособными и функциональной в течение по крайней мере, одну неделю в культуре. Наш протокол совместного культивирования может быть адаптирована для обеспечения универсальную платформу для других хост-микробиомом экосистем , которые могут быть найдены в различных человеческих органов, которые могут способствовать в пробирке изучения роли человеческого микробиомом в оркестровки здоровья и болезни.

Введение

Кишечник человека таит в себе потрясающе разнообразный спектр видов микроорганизмов (<1000 видов) и огромное количество микробных клеток ( в 10 раз больше , чем клеток - хозяев человека) и гены ( в 100 раз больше , чем в геноме человека) 1. Эти человеческие microbiomes играют ключевую роль в метаболизировать питательных веществ и ксенобиотиков, регуляции иммунных реакций и поддержание гомеостаза кишечника 2. Не удивительно, учитывая эти разнообразные функции, комменсальной кишечника микробиомом широко модулирует здоровье и болезни 3. Таким образом, понимание роли кишечника микробиомом и хост-микробных взаимодействий имеют большое значение для содействия желудочно - кишечного тракта (GI) здоровья и исследовать новые терапевтические средства для лечения кишечных расстройств 4. Тем не менее, существующие в пробирке моделях кишечника (например, статические культуры) ограничивают хост-микробиомом сокультуре на короткий период времени (<1 день) , так как микробные клетки разрастаются и скомпрометировать кишечного барьераФункция 5. Суррогатные модели на животных (например, стерилен 6 или генной инженерии мышей 7) также обычно не используется для изучения хост-кишечную микробиомом перекрестных помех , так как колонизация и стабильное поддержание кишечной микробиомом человека трудно.

Для преодоления этих проблем, недавно мы разработали Biomimetic человека "Gut-на-чипе" microphysiological системы (рис 1А, слева) , чтобы эмулировать микробиомом взаимодействия хост-кишечную , которые происходят в живом человеческом кишечнике 5,8. Микроприбор кишка-на-чипе содержит два параллельных микроканалов , разделенных гибкой пористой, внеклеточного матрикса (ЕСМ) -покрытие мембраны выстлана эпителия кишечника человеческого Сасо-2 клеток, имитируя просвете кишечника-капиллярные интерфейс ткани (рис 1A , справа) 9. Вакуумные управляемые циклические ритмические деформации вызывают физиологические механические деформации, которые имитируют изменения обычно inducред перистальтики (рис 1А, справа). Интересно, что когда клетки Сасо-2 выращивают в микросхеме кишка-на-для более чем 100 часов, они самопроизвольно образуют трехмерную (3D) ворсинок кишечника с плотными соединениями, верхушечных границ кисти, пролиферирующих ограничивается базальных крипт, производство слизи, повышение активности метаболизировать наркотиков (например, цитохром Р450 3А4, CYP3A4), и повышение уровня глюкозы обратного захвата 8. В этом "стерильном" микросреды, это было возможно совместное культивирование пробиотик лактобактерии рамнозус GG или терапевтическое образование пробиотической бактериальной смеси с хозяина эпителиальных клеток в течение двух недель 5,10.

В данном исследовании мы описываем подробный протокол для выполнения хост-кишечную микробиомом совместного культивирования в устройстве кишка-на-чипе в течение длительного периода. Кроме того, мы обсудим важнейшие вопросы и потенциальные проблемы, которые будут рассматриваться для широкого применения этого хозяина-микробиомом сокультуры рrotocol.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. микротехнологий из устройства Gut-на-чипе

Примечание: а-чип кишки на это Микрожидкостных устройство, сделанное прозрачной, газопроницаемая силиконового полимера (полидиметилсилоксана, PDMS), содержащий два параллельных микроканалов (1 мм длина ширина х высота 150 мкм х 1 см), разделенных гибкой пористый (диаметром пор 10 мкм, 25 мкм , с расстоянием между порами до поры) PDMS мембраны 5,9. Изготовьте кишка-на-чипе (рисунок 1А, слева) , следуя инструкциям на странице .

