Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Надежность и высокая эффективность Извлечение почки иммунных клеток

10.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54368

⸱

19 августа 2016 г.

 ,  ,  , 
1Division of Nephrology, Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital, 2Division of Biomedical Sciences, Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital, 3Division of Endocrinology, Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Методы, которые являются надежными и эффективными для выделения иммунных клеток почек, необходимы для последующих применений. Для этого требуется поверхностное мечение антителами небольшого количества иммунных клеток почек. В данной работе мы описываем краткий метод выделения иммунных клеток почек, который, по-видимому, позволяет достичь этой цели.

Аннотация

Активация иммунной системы происходит при множественных заболеваниях почек и патофизиологических процессах. Иммунная система состоит как из адаптивных, так и из врожденных компонентов и нескольких типов клеток. Иногда интересующий тип клеток присутствует в очень небольшом количестве среди большого числа всех клеток, выделенных из почки. Следовательно, надежная и эффективная изоляция популяций мононуклеарных клеток почек важна для изучения иммунологических проблем, связанных с заболеваниями почек. Традиционно, выделение мононуклеарных клеток почек в тканях осуществлялось с помощью ферментативного расщепления с использованием различных сортов и концентрации коллагеназ/ДНКАЗ, что давало различное количество жизнеспособных иммунных клеток. В последнее время, с разработкой механических разрушителей тканей для выделения одиночных клеток, стадия расщепления коллагеназы была исключена и заменена простым механическим разрушением почек после извлечения из мыши. В данной работе мы демонстрируем простой, но эффективный метод выделения мононуклеарных клеток почек для ежедневной экстракции иммунных клеток. Далее мы демонстрируем пример анализа подмножеств иммунных клеток в почках. Важно отметить, что этот метод может быть адаптирован к другим мягким и неволокнистым тканям, таким как печень и мозг.

Введение

Иммунной активации системы происходит в нескольких заболеваниях почек и патофизиологических процессов 6,10,11,13. Потенциальные области активного исследования охватывают различные триггеры для активации иммунной системы, различные типы клеток участвуют, шаблон цитокина / хемокина в конкретных условиях заболевания, модуляция всех вышеуказанных процессов, с помощью конкретного препарата и т.д. В качестве примера, в ишемии травмы (модель для острого повреждения почек), происходит увеличение в иммунных клеток или костного мозга происходит кроветворные клетки или CD45 + клетки в течение нескольких часов, которое поддерживается через период ремонта или фиброза (6 недель спустя) 5, 12. Эти иммунные клетки секретируют как провоспалительные и противовоспалительные цитокины и хемокины , чтобы организовать процесс ремонта 5,12. В настоящее время возможность использования нескольких флуорофоров одновременно для обозначения популяции клеток в суспензии отдельных клеток увеличилось с объявлениемотдушина современной проточной цитометрии машин с четырех до пяти лазеров. Это , по существу , добавил к способности различать популяции клеток в зависимости от их функционального состояния 3,7. Например, чтобы точно обозначить макрофаг , как F4 / 80 с низким CD11b высокой Ly6b высокой CD206 низкой, по крайней мере , еще 3 флуорофоры будут необходимы в том же объеме выборки для ворот для живых клеток, CD45 + (лейкоциты) и Ly6G- (нейтрофилы) и это очень возможно с новой Flow цитометры 3. Тем не менее, ниже по течению анализы на секрецию цитокина, пролиферации клеток, цитотоксичность, активацию макрофагов и квантификации числа различных подмножеств лимфоцитов и моноцитов, не только требует хорошего качества (живые клетки, фуфайки), но достаточное количество клеток.

