Флуоресценция Активированный сортировки клеток (FACS) и экспрессии генов Анализ Fos-экспрессирующих Нейроны из свежих и замороженных крыс ткани головного мозга

Краткое содержание

Здесь мы приводим протокол Флуоресценция Активированный сортировки клеток (FACS) для изучения молекулярных изменений в Фос-экспрессирующих нейронные ансамбли из свежих и замороженных тканей мозга. Использование замороженной ткани позволяет FACS изоляцию многих областей мозга более нескольких сеансов, чтобы максимально использовать ценные предметы животного происхождения.

Аннотация

Изучение нейропластики и молекулярных изменений в изученных поведения переходит из исследования целых регионов мозга к изучению конкретных наборов единично активированных нейронов, называемых нейронных ансамблей, которые опосредуют ученые ассоциации. Флуоресценция Активированный сортировки клеток (FACS) недавно была оптимизирована для ткани взрослого мозга крысы и позволил выделение активированных нейронов с использованием антител против нейронального маркера NeuN и белка Fos, маркер сильно активированных нейронов. До сих пор, Фос-экспрессирующие нейроны и другие типы клеток были выделены из свежей ткани, что повлекло за собой долгие дни обработки и позволили очень ограниченное количество образцов мозга, которые будут оценены после длительных и сложных поведенческих процедур. Здесь мы обнаружили , что выходы Fos-экспрессирующих нейронов и мРНК Fos из спинного стриатума были похожи между свеже рассеченной ткани и ткани замораживали при -80 ° С в течение 3 - 21 дней. Кроме того, мы подтвердили фенотипиз NeuN-положительных , так и к NeuN-отрицательных отсортированных клеток путем оценки экспрессии гена нейрональной (NeuN), астроцитов (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) и microgial (Iba1) маркеров, что свидетельствует о том , что замороженные ткани также могут быть использованы для FACS изоляции глиальные типов клеток. В целом, можно собирать, анализировать и замораживать ткани мозга для нескольких сеансов FACS. Это увеличивает объем данных, полученных от ценных предметов животного происхождения, которые часто подверглись длинные и сложные поведенческие процедуры.

Введение

Во время обучения, животные образуют ассоциации между комплексными наборами весьма специфических стимулов. Эта информация с высокой разрешающей способностью, как полагают, кодируемый изменениями в конкретных моделей единично нейронов, называемых нейронными ансамблями. Нейронные ансамбли недавно были идентифицированы с помощью индукции немедленно ранних генов (IEGs) , таких как Fos, дуга, и Zif268 и их белковых продуктов в нейронах , которые были сильно активируются во время поведения или воздействия метки. Fos-экспрессирующих нейронов , в частности , было показано, играют роль в причинно - следственные связи и кием по конкретным извлеченные модели поведения ^1-4. Таким образом, уникальные молекулярные neuroadaptations в этих активированных Fos-экспрессирующих нейронов являются главными кандидатами для нейронных механизмов , которые кодируют узнали ассоциации , сформированные в процессе обучения и нормальных ненормальным обучения расстройств, таких как наркомания и посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР) ^5.

FluoreScence Активированный сортировки клеток (FACS) недавно позволил анализ уникальных молекулярных neuroadaptations в пределах Fos-экспрессирующих нейронов. Проточная цитометрия и сортировка клеток были разработаны в 1960 - е годы ^6,7 охарактеризовать и выделения клеток в соответствии с их светорассеивающих и иммунофлуоресцентных характеристиками, и уже давно используются в области иммунологии и исследования рака. Однако проточной цитометрии и FACS требует диссоциированных отдельных клеток, которые трудно получить из ткани мозга взрослого. FACS впервые был использован для выделения и анализа зеленого флуоресцентного белка (GFP) -expressing нейронов стриатума от трансгенных мышей , которые не требуют маркировки антител ^8,9. Мы разработали антитела на основе метода FACS ¹⁰ для выделения и оценки молекулярных изменений в Фос-экспрессирующих нейронов , активированные лекарственного средства и / или репликами у диких животных типа ^11-15. В этом методе, нейроны помечены антителом против общего нейронального маркера NeuN, в то время как сильно активируются нейронымаркированы с антителом против FOS. Хотя наш первоначальный метод требовал объединения до 10 крыс на образец для свежей ткани, последующие модификации протокола позволил FACS изоляцию Фос-выражающей нейронов и количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР) анализа дискретных областей мозга от одной крысы ^13-15 , В целом, уникальные молекулярные изменения были найдены в Фос-экспрессирующие нейроны активируются во время различных контекстно- и биток активированные поведения в наркомании исследований ^12,14,15.