  1. Процедура микротехнологий от Gut-5,9 на чипе.
    1. Готовят неотвержденных дегазированного PDMS путем смешивания форполимера PDMS и отвердитель (15: 1 вес / вес), и поместите его в вакуумном эксикаторе в течение 30 мин.
    2. Залить 30 г и 3 г нелеченых, дегазированной PDMS на каждую силиконовум форму, которая имеет СУ-8 micropatterns на основе верхних и нижних микроканалы кишки-на-чипе, соответственно. Затем отверждение при 60 ° С в сушильном шкафу в течение по лвосток 4 ч.
    3. Выемки верхний и нижний слои PDMS из каждой кремниевой формы путем разрезания вокруг края с помощью хирургическим скальпелем. Удар 6 отверстий (два входа, два выхода и два вакуумных камер) с помощью перфоратора биопсии (2,0 мм в диаметре отверстия).
    4. Приготовьте пористую мембрану путем заливки 10 г нелеченых и дегазированной PDMS на силанизированном кремниевой пластины, содержащей почтовые массивы с круглыми столбами (10 мкм в диаметре, высотой 25 мкм), наложенной с плоской, силанизированы опорный слой PDMS (15: 1, W / вес, толщиной 1 см). Поместите 3 кг веса прижимного на установке и вулканизации полимера при 60 ° С в течение 12 часов или дольше.
    5. Выемки установку пористой мембраны PDMS приклеен к опорной плите PDMS из кремниевой пластины, осторожно поднимая угол плиты от пластины, и слезать, пока пористая мембрана PDMS полностью не отделяется от пластины.
    6. Выставляют сторону канала верхнего слоя (PDMS, 15: 1, вес / вес) и пористой стороне мембраны к плАсма генерируется портативном коронного пропиточной машине в течение 1 мин и 3 сек, соответственно.
    7. Поместите плазменной обработки поверхности пористой мембраны PDMS и верхний слой микроканалов в конформном контакте, помещая каждый фрагмент параллельно без каких-либо воздушных пузырьков.
    8. Выдержите всю установку при 80 ° CO / N для необратимого связывания двух PDMS слоев.
    9. Лупиться слоя поддержки PDMS из сборки верхнего слоя с пористой мембраной, осторожно поднимая угол опорного слоя, и отслаивание, пока опорный слой не будет полностью отделена от верхнего слоя с мембраной.
    10. Оторвите части этой мембраны, расположенной над вакуумными камерами (двумя камерами, расположенные по обе стороны от основного канала) с помощью тонкой кончик пинцетом, чтобы сделать полые вакуумные камеры.
    11. Выставляют сторону с мембраной, прикрепленной к верхней части и на стороне с каналами выгравированными на нижней части плазмы в таким же образом, как описано Iп шаг 1.1.6 в течение 1 мин.
    12. Выравнивание верхнего слоя микроканальной с пористой мембраной, а нижний слой с конформного контакта, помещая каждый фрагмент параллельно без каких-либо воздушных пузырьков под стереоскоп.
    13. Cure всю установку в сухой печи при 80 ° CO / N для получения полной шкалы кишки на чипе микрожидкостных устройство, содержащее два полых вакуумные камеры рядом с каналом микрожидком клеток.
  2. Подключение трубки к входному отверстию и на выходе из каждого порта, связанного с верхним или нижним микроканалы в кишечнике-на-чипе через 90 ° согнутой из нержавеющей стали с тупым концом иглы.
  3. Подключите трубку к отверстиям, связанных с использованием вакуумных камер 90 ° согнутую из нержавеющей стали тупым концом иглы.
  4. Стерилизация микроканалов и трубки пропусканием 70% (об / об) этанола с использованием 1 мл стерилизованные одноразовый шприц.
  5. Иссякнуть микроканалов и трубки в 60 ° C сухой печи O / N.