Иммунная система в почках состоит из обоих адаптивных и врожденных компонентов и различные типы клеток 1,7,13. Например, у мышей два ребенокNeys вместе , как сообщается, содержат 2-17% (28,000-266,000) CD45 + клеток иммунной клетки почек общий изолированных (1,4 х 10 6 клеток) и около 5-15% (1,400-4,200) из них являются клетки CD4 + 1 , 5,12. Небольшой процент (5-15%, 70-630) этих клеток CD4 + являются FOXP3 + клеток (рисунок 1) 1. В связи с этим шагом мудрых сокращений в процентах клеток, иногда популяции клеток, представляющих интерес (в данном случае CD45 + CD4 + FoxP3 + клетки) представлена ​​простым ~ 100 клеток. Небольшое количество CD45 + CD4 + FOXP3 + клеток делает необходимым, что большое число полных клеток, выделяют и клетки имеют хорошее качество для последующих исследований, таких как анализы секрецию цитокинов. Кроме того, это может быть необходимо, чтобы объединить почки от 2-3 мышей, так как субпопуляции не представлены в достаточно большом количестве для выполнения количественному анализов. Следовательно, надежной и эффективной изоляции популяций почек мононуклеарных клеток желательно, чтобы шпилькау иммунологический спектр, связанный с заболеваниями почек.

Традиционно для выделения мононуклеарных клеток почек, исследователи использовали различные ферментативные пищеварением , таких как коллагеназы 1A или II , включая ДНКазы 1 1,5,12. Хорошо известно , что коллагеназы имеют ферментативную активность, изменяющуюся с серийными номерами и компанией производства, что делает необходимым титрование для оптимальной концентрации и продолжительности инкубации 4,14,15. Кроме того, вываривание коллагеназы добавляет время для фарша почки на мелкие кусочки, вызывает необходимость инкубации кусочков почек в нагретую (37 ° С) ванны и дополнительное время для инкубации в ЭДТА для остановки реакции. Кроме того, менее стерильность может быть достигнуто в течение нескольких последующих процедур, нуждающихся в клеточной культуре. Что еще более важно, в зависимости от исследователя и всех переменных, участвующих, это приводит к изменчивости в данных и интерпретации между лабораториями. В последнее время, сразвитие механических тканей разрушителями / гомогенизаторов 16, стадия коллагеназы полностью исключается и заменяется простым механическим разрушением почек 2. Здесь мы покажем простой, но эффективный метод выделения почек иммунных клеток для повседневных извлечений иммунных клеток. Важно отметить, что эта методика может быть адаптирована к другим мягкими и не фиброзной ткани , такие как печень и мозг 16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все шаги протокола выполненные были рассмотрены и одобрены в Университете Миссури уходу и использованию животных комитета (ACUC). Для этого протокола, были использованы самцы / 6 мышей C57BL в возрасте 15 недель, хотя теоретически любой грызун в любом возрасте может быть использован для проведения экспериментов. Так, это операция непроявленности, эвтаназии достигается путем обескровливания и двустороннего пневмоторакса.

1. Перфузия Почек

Примечание: Перфузия органов, таких как сердце, печень и почки удаляет кровь, которая может помешать интерпретации данных. Следовательно, если это возможно, мы всегда заливать органы.

  1. Поместите мышь в изофлуран (3 мл / мин) индукции камеры, пока она неподвижна. Затем удалите мышь из камеры, положите ее дорсально на секционном столе и поместите изофлуран конус на носу мыши и нажать изофлуран со скоростью 1,5 мл / мин через регулятор.
  2. Проверьте схождение прижимные RESPONSе с помощью пинцета, чтобы оценить, если животное достигло хирургической плоскости анестезии. Очистите вентральной живота с физиологическим раствором и разрезали живот с помощью ножниц и толкать органы брюшной полости (из операционного поля) на левой стороне мыши.
  3. Собрать кровь из нижней полой вены с 25 калибра иглы фиксированной до 1 см шприца и добавить его в 1,5 мл микроцентрифужных пробирку, содержащую 10 мкл 0,5М ЭДТА.
    Примечание: Сбор крови не является обязательным. Плазма может быть использован для биохимических измерений. Лейкоциты могут быть использованы для проточной цитометрии анализов.
  4. С помощью ножниц, сделать небольшой разрез в правом предсердиях выпускать смесь крови и PBS со следующего шага.
  5. Возьмите 50 мл шприц и залить охлажденным льдом PBS (20-30 см). Затем прикрепить G иглу 21-25 к шприцу, проколоть в левый желудочек в его вершине (удерживая сердце мягко между щипцами) и медленно заливать левый желудочек фосфатно-солевым буфером рН 7,4 (PBS) в течение1-2 мин.
    Примечание: Сердце сразу бледнеет на первые несколько миллилитров перфузией. Обратите внимание на печень для бланширования, так как это указывает на то, что перфузия истощает кровь из печени через венозный возврат через полую вену. Кроме того, убедитесь, что легкие не расширяются во время вливания, так как это указывает на то прокол правого желудочка. Если легкие были расширить, вывести иглу немного назад в левый желудочек и продолжать перфузию. Время, требуемое от первого разреза до эвтаназии достигается менее чем за 2 мин