Одна из основных проблем с материально-технического выполнения FACS на свежей ткани является то, что она занимает целый день, чтобы отделить ткани и процесс путем FACS. Кроме того, лишь около четырех образцов могут быть обработаны в день. Как правило, это означает, что только одна область мозга может быть оценена из каждого мозга, а остальные участки мозга должны быть отброшены. Это является серьезной проблемой для низкой пропускной способности поведенческих процедур, таких как самостоятельного введения и исчезновения Traiнин, что требует хирургического вмешательства и много недель интенсивных тренировок. Кроме того, длинные и сложные поведенческие процедуры на день тестирования затрудняет выполнение FACS в тот же день. Было бы существенным преимуществом, чтобы иметь возможность заморозить мозг у животных сразу же после тестирования поведения, а затем изолировать Фос-экспрессирующие нейроны от одной или нескольких областях головного мозга в разное время по своему выбору следователей.

Здесь показано, что наш протокол FACS могут быть использованы для выделения Фос-экспрессирующие нейроны (и другие типы клеток) из свежих и замороженных тканей мозга. В качестве примера, мы выделили Fos-экспрессирующих нейронов крысы из стриатума после острого метамфетамина инъекций и от наивных крыс без инъекций (контрольной группы). Тем не менее, этот протокол FACS может быть использован после любого поведенческого или фармакологического лечения. Дальнейший анализ КПЦР наших образцов показали, что экспрессия гена из этих типов клеток могут быть оценены с СимиЭффективность лар из свежих и замороженных тканей.

Протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с по уходу и использованию комитета Institutional животных (IACUC) из Национальных институтов здравоохранения Руководство по уходу и использованию лабораторных животных ^16.

Примечание: Все шаги ниже Применение трубок низких связывающих центрифуг, которые держали на льду, если не указано иное.

1. Подготовка к ткани коллекции

1. Установите центрифугу до 4 ^о С.
2. Огонь польский набор из трех стекла пипетки Пастера с убывающими диаметром приблизительно 1,3, 0,8 и 0,4 мм для каждого образца.
3. Готовят меченые 1,7 мл пробирки, содержащие-1 мл холодного буфера А и держать пробирки на лед.
4. Подготовьте лоток льда, содержащий мозг нарезки матрицы, шпатели и стеклянные пластины (или перевернутую стеклянную чашку Петри), на котором для выполнения рассечение. Предварительно холодок два или более бритвенных лезвий на стеклянные пластины и ткани используют бумагу, чтобы высушить все инструменты, которые касаются твопрос.
5. Растаяйте ферментного раствора при комнатной температуре (КТ) в течение 30 мин до сбора ткани.