2. Рост микродвигательEred ворсинок кишечника в устройстве Gut-на-чипе

  1. Семенной эпителиальные клетки кишечника (например , Сасо-2BBE) на Gut-на-чипе микроустройство. 5,9
    1. Стерилизация устройство с 70% (об / об) этанола (этап 1.4) с использованием 1 мл стерилизованной одноразовый шприц с последующей сушкой в ​​сушильном шкафу O 60 ° C / N (этап 1.5) до активации поверхности.
    2. Выставляют полную установку ТВО-на-чипе микросистемы (т.е. тело кишка-на-чипе , соединенного с трубкой) УФ - излучения (253,7 нм) и озона одновременно в течение 40 мин.
    3. Охладить прибор при комнатной температуре в течение 15 мин под УФ-светом в кабинете биологической безопасности (BSC).
    4. Введем 100 мкл ЕСМ покрытия находить оптимальные решения в смесь 50 мкг / типа мл коллагена и 300 мкг / мл внеклеточного матрикса смеси разведенной в бессывороточной среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM), - в верхней и нижней микроканалов с помощью одноразового использования , стерильный шприц емкостью 1 мл.
    5. Инкубаторыт.е всю установку в 37 ° C увлажняются 5% CO 2 инкубаторе в течение 1 ч.
    6. Дега 50 мл подогретого (37 ° С) полной культуральной среде (DMEM, 20%, об / об, фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина; на аликвоты в 3 мл одноразовый шприц) с использованием системы фильтрации 50 мл (0,45 мкм размер пор) в КБС в течение 1 мин.
      1. Пропускают подогретого среды через систему фильтрации и нажмите аккуратно на фильтруемой среды в течение 1 мин для удаления пузырьков воздуха или газа, растворенного в среде.
    7. Поместите аликвоты дегазированной полной среды в 3 мл одноразовый шприц и инкубировать при 37 ° С увлажненного 5% CO 2 инкубаторе в течение 1 ч.
    8. Подключить два 3 мл одноразовые шприцы, содержащие дегазированной, предварительно нагретом полной культуральной среде верхней и нижней микроканалов.
    9. Поток Дегазированную полная среда для культивирования клеток в верхнюю микроканале с помощью шприцевого насоса в объемномскорость 30 мкл / ч потока (эквивалент напряжения сдвига на 0,02 дин / см 2) при 37 ° C увлажняются 5% CO 2 инкубатор O / N.
  2. Формирование Microengineered Сасо-2 в Вилли Gut-на-чипе.
    1. Использование клеток Сасо-2BBE с числом пассажей в диапазоне от 50 до 65 лет.
    2. Рост клеток Сасо-2 в Т75 колбу , содержащую полную культуральную среду в 37 ° C увлажненный 5% CO 2 инкубаторе в течение 4-5 дней , чтобы получить полностью вырожденные клетки.
    3. Добавьте 10 мл Ca 2+ и Mg 2+ -бесплатно PBS , чтобы полностью сливающихся клеток Сасо-2 выращивали в колбе Т75, промыть клетки, а затем аспирата из PBS. Повторите этот шаг дважды.
    4. Добавьте 1 мл 0,05% раствора трипсин / ЭДТА и инкубировать в 37 ° C увлажняются 5% CO 2 инкубаторе в течение 5 мин.
    5. Ресуспендируют диссоциированных клеток с 10 мл подогретого полная среда для культивирования клеток (с FBS) с помощью пипетки вверх и вниз от трех до пяти раз.
    6. Спин вниз клеточной суспензии на сentrifugation при 500 мкг в течение 5 минут, затем удалите супернатант.
    7. Ресуспендируют снова с 1 мл предварительно нагретого полной среды для регулирования плотности клеток в ~ 1,5 × 10 5 клеток / см 2 в устройстве. С помощью гемоцитометра для оценки плотности клеток.
    8. Настоять 100 мкл ресуспендировали клеток Сасо-2, в верхней микроканале (Просвет сторона), помещая 1 мл шприц одноразового прикрепленный к 25 G5 / 8 иглы на выходе из трубки соединена с верхним микроканала.
