Разработка Вставка совместного культивирования системы двух клеточных типов в отсутствие межклеточных контактов

Краткое содержание

У многоклеточных организмов секретируемые растворимые факторы вызывают реакцию различных типов клеток в результате паракринной сигнализации. Системы ко-культивирования вкладышей предлагают простой способ оценки изменений, опосредованных секретируемыми растворимыми факторами в отсутствие межклеточного контакта.

Аннотация

Роль секретируемых растворимых факторов в модификации клеточных реакций является постоянной темой при изучении всех тканей и систем. В попытке прояснить очень сложные отношения между несколькими клеточными подтипами, составляющими многоклеточные организмы, были разработаны методы in vitro, чтобы помочь исследователям получить детальное представление об одноклеточных популяциях. В одном из таких методов используются вставки с проницаемой мембраной, позволяющей диффундировать секретируемым растворимым факторам. Таким образом, популяция клеток, выращенных во вкладышах, может быть совместно культивирована в лунке или чашке, содержащей другой тип клеток, для оценки клеточных изменений после паракринной передачи сигналов в отсутствие межклеточного контакта. Такие вставные системы ко-культивирования обладают различными преимуществами по сравнению с другими методами ко-культивирования, а именно двунаправленной сигнализацией, консервативной клеточной полярностью и популяционно-специфичным обнаружением клеточных изменений. В дополнение к использованию в области воспаления, рака, ангиогенеза и дифференцировки, эти системы совместного культивирования имеют первостепенное значение для изучения сложных взаимоотношений, существующих между различными клеточными подтипами, присутствующими в центральной нервной системе, особенно в контексте нейровоспаления. В данной статье предлагаются общие методические указания по постановке эксперимента по оценке клеточных изменений, опосредованных секретируемыми растворимыми факторами, с использованием системы совместного культивирования со вставкой. Кроме того, будет подробно описан специальный протокол для измерения нейровоспалительных эффектов цитокинов, секретируемых липополисахарид-активируемой N9-микроглией на нейрональные клетки PC12, что дает конкретное понимание методологии совместного культивирования вставок.

Введение

Изучение тканей, органов или систем в пробирке является попыткой упростить очень сложные отношения , существующие между несколькими сотовыми подтипов , которые включают многоклеточные организмы. Действительно, в пробирке исследования позволяют получить детальное представление о популяции отдельных клеток. Есть два основных преимущества проведения в лабораторных экспериментах: 1) уменьшение клеточных взаимодействий, и 2) способность легко манипулировать клеточной среде. Таким образом, эти два преимущества позволили ученым предсказать поведение конкретных типов клеток в живом организме , что приводит к способности регулировать результаты внешних влияний в целых организмах. В этом смысле, в пробирке культуры клеток часто работает в качестве моста , соединяющего фундаментальных и прикладных наук о жизни. Тем не менее, есть и несколько недостатков работы в лабораторных условиях , наиболее важным из них в том , что определенная оговорка может пребывать в физиологическомаль значимость наблюдаемых фенотипов. В самом деле, когда один тип клеток выращивают в сосуде, культура теряет, в разной степени, его межклеточные соединения с другими типами клеток, его вклад в гуморальной среде из ткани и организма происхождения, а также якорей в пределах ткани, что позволило ему поддерживать определенную трехмерную структуру, иногда решающее значение для функции клеток.

Вопрос о межклеточных отношений была решена развитием смешанных методов культуры. В этом способе две или более клеточных популяций выращивают вместе в той же культурального сосуда. Тем не менее, эти смешанные культуры несут важные неудобства. С одной стороны, некоторые клеточные подтипы физически не взаимодействуют друг с другом в ткани происхождения и полагаться только на паракриновых связи понесенных секретируемых растворимых факторов и соседних рецепторов. Это случай для нескольких воспалительных процессов, которые зависят от проксимального сигнализации цитокина. В смешанном Cultures, физические взаимодействия неизбежны и сделать невозможным изучение паракринной связи в отсутствие межклеточных контактов, которые могут дать измененные результаты. С другой стороны, достижение клеточно-специфической интерпретации внутри смешанной популяции становится невозможным без использования жестких методов разделения, которые могут существенно повлиять на результаты.

