У многоклеточных организмов секретируемые растворимые факторы вызывают реакцию различных типов клеток в результате паракринной сигнализации. Системы ко-культивирования вкладышей предлагают простой способ оценки изменений, опосредованных секретируемыми растворимыми факторами в отсутствие межклеточного контакта.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Разработка Вставка совместного культивирования системы двух клеточных типов в отсутствие межклеточных контактов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Роль секретируемых растворимых факторов в модификации клеточных реакций является постоянной темой при изучении всех тканей и систем. В попытке прояснить очень сложные отношения между несколькими клеточными подтипами, составляющими многоклеточные организмы, были разработаны методы in vitro, чтобы помочь исследователям получить детальное представление об одноклеточных популяциях. В одном из таких методов используются вставки с проницаемой мембраной, позволяющей диффундировать секретируемым растворимым факторам. Таким образом, популяция клеток, выращенных во вкладышах, может быть совместно культивирована в лунке или чашке, содержащей другой тип клеток, для оценки клеточных изменений после паракринной передачи сигналов в отсутствие межклеточного контакта. Такие вставные системы ко-культивирования обладают различными преимуществами по сравнению с другими методами ко-культивирования, а именно двунаправленной сигнализацией, консервативной клеточной полярностью и популяционно-специфичным обнаружением клеточных изменений. В дополнение к использованию в области воспаления, рака, ангиогенеза и дифференцировки, эти системы совместного культивирования имеют первостепенное значение для изучения сложных взаимоотношений, существующих между различными клеточными подтипами, присутствующими в центральной нервной системе, особенно в контексте нейровоспаления. В данной статье предлагаются общие методические указания по постановке эксперимента по оценке клеточных изменений, опосредованных секретируемыми растворимыми факторами, с использованием системы совместного культивирования со вставкой. Кроме того, будет подробно описан специальный протокол для измерения нейровоспалительных эффектов цитокинов, секретируемых липополисахарид-активируемой N9-микроглией на нейрональные клетки PC12, что дает конкретное понимание методологии совместного культивирования вставок.
Введение
Изучение тканей, органов или систем в пробирке является попыткой упростить очень сложные отношения , существующие между несколькими сотовыми подтипов , которые включают многоклеточные организмы. Действительно, в пробирке исследования позволяют получить детальное представление о популяции отдельных клеток. Есть два основных преимущества проведения в лабораторных экспериментах: 1) уменьшение клеточных взаимодействий, и 2) способность легко манипулировать клеточной среде. Таким образом, эти два преимущества позволили ученым предсказать поведение конкретных типов клеток в живом организме , что приводит к способности регулировать резуль....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Примечание: В каждом из следующих шагов должны быть выполнены в стерильных условиях в вытяжном шкафу с ламинарным потоком воздуха, как требуется для культуры клеток млекопитающих. Кроме того, общие принципы для оптимального выращивания стерильной клетки применяются, например., Отбрасывая Подсказок в любое время они могут привести к перекрестному загрязнению, уменьшая количество времени клетки подвергаются воздействию воздуха при выполнении целые смены носителя, должным образом, но аккуратно помешивая все клеточные суспензии, чтобы обеспечить их гомогенное пипетирования и т.д. Кроме того, вставки являются своего рода, которые требуют Пластик специальной обраб....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Использование вставных систем совместного культивирования особенно актуально при изучении нейровоспалительных процессов, которые наглядно демонстрируют паракринной взаимосвязи между различными сотовыми игроками центральной нервной системы. Иммунитет в ЦНС осуществляется преимущественно резидентных клеток , называемых микроглии , которые контролируют окружающую их среду в их покоя разветвленная положении (фигура 2А) и способны к зондированию возмущений , которые могли бы .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Самым важным шагом любой системы эксперимента вставка сокультуры на самом деле живет в выборе правильной вставки для использования. Размер пор и материал мембраны должен быть принят во внимание тщательной, не забывая учитывать тип клеток, которые будут посеяны и цель эксперимента. Например, хемотоксических анализы могут использовать один и тот же тип мембраны, чем клеточные сокультурах для анализа модуляций поведение клеток, индуцированные секретируемых растворимых факторов, в отсутствии межклеточного контакта. Тем не м.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была профинансирована грантом MGM от Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC) Канады. JR является стипендиатом NSERC-Vanier.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640 средний | Sigma | R8755 | Теплый в 37 градусов C водяной бани перед применением |
| Dulbecco' s Модифицированный Eagle' s Смесь сред/питательных веществ F-12 Ветчина | Sigma | D6421 | Теплый в 37 градусов; C водяной бани перед использованием, необходимо дополнить 0,365 г/л L-глутамина |
| Лошадиная сыворотка | ATCC | 30-2040 | Согреть в 37 °°; C водяной баней перед применением |
| Фетальная бычья сыворотка | MultiCell | 80350 | Warm in 37° С водяной баной перед применением |
| Фактор роста нервов-7S из мышиной подчелюстной железы | Sigma | N0513 | Восстановите лиофилизированный порошок в растворе буферного физиологического раствора или питательной среде для тканей, содержащей 0,1°ндаш; 1,0% бычий сывороточный альбумин или 1-10% сывороточный |
| раствор Трипсин-ЭДТА | Sigma | T3924 | Теплый в 37° C водяной баней перед применением |
| Липополисахариды из Escherichia coli 055:B5 | Sigma | L2880 | Вставки для токсичных |
| клеточных культур для использования с 24-луночными планшетами | BD Falcon | 353095 | 0,4; m поры |
| 24-луночные планшеты | TrueLine | TR5002 | Покрытие коллагеном перед применением |
| Routine PC12 среда | культивирования клеток Routine N9 среда для клеточной культуры | ||
| - 85% RPMI средний | - 90% DMEM-F12 средний | ||
| - 10% термоинактивированная конская сыворотка | - 10% термоинактивированная конская сыворотка | ||
| - 5% термоинактивированная фетальная бычья сыворотка | |||
| PC12 дифференцировочная среда | N9 лечебная среда | ||
| - 99% RPMI средний | - 99% DMEM-F12 средний | ||
| - 1% термоинактивированная фетальная бычья сыворотка | - 1% термоинактивированная фетальная бычья сыворотка | ||
| - 50 нг/мл фактора | |||
| PC12 среда | |||
| - 99% RPMI средний | |||
| - 1% термоинактивированная фетальная бычья сыворотка |
Ссылки
- Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172 (4384), 869-870 (1953).
- Hoffman, R. A. Intraepithelial lymphocytes coinduce nitric oxide synthase in....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