    9. Зажмите все входы и выходы из трубки, соединенные с верхними и нижними микроканалов с использованием связующих клипов.
    10. Инкубируют всю установку в 37 ° C, увлажненного 5% CO 2 инкубаторе в течение 1 часа , чтобы дать диссоциированных клеток Сасо-2 , чтобы прилипать к поверхности пористой мембраны.
    11. Удалить зажимы и возобновить подачу культуральной среды только к верхней микроканале при 30 мкл / час при помощи шприца до тех пор, пока клетки не образуют интактный монослой в течение 24-36 часов. Использование фазовых контраст или дифференциальный интерференционный контраст (DIC) микроскопии для подтверждения межклеточных соединений в клетке монослоя.
    12. Когда клетки образуют монослой, обрызгивать культуральной среды в обоих верхних (просвет) и нижней (капилляра) микроканалов при той же скорости потока 30 мкл / ч.
    13. Применение механических деформаций , имитирующих перистальтику подобных движений 5,9.
      1. Включите вакуумный насос, снабженный натяжного оборудования.
      2. Соедините вакуумные камеры с вакуумным контроллером с помощью трубки с разъемом из нержавеющей стали.
      3. Установить растяжку движение 10% среднего клеточного штамма на частоте 0,15 Гц с режимом циклической синусоидальной функцией от управляющего программного обеспечения вакуума, а затем нажмите кнопку "Пуск".
    14. Поддержание постоянного потока культуральной среды (30 мкл / ч), в верхней и нижней микроканалов к вырожденным Сасо-2 монослоя под действием механических деформаций (10%, 0,15 Гц) в течение ~ 100 ч.
      Примечание: Сасо-2 клетки Sponновременно подвергаются ворсинок формообразование с волнистой 3D проекции , оказанный просвет эпителиальной микроканале 5,8-10.
  3. Для имитации функций органа на уровне живого человеческого кишечника с просветом капилляра интерфейс ткани в кишечнике-на-чипе 10, выполните следующие действия , как описано.
    1. Grow microengineered Сасо-2 ворсинки, повторяя шаги от 2,1 до 2,2.
    2. Поток предварительно подогретой совместно культуральной среды (смесь полного Сасо-2 клеточной культуральной среды и полной HMVECs культуральной среды, 1: 1 об / об) к верхней и нижней микроканалов при 30 мкл / ч.
    3. Представьте 100 мкл диссоциированных нормальных человеческих капиллярная микрососудистых эндотелиальных клеток (HMVECs конечна плотность клеток, ~ 5,0 × 10 5 клеток / см 2) в нижнее микроканале по идентичным способом , описанным в шагах от 2.2.3 до 2.2.9.
    4. Поместите отвержденного прямоугольный кусок PDMS (0,5 см х 1 см х 1 см, ширина х высота х длина; 15: 1, ш/ вес эластомера: отвердитель) на верхней части устройства кишка-на-чипе, затем переверните установку устройства весь вниз головой (то есть, верхняя Микроканал лица к нижней стороне, а нижняя Микроканал лица к верху).
    5. Выдержите установки в 37 ° C, увлажненного 5% CO 2 инкубаторе в течение 1 часа , чтобы позволить Диссоцииро- HMVECs прилипать к поверхности пористой мембраны , в нижней части микроканала.
    6. Выньте всю установку из CO 2 инкубатора и переворачивания установку снова.
    7. Поток подогретого совместно культуральной среды (смесь полного Сасо-2 клеточной культуральной среды и полной HMVECs культуральной среды, 1: 1 об / об) в верхней и нижней микроканалов при 30 мкл / ч с механическим простирающихся движений ( 10%, 0,15 Гц) в течение не менее трех дней, чтобы сформировать межклеточных сочленений эндотелиальной монослоя.