2. Сбор и тканей Вскрытие

1. Инициировать поведенческий или медикаментозного лечения 90 мин до сбора ткани.
   Примечание: Для получения результатов, показанных здесь, острые внутрибрюшинное введение 5 мг / кг метамфетамина на крыс в новой среде (тест состояния), и наивные крыс, содержащихся в их клетках (контрольное условие) были выполнены.
2. Обезболить крысы, поместив его в стеклянную банку с эксикаторным насыщенным изофлуран и обезглавить крысу 30 - 60 сек позже с помощью гильотины.
   Используйте ножницы, чтобы удалить кожу и мышцы от головы и подвергать черепа. Используйте кусачек, чтобы разрезать череп и открыть затылочного отверстия и снимите заднюю часть черепа. Используйте кусачек, чтобы разрезать вдоль верхнего края черепа подвергать мозг. Будьте осторожны, чтобы не повредить мозг. Используйте маленькую лопаточку, чтобы мягко выкопать подd поднять мозг. Поднимите мозг и перерезать нервы , пока мозг не освободится ^17.
3. Рассеките тканей с помощью лезвия бритвы.
   Примечание: Получение образцов ткани, используя один из следующих способов: (2.3.1) свеже рассеченной ткани; (2.3.2) замороженной ткани после рассечения; или (2.3.3) замороженной ткани рассекают из замороженных всего мозга. Держите матрицу мозга нарезка, бритвенные лезвия и стеклянная пластина сухой по всей рассечение и мясорубки процессы как сгущенное воды может привести к гипотоническому лизису клеток. Используйте увеличительные стекла для обеспечения точного рассечение.
   1. Для свеже рассеченной ткани, поместите Свежеотжатый мозг в матрицу мозга нарезка (в головном мозге крысы-образной металлической формы с пазами для бритвенных лезвий с интервалом в 1 мм), который был охлажденным на льду. Вставьте два или более предварительно охлажденные лезвия, в пазы, чтобы вырезать корональные срезы, которые содержат область мозга (ы) интересов. Поместите отрезанный кусочек на охлажденную стеклянную пластину.
      Примечание: Рассеките Regio мозганс процентов по охлажденный стеклянной пластине.
   2. Для замороженных тканей после рассечения, рассекают область мозга (ы) интереса из кусочков Свежеотжатый мозга, аналогично тому, как описано выше в разделе 2.3.1. Поместите расчлененный ткани в микропробирок и быстро замораживать ткани, погружая микропробирок в -40 ºC изопентана в течение 20 сек. Держите расчлененный ткани замороженные во все времена в -80 ºC морозильнике до дальнейшей обработки.
   3. Для замороженной ткани, немедленно заморозить Свежеотжатый мозг в -40 ºC изопентана и хранить в закрытой упаковке при температуре -80 ° С до 6 месяцев.
      1. В день диссекции, поместите замороженный мозг в криостат установлен на уровне около -20 ° С (не теплее, чем -18 ° C) в течение приблизительно 2 ч, чтобы уравновесить температуру.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Мозги можно легко разрезать при этой температуре, в то время как более низкие температуры делают мозг слишком хрупким, чтобы быть разрезан безопасно.
      2. Используйте лезвия бритвы вырезать 1 - 2 мм корональных ломтикизамороженные мозги в криостат. Используйте притупляются от 12 до 16 калибра иглы, чтобы получить пунши ткани из этих срезов в условиях замораживания. Хранить расчлененный ткани замораживали в любое время до тех пор дальнейшей обработки.
4. Добавьте 1 - 2 капли буфера А, чтобы покрыть расчлененный ткани, прежде чем мясорубки. Удалить большую часть белого вещества из ткани с использованием двух бритвенных лезвий, чтобы предотвратить потерю нейронов в течение остальной части процесса растиранием. Если, начиная с замороженной ткани, а затем позволить ткани оттаивать на стеклянной пластине холодной в течение не более 1 мин перед применением буфера для раствора.
5. Фарш ткани 100 раз в каждом ортогональном направлении с бритвенным лезвием на охлажденный стеклянную пластину. Держа лезвие бритвы по вертикали на стеклянной пластине при измельчении.
   Примечание: Тщательное мясорубки имеет решающее значение для всех этапов протокола.
6. Используйте лезвия бритвы для передачи измельченной ткани в микроцентрифужных пробирки, содержащие 1 мл холодного буфера А. Переверните пробирку 3 - 5 раз К.Э.ер все измельченной ткани в растворе.

3. Cell диссоциация

Примечание: Используйте нежный конец над концом смешивания для всех следующих шагов. Не используйте вихревой смеситель и избежать воздушных пузырей, которые вызывают повреждение клеток.