2. Рассечение Почки

  1. После завершения перфузия, используйте ножницы и пинцет, чтобы рассекать правой почки от своих вложений (кровеносные сосуды, жировые и надпочечники) и акцизы.
  2. Аккуратно удалите капсулу, покрывающую почки путем разрезания и рассечения с пинцетом. Взвесьте почки.
    Примечание: При весе почки не является обязательным. Тем не менее, некоторые экспериментыможет привести к изменению размера / веса, который можно использовать для нормализации выхода клеток на грамм ткани почек.
  3. После взвешивания почки, поместите его в 1 мл RPMI-1640, содержащей 0,5% FBS или проточной цитометрии окрашивания буферного раствора (50 мл коническую трубку с завинчивающейся пробкой) и поместите трубку на льду до дальнейшего использования.
    Примечание: Для простоты описания, мы опишем остальные выделения клеток иммунной системы в проточной цитометрии окрашивания буферного раствора. Кроме того, мы будем описывать изоляцию иммунных клеток из одной почки, хотя обе почки или 1 + 1/3 - й почек могут быть использованы в зависимости от последующих экспериментов ( по желанию). 1/3 Р.Д. почки может быть заморожен для белков экспериментов / РНК и 1/3 Р.Д. могут быть помещены в буфер для иммуногистохимии или трансмиссионной электронной микроскопии.

3. Усреднение Почки

  1. Добавьте 5-80 мл емкость гомогенизацию мешок с идентификационной информацией образца,удалить внутренний сетчатый фильтр (STR) и выбросить его. Заполните мешок с 5 мл охлажденного льдом раствора проточной цитометрии окрашивающего буфера и передать почки в буфер. Повторите этот процесс для второго образца или более образцов, которые нуждаются в обработке.
  2. Сложить сумку пополам гомогенизацию, таким образом, что одна половина имеет почку погруженной в растворе проточной цитометрии Окрашивание буфера, а другая половина просто откидывается над ним.
  3. Включите гомогенизатора ткани и установить его на быстрой (настройка) оборотов в минуту. Поместите сложенный мешок с гомогенизацию почки, обращенную к весло, близко к нижнему краю, но убедитесь, что нижний конец мешков не скольжения ниже нижней границы лопастей.
    1. Процесс второго образца одновременно есть 2 Лопатки. Выберите время, как 120 сек. Соблюдайте весла двигаться вперед и назад, чтобы гомогенизировать почки.
      Примечание: В то же время, этот простой может быть использован для получения более 2 почек (или другой ткани) образцы в то время как первые два обработки.
    2. После завершения с первого набора гомогенизацией, передавать пакеты со льдом и перезагружать гомогенизатора ткани со следующим набором образцов и так далее. Визуально убедитесь, что почки адекватно гомогенизируют и никакие большие куски не видны.
      Примечание: Как правило, 2 мин в тканевом гомогенизаторе при быстром оборотах в минуту достаточен для почек.
    3. Поместите ячейки фильтра 100 мкм в 50 мл коническую трубку на льду. Затем пипеткой гомогената полностью на клеточном сетчатого фильтра. Установить пол центрифуге при 50 мкг в течение 1 мин при температуре 4 ° С и загружают образцы в центрифугу.
      Примечание: Центрифугирование будет гарантировать, что все гомогената (содержащих клетки), прошедшего через клеточный фильтр.
    4. Удалить труб из центрифуги и поместите их обратно на лед. Откажитесь от сетчатые клетки и держать гомогената. Добавить равный объем (~ 6 мл) 1x буфера для лизиса эритроцитов к осадку клеток / супернатанта и пипетки вверх и вниз несколько раз, чтобы получить однородную суспензию клеток. VisuaLLY, наблюдать некоторые из красного цвета в снижении подвески немедленно. Оставьте пробирки на льду в течение 5 мин для достижения максимального лизиса эритроцитов.
      Примечание: стадия лизиса RBC может быть пропущен, если исследователь уверен в перфузию почек и меньше манипуляций клеток желательно. Мы наблюдали значительное увеличение выхода клеток почки, не подвергая клеточной суспензии эритроцитов лизиса.
    5. Спин пробирки в центрифуге, который был установлен на 500 XG, 4 ° С в течение 5 мин, с образованием осадка клеток.
      Примечание: Во время шагов 3.6 и 3.7, подготовки к коллоидного диоксида кремния (Перколла) на основе центрифугирования в градиенте плотности.
      1. Возьмите 10 мл с круглым дном полипропиленовые пробирки и маркировать их с соответствующими номерами образцов и поместить их в стойку трубки.
        Примечание: Ниже описывается, как сделать достаточно градиента плотности реагентов для 4 образцов почек.
      2. Возьмем 7 мл раствора проточной цитометрии окрашивающего буфера и пипеткой его в 15 мл коническую пробирку. Добавляют 1 мл 2 М сахарозы вготовят 0,25 М сахарозы.
      3. Затем, возьмите 7,2 мл градиента плотности реагента и пипеткой его в еще 15 мл коническую трубку. Добавить 1,55 мл раствора проточной цитометрии окрашивающего буфера и 1,25 мл 2 М раствора сахарозы, чтобы подготовить 72% градиент плотности реагента и 0,25 М сахарозы.
      4. Пипетка 1 мл 72% реагента, в градиенте плотности в один с круглым дном полипропиленовую пробирку для каждого образца.