3. Хост-выпотрошить микробиомом Совместное культивирование в микроустройство Gut-на-чипе

  1. Выполнение предварительной культуры ое бактериальные клетки, как следует взаимодействовать культуры синантропных кишечника микробиомом на microengineered ворсинок кишечника.
    1. Ресуспендируют лиофилизированный пробиотический бактериальный порошкообразной смеси в 10 мл смеси (1: 1, об / об) автоклавного лактобацилл MRS бульоном и Обогащенную среду клостридий.
    2. Регулировка конечной плотности клеток приблизительно до 0,2 единиц оптической плотности (при 600 нм) путем добавления соответствующего количества среды, а затем аликвоты 3 мл микробной клеточной суспензии в 10 мл одноразовой стерильной пробирке.
    3. Место пробирки, содержащие ресуспендировали микробных клеток в анаэробном контейнере. Добавьте две пачки анаэробного газогенерирующей саше в контейнере. Закройте крышку контейнера плотно и инкубировать установку контейнера без встряхивания при 37 ° C увлажняются 5% СО 2 инкубатора O / N.
  2. Прививка микробиомом и Co-культуры с эпителиальные клетки кишечника 5,10.
    1. Подготовьте 3 мл одноразовые шприцы, содержащие дегазированной antibiotiC-свободной среда для культивирования клеток (т.е. DMEM с 20% FBS). См 2.1.6 для процедуры дегазации культуральной среды.
    2. Выньте всю установку устройства кишка-на-чипе , содержащем microengineered ворсинки из СО 2 инкубатора, а затем перейти к шкафу биологической безопасности.
    3. Удалить шприцы, подключенные трубок, связаны с верхним и нижним микроканалов. Подключите шприцы , подготовленные в разделе 3.2.1 к устройству, чтобы вернуть к CO 2 инкубаторе, а затем течет этот антибиотик культуральной среды в течение 12 ч до посева микробиомом.
    4. Спином вниз предварительно культивированных клеток пробиотических бактерий смесь (см действия, описанные в разделе 3.1) при 10000 мкг в течение 5 мин. Отберите из надосадочной жидкости с использованием вакуума, а затем вновь суспендируют в антибиотической свободной DMEM среде (конечная плотность клеток, ~ 1,0 × 10 7 КОЕ / мл).
    5. Настаивать суспензии клеток в просвете сторону микроканала, содержащего "стерилен" кишечные ворсинки с использованием 1 мл шприц одноразового присоединенный к 25G5 / 8 иглы. Разрешить адгезию микробных клеток к апикальной поверхности кишечных ворсинок в течение ~ 1,5 ч без потока с помощью зажима, чтобы полностью конца насосно-компрессорных труб.
    6. Заливать подогретого антибиотику культуральной среды в верхней и нижней микроканалов при 40 мкл / ч с циклическими ритмических деформаций (10%, 0,15 Гц).
    7. Для совместного культивирования зеленого белка флуоресценции (GFP) меченных E. coli (GFP E.coli; Непатогенные DH5-альфа кишечной палочки хозяева) 10,11 клетки с microengineered ворсинок, предварительно культивируют Е. GFP Клетки палочки в среде LB автоклавного при 37 ° C при встряхивании условию (200 оборотов в минуту) в течение 12 ч. Повторите процедуру , начиная с 3.2.5 до 3.2.6 осуществлять совместное культивирование E. GFP Клетки палочки с microengineered ворсинок.