1. Центрифуга пробирки с образцами при 110 х г в течение 2 мин при 4 ° С. Удалите супернатант. Медленно добавляют 1 мл холодной свежей талой ферментного раствора (содержащего смесь протеолитических ферментов) вниз по внутренней стенке микропробирок. Сразу высосать весь осадок и осторожно пипеткой вверх и вниз только 4 раза с умеренно большого диаметра наконечника пипетки, чтобы разогнать фарша лепешку ткани.
2. Обратить микропробирки немедленно , чтобы предотвратить осадок от прилипания к нижней и инкубировать образцов с конца над уровнем конца перемешивания в течение 30 мин при температуре 4 ^о С.
3. После расщепления ферментативный ткани, центрифуга пробирки при 960 х г в течение 2 мин при 4 ° С. Удалить супернатант и добавить 0,6 мл холодного буфера А. Immediatelу после добавления буфера А, используют один и тот же наконечник пипетки, чтобы рассеять осадок путем подлизываться весь осадок и осторожно пипеткой вверх и вниз 5 раз.
4. Механически растирают переваренной ткани и собирают в 15 мл пробирки, используя следующие шаги. Для каждого образца используйте отдельный набор из 3 пожарно-полированного стекла Пастера пипеток с нисходящим диаметром приблизительно 1,3, 0,8 и 0,4 мм, прикрепленных к латексных луковиц.
   1. Аккуратно растирать каждый образец в 10 раз со стеклянной пипеткой 1,3 мм. Пусть образец оседать в течение 2 мин на льду (мусора и недиссоциированных клетки будут оседать на дно). Соберите супернатант (~ 0,6 мл) и трансфер в 15 мл коническую трубку (трубка # 1).
   2. Добавить 0,6 мл буферного раствора Раствор к оставшемуся осадку. Растирают образца 10 раз со стеклянной пипеткой 0,8 мм. Пусть образец оседать в течение 2 мин на льду. Соберите супернатант (~ 0,6 мл) и трансфер в те же 15 мл коническую трубку # 1.
   3. Добавить 0,6 мл буферного раствора Раствор для оставшейся Pelleт. Растирают образца 10 раз со стеклянной пипеткой 0,4 мм. Пусть образец оседать в течение 2 мин на льду. Соберите супернатант (~ 0,6 мл, не касаясь гранул с не-диссоциированных клеток) и передать те же 15 коническую трубку # 1 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите пипетку диаметром 0,4 мм в трубке № 1 для следующих шагов тритурационного.
   4. Повторите шаг 3.4.3 еще три раза с использованием наименьшего стеклянной пипетки (~ 0,4 мм в диаметре) и собирают супернатант в отдельную 15 мл коническую трубку (трубка # 2).
   5. Растирают собранные клеточные суспензии в пробирки # 1 и # 2 в течение более 10 раз с использованием 0,4 мм стеклянной пипетки и держать на льду.

4. Cell Фиксирование и пермеабилизирующего

1. Подготовьте 4 микропробирки на образец (две микропробирки для клеток из трубы № 1 и два для клеток из трубы № 2) путем добавления 800 мкл 100% -ного холодного этанола (хранили при -20 ^° С перед использованием) в каждую пробирку и держать их на льду , Примечание: Конечный этанолконцентрация будет составлять 50%.
2. Пипетка ~ 800 мкл суспензии клеток (из пробирки # 1 и # 2 трубки) в каждую из 4-х пробирки, содержащие холодным этанолом и инвертировать трубы, чтобы смешивать образцы.
3. Инкубируйте пробирки на льду в течение 15 мин, переворачивая пробирки каждые 5 мин.
4. После фиксации / пермеабилизации, центрифугировать пробирки при 1,700 мкг в течение 4 мин при 4 ° С и отбросить супернатант. Оставьте 50 мкл раствора, чтобы предотвратить потерю клеток.
   Примечание: Гранулы на данном этапе являются белыми и пряника меньше к стенке трубок, чем раньше пермеабилизации. Поэтому удалите супернатант осторожно прикасаясь к стенке микропробирок, где нет гранул и составлять супернатант медленно с помощью микропипетки.