Для решения этих важных вопросов, использование кондиционированной среды была разработана в качестве метода, позволяющего для разобщенным культур и изучения паракринной сигнализации. Этот метод требует передачи супернатанта одного типа клеток, так назвали кондиционированной среды, в лунки, содержащие другую популяцию клеток. Тем не менее, существенным недостатком является то, что короткоживущие молекулы не достаточно долго, в кондиционированной среде, чтобы быть переданы в лунки второго популяции клеток. Даже долгоживущие молекулы будут сильно разбавленный с течением времени за счет диффузии. Кроме того, обе ячейкинаселения участвуют только в одном направлении паракринному коммуникации, а не в активной двунаправленной связи. Это приводит к отсутствию сигналов обратной связи , которая имеет жизненно важное значение в воссоздании точных многоклеточные отношения , как они существуют в естественных условиях.

Как следствие , и движимый необходимостью лучше имитировать оригинал в условиях естественных условиях в клеточной среде в пробирке, несколько методов достижения в области клеточных культур были достигнуты на протяжении многих лет. Одним из наиболее значительных достижений было использование проницаемых штативов с микропористых мембран для compartmentalizing клеточных культур, используемых в первый раз по Grobstein в 1953 году ^1. Такие проницаемые опоры были адаптированы на протяжении многих лет для размещения многочисленных типов клеток , и которые будут использоваться в нескольких различных приложений. В настоящее время, эти опоры существуют в виде полых вставок, которые предназначены для отдыха в скважинах из тканевой культуры пластины многоямного или в CircuLAR блюда. В системе со-культуры, вставка содержит один тип клеток , тогда как колодец или блюдо содержит другой клеточной популяции, что позволяет изучать вклад двух различных популяций клеток на их гуморального среды (рисунок 1). В результате, клеточная полярность (базолатеральная против апикальной секреции или приема сигнала) сохраняется, таким образом, присвоение Systems вставки сокультуре важное преимущество перед смешанных культур и кондиционированную среду методов. Несколько типов мембранных материалов доступны, наиболее распространенными из которых являются полиэстер (PET), поликарбонат (PC) или коллаген покрытием из политетрафторэтилена (PTFE), и они существуют в различных размеров пор в диапазоне от 0,4 мкм до 12,0 мкм. Эти разновидности материалов и размеров пор предлагают спектр вставок воздействует переменным функции, имеющие отношение к оптическим свойствам, толщины мембраны и присоединение клеток, которые делают их практичными на различных уровнях для следующих видов применения, не ограничиваясь ими:
-studyingклеточной дифференцировки, эмбриональное развитие, метастазирование опухолей и заживлении ран путем хемотоксических анализов через проницаемые мембраны;
-evaluating проникновения наркотиков путем оценки их переноса через эпителиальные или эндотелиальные монослои культивировали на проницаемые опорах, и;
-performing клеточные сокультурах для анализа модуляций поведение клеток, индуцированные секретируемых растворимых факторов, в отсутствии межклеточного контакта.