  3. Image Клетки 5,8-10
    1. Выполните DIC, эпифлуоресцентной или лазерной сканирующей конфокальной микроскопии для записи микробные и эпителиальной морфологии 5,8,10.
      1. Для визуализации DIC, вынимают установку кишка-на-чипе микросистемы из CO 2 инкубатора, место установки устройства на этапе микроскопа, а затем запись морфологии клеток.
      2. Для флуоресцентной визуализации ворсинок эпителия, поток PBS для промывания клеток в количестве 100 мкл / ч в течение 10 мин.
        1. Закрепить ворсинки с 4% (вес / объем) параформальдегидом в течение 15 мин. Затем поток PBS для промывания клеток в количестве 100 мкл / ч в течение 10 мин.
        2. Проницаемыми ворсинки с 0,3% (об / об) Тритона X-100 в PBS, разбавленный, содержащей 2% (вес / об) альбумина бычьей сыворотки (BSA) в течение 10 мин. Затем поток PBS для промывания клеток в количестве 100 мкл / ч в течение 10 мин.
        3. Блокбоксов с помощью 2% (вес / объем) раствора БСА в PBS в течение 1 часа. Затем поток PBS для промывания клеток в количестве 100 мкл / ч в течение 10 мин.
        4. Добавьте 300 нМ 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид раствор (DAPI), разведенного в PBS для ядерного окрашивания под действием света защиты.
        5. Добавьте 25 ед / мл флуоресцентного фаллоидином(Фаллоидином-CF647 конъюгат), растворенного в PBS для F-актина окрашивания под легкой защитой.
        6. Запись изображений флуоресцентно окрашенных клеток с использованием лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.
          Примечание: Цель 25X была применена с соответствующим оптическим зумом во время конфокальной микроскопии. На фигуре 3B, использовали около 525x увеличения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для имитации человеческого кишечника хозяина-микробиомом экосистемы в пробирке, то Необходимо разработать экспериментальный протокол для восстановления стабильного долгосрочного сотрудничества культуры кишечных бактерий и эпителиальных клеток кишечника человека в физиологических условиях, таких как перистальтика типа механики и потока жидкости. Здесь мы используем Биомиметический кишки на-чипе микроустройство (Рисунок 1А) для совместного ку...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Понимание хост-микробиомом взаимодействия имеет решающее значение для продвижения медицины; Тем не менее, традиционные модели клеточных культур , выполненные в пластиковом блюде или статичным луночного планшета не поддерживают стабильное совместное культивирование клеток кишечника человека с живой кишки микробами в течение более 1-2 дней , потому что микробные клетки в основном перерастают клетки млекопитающих в пробирке. Зарастание микробная популяция быстро поглощает кислород и питательные вещества, впоследст...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Дональд Э. Ингбер является основателем компании Emulate Inc., владеет акциями компании и возглавляет ее Научно-консультативный совет. Другие авторы не раскрывают финансовую информацию.