5. Сотовый фильтрация

1. Повторное приостановить гранул из стадии 4.4 с холодным PBS следующим образом:
   1. Добавить 550 мкл холодного PBS к одной из двух микропробирок поступающих из трубки # 1, и используют умеренно большого диаметра пиPette наконечник осторожно пипеткой клеточной суспензии вверх и вниз 5 раз. Повторите то же самое для одного микропробирки исходя из трубы № 2.
   2. Для получения клеток из пробирки # 1, с использованием той же пипетки перенос первой суспензии клеток на второй таблеткой. Ресуспендируют вторую таблетку, осторожно пипеткой объединенную клеточную суспензию вверх и вниз 5 раз.
   3. Для получения клеток из пробирки # 2, ресуспендируют и объединить гранул (то есть, третий и четвертый микропробирок) , как описано в 5.1.2.
2. Фильтр двух клеточных суспензий со стадий 5.1.2 и 5.1.3 отдельно с использованием двух различных пар сотовых сетчатых (100 мкм и размером пор 40 мкм) следующим образом:
   1. Предварительное смачивание каждый сетчатый фильтр клеток путем добавления PBS к внутренней стороне сетчатого фильтра. С помощью пипетки, чтобы удалить избыток PBS с внешней стороны сетчатого фильтра.
   2. Пипетировать клеточной суспензии со стадии 5.1.2 равномерно на первый сетчатый фильтр ячейки с 100 мкм размером пор. Соберите проточный в 50 мл пробирку на льду. Используйте пиPette собрать проточных прикрепленный на внешней стороне нижней части ячейки фильтра.
   3. Используйте тот же пипетки для передачи Проточный из ячейки фильтра 100 мкм до 40 ячейки фильтра мкм. Собрать этот проточный в другой 50 мл пробирку на льду. При передаче потока через из мкм ячейки фильтра 40, перейти к новым наконечниками пипеток, чтобы избежать загрязнения от мкм ячейки фильтра 100.
   4. Повторите эти действия для клеточной суспензии со стадии 5.1.3, используя новый набор фильтров.
3. Объединение двух проточных из каждого образца для конечного объема приблизительно 1 мл на образце.

6. Инкубация с антителами

Примечание: Используйте маленькие аликвоты клеток мозга суспензий подготовить несколько контрольных образцов для установки соответствующего потока цитометра настройки перед запуском основного образца. Для каждой маркировки антител, готовят контрольные образцы, которые не включают антитела, только РЭcondary антитела (или другие метки флуоресцентный), а затем обе первичные и вторичные антитела (или другие флуоресцентные метки). Используйте эти элементы управления, чтобы установить ворота, отделяющие специфические по сравнению с неспецифической маркировки в цитометр потока. Когда это возможно, использовать флуорохромии, которые не требуют компенсации. Увеличение конечного объема контрольных образцов стробирования до конечного объема 700 мкл добавлением PBS перед добавлением первичных антител.