    4. Градиент Центрифугирование

    1. После выполнения шага 3.7, возьмите пробирки, и осторожно сливают супернатант одним плавным движением, а также переливать следующую каплю жидкости, которая образует в то время как трубка удерживается с ног на голову.
      Примечание: Этот шаг важен, поскольку оставляя за собой избыток жидкости может изменить градиент плотности достаточно, чтобы создать изменение урожайности. Когда трубка установлена ​​обратно в вертикальном положении, ~ 200-300 мкл жидкости остается с клеточного осадка.
    2. Пипетка 1 мл 0,25 М сахарозы на осадку клеток и осторожно, но энергично пипеткой вверх и вниз для Бринаг клетки до однородной суспензии. Затем добавьте суспензии клеток в 1 мл 72% градиента плотности реагента (3.7.4) и еще раз пипеткой энергично перемешать клетки с образованием 36% реагента градиента плотности.
    3. Принимать по 1 мл 72% реагента градиента плотности в полипропиленовой Пастера (передачи) пипеткой. С равномерным давлением на лампу (удерживает колонну жидкости в наконечнике, и предотвращает образование пузырьков), вставьте пипетку Пастера в нижней части суспензии клеток (36% реагента в градиенте плотности) осторожно и выгружать 72% реагента градиента плотности с образованием отличается более тяжелым слоем.
    4. Возьмите пробирки с образцами мягко и поместить в центрифугу, которая при комнатной температуре в течение этого шага. Спин в течение 20-30 мин при 500 х г.
    5. В то же время, подготовить еще два набора полипропилена с круглым дном центрифужные пробирки с соответствующими идентификаторами образцов.
    6. После этапа 4.4 завершена, удалить образец, содержащий полипропиленовые трубы аккуратно, с минимальным тряски и установить его внизна стойке трубки.
    7. Возьмите первую трубку образца и его соответствующую пустую трубку. С полипропиленовой пипетки Пастера, осторожно, но тщательно размеренным всасывания, удалите верхний слой "мусор" или "клейкий материал" и положил его в пустую круглой трубе снизу центрифуге.
      1. Продолжить удаление верхней части градиента до "лейкоцитарной пленки" достигается (может показаться не совсем белого с красноватым оттенком [эритроцитов]). Прекратить отсасывание, если высота ~ 3 мм достигается от "лейкоцитарной пленки".
        Примечание: Убедитесь в том, что этот материал полностью исчез из верхней части градиента, перед продолжением всасывания.
    8. Возьмите свежий пипетки Пастера и свежий круглую трубу снизу центрифугу и осторожно удалите поглощающее покрытие. Продолжать всасывания 3 - 5 мм ниже поглощающие покрытие , чтобы гарантировать , что большинство клеток собирают и добавлены к нижней круглой трубы 2 - й новый с соответствующим идентификатором образца.
    9. Добавить 1-2 мл оF Проточная цитометрия Окрашивание буферного раствора , 2 - й трубки и тщательно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
    10. Спин вниз клетки при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° C. А 2 - й промывки шаг раствором проточной цитометрии Окрашивание буфера не является обязательным. Ресуспендируют в 500 мкл раствора проточной цитометрии окрашивающего буфера и приступают к подсчету клеток с помощью гемоцитометра.