Цель данной статьи состоит в том, чтобы описать общие методические указания для выполнения третьей функции указанной выше, то есть оценить клеточные изменения, опосредованные секретируемых растворимых факторов при отсутствии межклеточного контакта, используя систему вставки совместного культивирования. Несколько различных направления исследований, систем использования вставки совместно культуры для того, чтобы ответить на вопросы, относящиеся к действию секретируемых растворимых факторов на популяции клеток. Действительно, паракринная сигнализации, который модулирует клеточный поведение на различных уровнях уместен во всех тканяхи систем, что делает вставки системы совместного культивирования незаменим для обеспечения прогресса в этих областях. С другой стороны, использование вставок может подтвердить, что преобразование сигналов является прямым контактом межклеточной и не секретируемых факторов. Одним из наиболее важных областей применения вставок в исследованиях воспаления ^2-14 , где эффект секретируемых цитокинов оценивается в различных клеточных игроков иммунитета. В частности, исследование воспаления в центральной нервной системе (ЦНС) значительно выгоду от исследований вставки совместно культуры, которые позволили более четкому определению различных паракринной роли нейронов и микроглии в вождении нейровоспаления ^15-21. Эти системы были разработаны также изучить противовоспалительный потенциал молекул , который зависит от их способности снижать или ингибировать секрецию провоспалительных факторов ^22-26. Исследования , относящиеся к раку ^27-31, в частности , механизмы , лежащие в основе ангиогенез ^32-34 и inflammatiна ^35-42 в онкогенеза, также извлекает выгоду из систем вставки совместного культивирования. Кроме того, растворимые факторы имеют первостепенное значение в процессах , которые управляют дифференцировка и несколько исследований использовали вставки , чтобы ответить на вопросы в этой конкретной области ^43-50. В ЦНС, видя , как нервная ткань имеет очень ограниченный потенциал обновления, изучение neurotrophism и нейропротекции является фундаментальным и широко обеспечивается за счет использования стволовых клеток в системах совместного культивирования ^51-56. Кроме того, вставки также используются в качестве различных областях , как нефрологии ^57,58, эндотелиальных взаимодействий и ангиогенеза ^{59-62, 63-65} апоптоз сигнализации, воспаление ожирения и метаболического синдрома ^22,23,66-67, внутреннего уха защиты волосковых клеток ^68,69, и даже в вирулентности гриба ^70,71 и ^72,73 паразитологии.

В данной статье общие методические указания для того, чтобы создать experimлор ввиду оценки клеточных изменений, опосредованных секретируемых растворимых факторов, с использованием системы вставки сокультивирования. В частности, мы сосредоточим наше внимание на нервных клеток со-культур и их использования в учебном процессе нейрогенный. С учетом весьма обширный спектр экспериментов, которые вставляет позволяют пилоту, это невыносимо, чтобы охватить все аспекты этого метода клеточной культуры. В качестве примера, конкретный протокол для измерения эффектов цитокинов, секретируемых липополисахарида (LPS) -активированную N9 микроглии на нейрональных клетках РС12 будут подробно, предлагая конкретное понимание методологии вставки сокультуры.

Протокол

Примечание: В каждом из следующих шагов должны быть выполнены в стерильных условиях в вытяжном шкафу с ламинарным потоком воздуха, как требуется для культуры клеток млекопитающих. Кроме того, общие принципы для оптимального выращивания стерильной клетки применяются, например., Отбрасывая Подсказок в любое время они могут привести к перекрестному загрязнению, уменьшая количество времени клетки подвергаются воздействию воздуха при выполнении целые смены носителя, должным образом, но аккуратно помешивая все клеточные суспензии, чтобы обеспечить их гомогенное пипетирования и т.д. Кроме того, вставки являются своего рода, которые требуют Пластик специальной обработки. Во-первых, всякий раз, когда вставки манипулируют, не касаясь хрупкой мембраны, которая легко рвется и, следовательно, может поставить под угрозу эксперимент. Кроме того, он не подходит для выполнения вакуум-аспирации среды культуры клеток, так как существует риск перфорации мембраны или диссоциирует прилипшие клетки. Затем вставки провисать в культуре ткани пластины многоямного и, таким образом, осторожность должна быть использована, когда моВинг в или когда из пластмассы пипеткой, чтобы избежать отделяя прилипшие клетки. Кроме того, при использовании пластин с большими размерами пор, существует вероятность того, что среда для культивирования клеток просачивается через мембрану и, следовательно, важно, чтобы часто контролировать уровень жидкости. Наконец, следует отметить, что следующий протокол предназначен для адгезивных клеток и требует незначительных модификаций для того, чтобы быть пригодным для суспензии клеток.