Благодарности

Мы благодарим Шри Косури (Институт Висса при Гарвардском университете) за предоставление штамма E. coli, меченного GFP. Эта работа была поддержана Агентством перспективных оборонных исследовательских проектов в соответствии с Соглашением о сотрудничестве No W911NF-12-2-0036, Управлением по контролю за продуктами и лекарствами по контракту #HHSF223201310079C и Институтом биологической инженерии Висса при Гарвардском университете. Взгляды и выводы, содержащиеся в этом документе, принадлежат авторам и не должны толковаться как представляющие официальную политику, выраженную или подразумеваемую, Армейского исследовательского офиса, Армейской исследовательской лаборатории, Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов или правительства США. Правительство США имеет право воспроизводить и распространять репринты в государственных целях, невзирая на какие-либо упоминания об авторских правах в настоящем документе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Модифицированная орлиная среда Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), содержащая 25 мМ глюкозы и 25 мМ HEPESGibco10564-011Разогрейте до 37 градусов; С на водяной бане.
Difco Lactobacilli MRS бульонBD288120Запустить автоклав при 121 °°; C в течение 15 мин.
Поли(диметилсилоксан)Dow Corning3097358-100415:1 (w/w), PDMS : лечебный агент
Caco-2BBE линия колоректальной карциномы человекаГарвардский центрКолоректальная аденокарцинома человека 
Термоинактивированный FBSGibco10082-14720% (v/v) в DMEM
Пенициллин-стрептомицин-глутаминGibco10378-0161/100 разведение в DMEM
4′,6-Diamidino-2-фенилиндола дигидрохлоридМолекулярные зондыD1306Окрашивание ядер
Phalloidin-CF647 конъюгат (25 ед./мл)Окрашивание
Система натяжения Flexcell FX-5000Flexcell International CorporationFX5KПеристальтикоподобное растяжение (10% деформации клеток, частота 0,15 Гц)
Инвертированный эпифлуоресцентный микроскопZeissAxio Observer Z1Imaging, DIC
Сканирующий конфокальный микроскопLeicaDMI6000Imaging, Флуоресцентный
UVO CleanerJelight Company Inc342Поверхностная активация кишечного чипа
коллагена I типа GibcoA10483-01Компонент внеклеточного матрикса для клеточной культуры в чип
MatrigelBD354234Компонент внеклеточного матрикса для клеточной культуры в чип
1 мл одноразовый шприцBD309628Материал для инъекций клеток и сред
25 г 5/8 иглаBD329651Материал для инъекций клеток и сред
Шприцевой насосBraintree Scientific Инк.BS-8000Инъекционное оборудование в чип
VSL#3Sigma-Tau Pharmaceuticals7-45749-01782-6Состав из 8 различных комменсальных кишечных микробов
Армированная клостридиальная средаBD218081анаэробная среда для культивирования бактерий
GasPak EZ Анаэробная контейнерная система с индикаторомBD260001Анаэробный газогенерирующий пакетик 
4% параформальдегидЭлектронная микроскопия Наука157-4-100Фиксация клеток для окрашивания
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Проникновение в клетки
Бычий сывороточный альбуминSigma-AldrichA7030Блокатор для окрашивания клеток
Corona TreaterElectro-Technic ProductsBD-20ACПлазменный генератор для изготовления чипа
Steriflip MilliporeSE1M003M00Дегазация всей питательной среды
Одноразовый гемоцитометрiNCYTODHC-N01Для ручного подсчета клеток
заболеваний пищеварительной системы F-актина Biotium 00041

Ссылки

  1. Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
  2. Tremaroli, V., Backhed, F. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism. Nature. 489, 242-249 (2012).
  3. Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C. M., Brett Finlay, B. Gut Microbiota in Health and Disease. Physiol. Rev. 90, 859-904 (2010).
  4. Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
  5. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
  6. Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 313-323 (2009).
  7. Garrett, W. S., et al. Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system. Cell. 131, 33-45 (2007).
  8. Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5, 1130-1140 (2013).
  9. Huh, D., Kim, H. J., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nat Protoc. 8, 2135-2157 (2013).
  10. Kim, H. J., Li, H., Collin, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, E7-E15 (2016).
  11. Miller, W. G., Lindow, S. E. An improved GFP cloning cassette designed for prokaryotic transcriptional fusions. Gene. 191, 149-153 (1997).
  12. Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15, 745-752 (2015).
  13. Lentle, R. G., Janssen, P. W. Physical characteristics of digesta and their influence on flow and mixing in the mammalian intestine: a review. J Comp Physiol B. 178, 673-690 (2008).
  14. Granato, D., et al. Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii La1 to human enterocyte-like Caco-2 cells. Appl Environ Microbiol. 65, 1071-1077 (1999).
  15. Dewhirst, F. E., et al. The human oral microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
  16. Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat Rev Microbiol. 9, 244-253 (2011).
  17. Hay, P. E., et al. Abnormal bacterial colonisation of the genital tract and subsequent preterm delivery and late miscarriage. Br Med J. 308, 295-298 (1994).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Caco 2
Совместное культивирование жизни микробиомом с Microengineered человека ворсинок кишечника в Gut-на-чипе микрожидкостных устройств
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.