1. Подготовить светорассеивающих и контрольного образца DAPI путем переноса 100 мкл пробы отфильтрованных клеток в 1,7 мл микропробирок. Добавить 600 мкл холодного PBS с 1 мкг / мл DAPI для ядер окрашивания. Инкубировать в течение 10 мин с конца над уровнем конца перемешивания, и промывка (как указано в пунктах 6.4.2 до 6.4.5) перед прохождением через проточный цитометр.
   Примечание: В этом примере используется только для установки клеток / ядер ворот до сортировки оставшихся клеток в машине FACS.
2. Подготовка единичных образцов immunolabeled управления путем передачи 100 & #181; л отфильтрованных клеток в 1,7 мл микропробирки. Добавьте 600 мкл PBS с холодной одного антитела (например, антитела к NeuN). Добавьте 600 мкл холодного PBS в микропробирки с другим антителом (например, Фос антитело). Добавьте соответствующее вторичное антитело, если оно не является прямым конъюгированные с первичным антителом.
   Примечание: Эти образцы используются для определения напряжения соответствующих фотоэлектронный умножитель (ФЭУ), а также для оценки перекрытия двух флуоресцентных сигналов, если это необходимо. Концентрация антител следует титровать для достижения наилучшего соотношения сигнал-шум во всех каналах. Перекрытие флуоресцентные сигналы также могут быть компенсированы с помощью внутренней калибровки различных флуоресцентных каналов в проточном цитометре.
3. Приготовьте двойную флуоресцентного меченных отрицательного контрольного образца путем переноса 100 мкл отфильтрованных клеток в 1,7 мл микропробирки. Добавьте 600 мкл холодного PBS с одним только вторичными антителами или IgG с прямым конъюгированных с первичными антителами.
   Примечание: ТхиКонтрольный образец s можно использовать каждый раз, когда до сортировки для определения фоновой флуоресценции для каждого флуорофора.
4. Подготовьте основной образец для сортировки.
   1. Передача 700 мкл отфильтрованных клеток в 1,7 мл микропробирок. Добавить 7 мкл (1: 100) первичного антитела, конъюгированного Fos непосредственно к Alexa Fluor 647 (анти-Фос-AF647) и 1,4 мкл (1: 500) первичного антитела, конъюгированного NeuN непосредственно к фикоэритрин (анти-NeuN-PE). Инкубируйте пробирки в течение 30 мин при 4 ° С с конца над уровнем конца перемешивания.
   2. В конце инкубации, добавьте 800 мкл холодного PBS в каждую микропробирок, в том числе основной выборки и контрольных образцов, и перемешать с помощью инверсии.
   3. Центрифуга Микропробирки при 1300 мкг в течение 3 мин при 4 ° С. Жидкость над осадком сливают, оставляя 50 мкл надосадочной жидкости, чтобы предотвратить потерю клеток.
   4. Добавьте 1 мл холодного PBS к осадку и ресуспендирования клеток с помощью пипетки с умеренно большого диаметра наконечника.
   5. Центрифуга при 1300 х г в течение 3 мин при 4 ° С. Discard супернатант.
   6. Повторное приостановить осадок в 500 мкл холодного PBS (отрегулировать конечный объем в зависимости размер гранул).
   7. Передача и Суспензию фильтруют в круглодонную дно пробирки FACS с крышкой ячейки фильтра (40 мкм). Держите immunolabeled клетки на льду и сразу же выполнить FACS. Примечание: Для фильтрации, нажмите кончиком пипетки вертикально на сетчатого колпачка и нажмите клеточной суспензии через него.
5. Установить проточный цитометр ворот с использованием контрольных образцов.
   1. С помощью рассеивающего свет и контрольного образца DAPI для идентификации нейронную популяцию клеток от общего количества событий и клеточного мусора.
      Примечание: Клеточные тела в этом препарате только 1 - 2% от общего числа событий (остальные мусор и сломанные клеточные процессы). На основе DAPI флуоресцентного сигнала (с указанием ядер) и рассеяния вперед (размер ячейки) можно обнаружить клеточные тела и ворота в обратном направлении на основе вперед и из стороны свойства рассеяния светаклетки (как показано на рисунке 1 , A, B).
   2. Используйте отдельные образцы immunolabeled управления для определения параметров PMT напряжения, а также проанализировать перетекания излучения от одного конкретного флуорохромом в другой фильтр / канал (например, Alexa Fluor 488 / FITC или фикоэритрин). Если флуоресцентные сигналы перекрывают друг друга, устранить дублирование путем регулировки уровней компенсации вручную.
   3. Используйте двойную флуоресцентного меченных отрицательный контроль, чтобы установить порог для положительного населения.
      Примечание: сигнал, поступающий из этого образца, как полагают, из-за автофлуоресценции и клетки основного образца, расположенного выше этого порога можно рассматривать как положительный. Как правило, пороговые параметры для сортировки являются более жесткими, и примерно в верхней 2/3 меченых клеток выше отрицательного контроля фактически сортируются.
6. Сортировать нейроны от основного образца FACS в 1,7 мл микропробирок. Собирают клетки в 50 мкл РНКИзвлечение буфера. После сортировки, вихревое и отцентрифугировать пробирку и перемешать подвеску с помощью пипетки вверх и вниз 10 раз, чтобы восстановить все отсортированные клетки от стенок трубы.
7. Выдержите отсортированный клеточной суспензии при 42 ° С в течение 30 мин, чтобы гарантировать, что все клетки лизируют до экстракции РНК, а затем центрифуге при 2800 х г в течение 2 мин при 4 ° С.
8. Передача супернатант к РНКазы свободной трубки для длительного хранения при температуре -80 ° С или сразу же обработать образец для выделения РНК, синтез кДНК гена - мишени, предварительной амплификации и кПЦР, как описано выше ^13-15.

Результаты

Сортировка Fos-позитивных и Фос-отрицательные нейроны от свежих и замороженных спинной стриатуме ткани от отдельных крыс после острых метамфетамина инъекций.

Протокол, описанный выше, был использован для сортировки Фос-положительные, так и отрицательные Фос-нейроны от одиночной крысы спинной стриатуме через 90 мин после внутрибрюшинного введения метамфетамина (5 мг / кг). Наивные крыс в их клетки использовали в качестве контро...