1. Общие рекомендации по проведению экспериментов вставки совместного культивирования

1. Посев тип клеток # 1 в вкладышами
   1. Берем вставки из упаковки.
   2. Поместите вставки в пустой многоямного тканевой культуральной пластины нужного размера. Чтобы сделать это, сцепление верхний край вставки с помощью пинцета.
   3. Для того, чтобы улучшить прикрепление и распространение адгезивных клеток, состояние вставки с клеточной культуральной среды перед посевом. Для этого, покрывают всю поверхность мембраны с клеточной культуры mediuм с помощью микропипетки.
      Примечание: Делайте это столько вставок по мере необходимости.
   4. Установите крышку на тарелку и инкубировать в течение по меньшей мере 1 ч , или O / N в тех же условиях (обычно 37 ° C, 5-10% СО _2).
   5. Когда вкладыши кондиционируют, удалить все клеточной культуральной среды с использованием микропипетки. Утилизировать отработанное среду.
   6. Семенной тип клеток # 1 в свежей среде для культивирования клеток таким же образом, как в многоямного пластине. Для этого нарисуйте соответствующий объем клеточной суспензии с помощью микропипетки и дозирования жидкости во вставке.
      Примечание: Готовят много вставок по мере необходимости.
   7. После засева все вставки, осторожно встряхните пластину влево и вправо, а затем назад и вперед для того, чтобы равномерно распределить клетки. Избегайте круговых движений, так как это приведет к тому, клетки накапливаются в центре вставок.
   8. Поместите крышку на тарелку и инкубировать, как определено в соответствии с требованиями сотовой связи (обычно 37 ° С, 5-10% СО _2).
2. Посев тип клеток # 2 в многоямный культуре ткани пластин
   1. Семенной тип клеток # 2 в свежей среде для культивирования клеток в соответствии с разделом 1.
   2. Подготовьте столько скважин в соответствии с требованиями для числа вставок. Рок пластины, как на этапе 1.1.7), чтобы гарантировать, что клетки равномерно распределены в скважинах.
   3. Поместите крышку на тарелку и инкубировать при тех же самых условиях (обычно 37 ° C, 5-10% СО _2).
3. Освежающий средних вставок
   1. С помощью микропипетки, удалить часть или всю среду для культивирования клеток, во вставках, содержащих типа клеток # 1. Утилизировать отработанное среду.
   2. Draw соответствующий объем свежей среды для культивирования клеток. Осторожно отдохнуть кончик на внутренней стенке вставки и медленно дозировать среду для культивирования клеток.
   3. Поместите крышку на тарелку и инкубировать в соответствии с шагом 1.1.4.
4. Освежающий среда в многоямный культуре ткани пластин
   1. Использование micropiPette, удалить часть или всю среду для культивирования клеток в лунках, содержащих типа клеток # 2. Утилизировать отработанное среду.
   2. Draw соответствующий объем свежей среды для культивирования клеток. Подведите наконечник на внутренней стенке колодца и медленно дозировать среду для культивирования клеток.
   3. Поместите крышку на тарелку и инкубировать в соответствии с ранее установленными протоколами клеточных культур.
5. Перенос вставок, содержащих тип клеток # 1 в культуральных планшетах, содержащих луночные типа клеток # 2.
   Примечание: Выполните этот шаг, когда оба типа клеток достигли соответствующего этапа роста.
   1. До переноса вставки в лунки, внесите необходимые изменения средних, как описано выше в пунктах 1.3) и 1.4).
      Примечание: В этот момент очень важно распределить соответствующие объемы информации в обоих отсеках, как указано в инструкции производителя вставить в.
   2. С помощью пинцета, захватывают верхний край вставки, содержащей Т-клетокYpe # 1 и аккуратно поместите его в соответствующем лунку, содержащую тип клеток 2 #.
   3. После переноса всех вставок, проверить на наличие пузырьков воздуха под мембраной вставок.
      Примечание: Воздушные пузырьки предотвращают любой обмен через мембрану вставки и может поставить под угрозу весь эксперимент.
   4. Если воздушные пузырьки присутствуют, очень осторожно поднимите вставку из скважины с использованием пинцета и погрузить обратно в среду для культивирования клеток. Пузырьки исчезнет. Если они все еще присутствуют, попробуйте пологие вставки обратно в среду для культивирования клеток под углом.
      Примечание: Не стучите или размешать вставки, чтобы избежать отделяя прилипшие клетки.
   5. После удаления всех пузырьков воздуха и проверяя, что объемы средств массовой информации в обоих отсеках, поместите крышку на тарелку и инкубировать.
6. Освежающие средства массовой информации в системе сокультуры
   ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, мембрана легко позволяет обмен медиа между вставкой и хорошо, освежающий среды осуществляется вобе камеры с того времени, необходимого для достижения равновесия в верхних и нижних отсеков путем диффузии в одиночку может быть довольно долго.
   1. Освежающие среда в вставок, содержащих типа клеток # 1 выполняется таким же образом, как на шаге 1.3).
   2. Для обновления среды в лунках, содержащих тип клеток # 2, аккуратно сдвиньте вставку в сторону, чтобы создать пространство, достаточно широкий, чтобы приспособить кончик пипетки. Обновите среду как на стадии 1.4).
   3. Проверьте наличие пузырьков воздуха и проверки тома, как в соответствии с пунктами 1.5.3) через 1.5.5).

2. Пример: измерения эффектов цитокинов , секретируемых ЛПС-активированных N9 микроглии на нейрональных клетках PC12

Примечание: Следующие шаги предназначены для конкретной колбы, ну и блюдо размеров. Тем не менее, протокол может быть настроен для любых размеров из пластмассы. Для получения информации и композиции см Материалы табл.

1. Посев и дифференциации клеток РС12 в мультилуночные планшеты для культур тканей
   1. Теплый рутина РС12 среда для культивирования клеток, дифференцировка РС12 среда и трипсин-ЭДТА в водяной бане при 37 ° C.
   2. Используйте РС12 клетки при 60-80% слияния от 75 см ² колбу.
   3. С 15 мм пипеткой Пастера, выполняют вакуум-аспирации всей клеточной культуральной среды в колбе.
   4. Осторожно полоскать клеточный монослой с 5 мл стерильного фосфатно-буферного раствора и удалить жидкость с помощью пипетки Пастера. Будьте осторожны, чтобы не диссоциируют клетки на этом этапе.
   5. Накройте клеточный монослой 3 мл трипсин-ЭДТА и инкубировать в течение 2-3 мин при температуре 37 ° С.
   6. Убедитесь, что все клетки отделяют под микроскопом. Если очень мало клеток плывут, инкубировать в течение более длительного периода в течение не более 5 мин.
   7. Добавьте 10 мл обычной культуральной среды клеток РС12 с целью инактивации трипсина-EDTA.
   8. С 10 мл пипетки, осторожно растирают в то время, убедившись, что большинство клеток диссоциируют от дна Oе колбы. Избегайте создания пузырьков воздуха в суспензии клеток.
   9. С помощью той же 10 мл пипетки, передачи клеточной суспензии в центрифужную пробирку на 50 мл.
   10. Центрифуга в течение 1 мин при 3200 XG
   11. Удалите супернатант с помощью пипетки Пастера, заботясь, чтобы не нарушить осадок.
   12. Добавьте 10 мл рутинного РС12 среды для культивирования клеток с 10 мл пипетки.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Этот объем может быть скорректирована, если осадок необычно маленький или большой.
   13. Растирают с тем же 10 мл пипетки для гомогенизации осадок. РС12 клетки часто слипаются так, по крайней мере, 20 пипеткой и downare необходимо.
       Примечание: В то время как энергичные растирания необходимо, во избежание образования пузырьков воздуха в суспензии клеток.
   14. В 1,5 мл пробирку, готовят соответствующее разбавление суспензии клеток в трипановым синим. Граф клеток с использованием гемоцитометра в соответствии с ранее установленными протоколами ^74.
   15. В отдельную 50 мл пробирку, разделить клеточную суспензиюс PC12 дифференциации среды для получения разбавленного клеточной суспензии , подходящие для высева скважин из 24-луночного планшета (30000 ¢ / см ^2, 0,6 мл на лунку в соответствии с протоколом производителя).
       Примечание: Пластина 24-скважина должна быть предварительно покрыты коллагена , как определено ранее установленными протоколами ^75.
   16. Распределить 0,6 мл клеточной суспензии на лунку с помощью микропипетки.
   17. Когда все лунки высевают, раскачивать пластинку как на этапе 1.1.7).
   18. Для того, чтобы позволить правильной дифференциации РС12 клеток, инкубировать 24-луночных планшетах в течение 7-9 дней при 37 ° С в атмосфере 5% СО ₂ в атмосфере влажного PC12 дифференцировки среды ^15,16 перед проведением экспериментов с совместным культивированием.
   19. Выполнение среды изменяется каждый день, удаляя половину жидкости и заменить ее с равным объемом свежей РС12 дифференциации среды.