Обсуждение

FACS могут быть использованы для сортировки нейроны и другие типы клеток из свежей или замороженной ткани мозга взрослого человека. Как уже упоминалось во введении, возможность использования замороженной ткани позволяет оптимальное использование образцов от животных, которые подверглись сложные и затяжные поведенческие процедуры, такие как самоуправления и рецидивами исследований в области исследований наркомании. Эти поведенческие процедуры , как правило , занимает 1 - 2 ч или дольше, и требовать от всех животных (10 -...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Матрица мозга	CellPoint Scientific	69-2160-1	для получения корональных срезов мозга
Hibernate A Низкая флуоресценция	Brain Bits	HA-lf	Buffer A в протоколе используется для обработки тканей и клеток от диссоциации до этапов фиксации
Accutase	Millipore	SCR005	Раствор фермента в протоколе используется для ферментативного переваривания ткани перед растиранием
Protein LoBind Tube 1,5 мл, ПЦР чистый	Eppendorf	22431081	для предотвращения потери клеток во время протокола
Cell Strainer, 40 & микро; m	BD Falcon	352340	для фильтрации ячеек суспензионный
сетчатый фильтр, 100 & микро; m	BD Falcon	352360	для фильтрации клеточной суспензии
Falcon 5 мл круглодонная полистирольная пробирка с защелкивающимся колпачком для клеток	BD Bioscience	352235	для фильтрации клеточной суспензии перед прохождением через проточный цитометр
Пастер Пипет, Стекло	NIH поставка	6640-00-782-6008	для проведения растирания тканей
Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Клон A60 (мышиный моноклональный) антитело	EMD Миллипор	FCMAB317PE	антитела для обнаружения нейронов
Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate)	Технология клеточной сигнализации	8677	антитело для обнаружения Fos-экспрессирующих клеток
DAPI	Sigma	D8417	для мечения ядер
PicoPure RNA Isolation Kit	Applied Biosystems.	KIT0204	В комплект входит буфер для экстракции РНК для шага 6.14. Он используется для сбора отсортированных клеток
Superscript III первой нити системы синтеза кДНК	Invitrogen	18080-051	для синтеза кДНК из РНК
TaqMan PreAmp Master Mix	Applied Biosystems.	4391128	сделать таргетную преамплификацию из кДНК
TaqMan Advance Fast Master	Прикладные биосистемы.	4444963	сделать ПЦР с помощью зондов TaqMan
Fos TaqMan зонда	Applied Biosystems.	Rn00487426_g1	TaqMan probe/primers
NeuN TaqMan probe	Applied Biosystems.	CACTCCAACAGGGAC	для маркера генов нейронов
NeuN Forward primer	Applied Biosystems.	GGCCCCTGGCAGAAAGTAG	нуклеотидная последовательность для маркера нейронального гена
NeuN Обратный праймер	Applied Biosystems.	TTCCCCCTGGTCCTTCTGA	для маркера нейронального гена
Gfap TaqMan probe	Applied Biosystems.	Rn00566603_m1	Зонд/праймеры TaqMan для маркера гена astrocityc
iba-1 Зонд TaqMan	Applied Biosystems.	Rn00574125_g1	Зонд/праймеры TaqMan для маркера гена microglya
Gapdh зонд TaqMan	Applied Biosystems.	CTCATGACCACAGTCCA	для референсного гена
Gapdh Forward primer	Applied Biosystems.	Нуклеотидная последовательность	GACAACTTTGGCATCGTGGAA
генаGapdh Обратный праймер	Applied Biosystems.	CACAGTCTCTGAGTGGCAGTGA	для референсного/домашнего гена
Oligo2 зонда TaqMan	Applied Biosystems.	Rn01767116_m1	Зонд/праймеры TaqMan для маркера олигодендроцитарного гена
Пипетка P1000	Rainin	17014382	Она обозначается как пипетка с большим диаметром наконечника на этапах 3.1 и 3.3 для мягкого растирания тканей и на шаге 6.7 для ресуспензии клеток
7500 Fast Real-time PCR system Applied	Biosystems.	446985	для количественной ПЦР
FACSAria I Cell Sorter	BD Biosciences		для сортировки FACS