2. Посев N9 микроглии во вставках и лечения с LPS
   1. За один день до проведения экспериментов совместного культивирования, предварительно обработать ПТФЭ 0,4 мкм порами вставки с обычной N9 среды для культивирования клеток с целью оптимизации присоединения клеток, следующие шаги 1.1.1) через 1.1.4)
   2. Теплый рутина среда для культивирования клеток Н9 и трипсин-ЭДТА в водяной бане при 37 ° C.
   3. В то же время, весит примерно 10 мг LPS в 1,5 мл трубки для последующего использования.
      Примечание: Так как LPS является мощным провоспалительных эндотоксина и требует особых мер предосторожности, очки, перчатки и респиратор в виде частиц настоятельно рекомендуется.
   4. Используйте клетки N9 на 80-90% слияния от 75 см ² колбу.
   5. Выполните шаги 2.1.3) до 2.1.14). Всегда используйте обычную N9 среда для культивирования клеток вместо рутинной культуральной среды РС12 клеток. Также отметим, что N9 микроглии не слипаются столько, сколько делают РС12 клетки, поэтому меньше пипетированием вверх и вниз могут быть необходимы на этапе 2.1.13).
   6. В отдельную 50 мл пробирку, разделить клеточную суспензию с N9 клеточной культуральной среды к оbtain разбавленной суспензии клеток , пригодных для высева вставок , предназначенных для хранения в 24-луночные планшеты (60000 ¢ / см ^2, 0,05 мл на вставку в соответствии с протоколом производителя, по площади поверхности мембраны см информацию производителя).
      Примечание: Эти вставки уже покрывают коллагеном производителем и оптимизированы для клеточной адгезии.
   7. Распределить 0,05 мл суспензии клеток на вставку с помощью микропипетки.
   8. Когда все вставки высевают, рок-пластинку как на этапе 1.1.7).
   9. Выполните серийные разведения с использованием LPS N9 среды обработки для получения 4 мкг / мл, 2 мкг / мл и / мл рабочих растворов 1 мкг.
   10. Пипетка 0,05 мл 4 мкг / мл рабочего раствора в одном множество вставок в того, чтобы получить окончательное разбавление 2 мкг / мл.
   11. Повторите шаг 2.2.10) для двух других рабочих растворов в различных комплектов вкладышей, получая конечные разведения 1 мкг / мл и 0,5 мкг / мл соответственно.
   12. Вcubate пластины , содержащие вставки в течение 24 ч при 37 ° С в 5% CO ₂ во влажной атмосфере , чтобы позволить N9 активацию микроглии с LPS перед проведением экспериментов с совместным культивированием.
3. Совместное культивирование нервных клеток РС12 с N9 микроглии
   1. На 7-9 дней дифференциации РС12 клеток, активации микроглии N9 через 24 часа инкубации с LPS теплой N9 обрабатывающей среды и среды обработки РС12 в водяной бане при 37 ° C.
   2. Произвести полную среднюю изменения для N9 микроглии, как в шаге 1.3), заменив всю используемую среду на 0,1 мл среды обработки N9. Сделайте это для каждого insert.This необходимо удалить все следы LPS, оставив только активированные микроглии N9 в вставок.
   3. Произвести полную среднюю изменения для нейрональных клеток РС12 как на этапе 1.4). Перенесите вставки в 24-луночных планшетах , как на стадии 1.5) .Incubate с Н9-РС12 совместное культивирование в течение 24 ч или 48 ч при 37 ° С в 5% CO ₂ во влажной атмосфере.
   4. После того, как 24ч или 48 ч, собирают супернатант и / или клетки на цитотоксичность, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), Вестерн-блот или другие анализы.

Результаты

Использование вставных систем совместного культивирования особенно актуально при изучении нейровоспалительных процессов, которые наглядно демонстрируют паракринной взаимосвязи между различными сотовыми игроками центральной нервной системы. Иммунитет в ЦНС осуществляется преимущественно резидентных клеток , называемых микроглии , которые контролируют окружающую их среду в их покоя разветвленная положении (фигура 2А) и способны к зондированию возмущений , которые могли бы ...

Обсуждение

Самым важным шагом любой системы эксперимента вставка сокультуры на самом деле живет в выборе правильной вставки для использования. Размер пор и материал мембраны должен быть принят во внимание тщательной, не забывая учитывать тип клеток, которые будут посеяны и цель эксперимента. Например, хемотоксических анализы могут использовать один и тот же тип мембраны, чем клеточные сокультурах для анализа модуляций поведение клеток, индуцированные секретируемых растворимых факторов, в отсутствии межклеточного контакта. Тем не м...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
RPMI-1640 средний	Sigma	R8755	Теплый в 37 градусов C водяной бани перед применением
Dulbecco' s Модифицированный Eagle' s Смесь сред/питательных веществ F-12 Ветчина	Sigma	D6421	Теплый в 37 градусов; C водяной бани перед использованием, необходимо дополнить 0,365 г/л L-глутамина
Лошадиная сыворотка	ATCC	30-2040	Согреть в 37 °°; C водяной баней перед применением
Фетальная бычья сыворотка	MultiCell	80350	Warm in 37° С водяной баной перед применением
Фактор роста нервов-7S из мышиной подчелюстной железы	Sigma	N0513	Восстановите лиофилизированный порошок в растворе буферного физиологического раствора или питательной среде для тканей, содержащей 0,1°ндаш; 1,0% бычий сывороточный альбумин или 1-10% сывороточный
раствор Трипсин-ЭДТА	Sigma	T3924	Теплый в 37° C водяной баней перед применением
Липополисахариды из  Escherichia coli  055:B5	Sigma	L2880	Вставки для токсичных
клеточных культур для использования с 24-луночными планшетами	BD Falcon	353095	0,4; m поры
24-луночные планшеты	TrueLine	TR5002	Покрытие коллагеном перед применением
Routine PC12 среда			культивирования клеток Routine N9 среда для клеточной культуры
-            85% RPMI средний			-            90% DMEM-F12 средний
-            10% термоинактивированная конская сыворотка			-            10% термоинактивированная конская сыворотка
-            5% термоинактивированная фетальная бычья сыворотка
PC12 дифференцировочная среда			N9 лечебная среда
-              99% RPMI средний			-            99% DMEM-F12 средний
-              1% термоинактивированная фетальная бычья сыворотка			-            1% термоинактивированная фетальная бычья сыворотка
-              50 нг/мл фактора
PC12 среда
-              99% RPMI средний
-              1% термоинактивированная фетальная бычья сыворотка