    5. Необязательно (Cell Этикетировочное)

    1. Аликвоту каждого образца для того же самого числа клеток. Добавить блокирующий антитела в разведении 0,5 мкг на 10 6 клеток (анти - CD16 / CD32 FcR) и инкубировать на льду в течение 15 мин.
    2. Добавьте желаемый коктейль из первичных антител (сопряженного с соответствующими флуорофоров), которые определены как хорошо работать друг с другом исследователем, перед проведением эксперимента. Инкубируют на льду в течение 30 мин. Вымойте клеток с PBS.
      Примечание: Для демонстрации почек маркировки иммунных клеток для этой рукописи, мы использовали Т-LYmphocyte и макрофаг / панель дендритных клеток. Панель Т-лимфоцит состоял из поправимо Жизнеспособность Stain FVS510, анти-CD45 (клон: 30-F11) BV421, Anti-Foxp3 (Клон: ЗСК-16s) APC, Anti-CD127 (клон: A7R34) PE / Cy7, анти- CD44 (клон: IM7) PerCP / Cy5.5, анти-CD4 (Клон: RM4-5) APC-Cy7, анти-CD8 (Клон: 53-6.7) BV785. Панель макрофаг состояла из поправимо Жизнеспособность Stain FVS510, анти-CD45 (клон: 30-F11) BV421, Anti-Ly6G (Клон: 1A8) FITC, анти-CD11b (Клон: M1 / ​​70) PerCP-Cy5.5, Анти- APC, Anti-CD11c (Клон: N418): / 80 (BM8 Clone) F4 BV785.
    3. Добавьте поправимо Жизнеспособность Пятно и оставить на скамейке верхом в течение 5 мин. Вымойте клетки с раствором проточной цитометрии Окрашивание буфером для удаления избытка поправимо Жизнеспособность Stain.
    4. Добавить / Fixation реагент пермеабилизирующего и инкубировать в течение ночи при 4 ° С. Стирать в пермеабилизации растворе.
    5. Для внутриклеточного окрашивания, блокировать снова с анти-CD16 / 32 FcR в течение 10 минут. Добавьте внутриклеточные пятна и инкубировать в течение 20-30 мин. Мытье 2x в реrmeabilization решение.
    6. Ресуспендируют в растворе и запустить проб проточной цитометрии окрашивающего буфера через FACS машины 3,9.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Количество панелей, которые могут выполняться в зависимости от количества иммунных клеток, которые могут быть достоверно получены из почек. Здесь мы демонстрируем возможность запускать 2 панели, один для Т-лимфоцитов и один для макрофагов / дендритных клеток. На панели Т-лимфоцитов, мы сначала рассмотрим рассеяния вперед (FSC) и бокового рассеяния (SSC) модель и разграничить население интерес , как показано на рисунке 1 (верхний левый точка участка). Далее, жизнеспособно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы представили здесь методику для получения иммунных клеток из почки в надежной и эффективной. Основная модификация к широко используемым шагом коллагеназы (механическое разрушение ткани) экономит около 30 мин и выделение большого количества жизнеспособных клеток иммунной системы занимает менее двух часов в течение 4 образцов почек. К тому же , в зависимости от нашего вопроса исследования, мы теперь только использовать одну почку (другая почка может быть использован для анализа белка с помощью Вестерн - блоттинга, иммун...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Эта работа поддержана исследовательским грантом от Dialysis Clinics Inc. и грантом Исследовательского совета Университета Миссури.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Stomacher 80 Лабораторная система BiomasterSeward
Stomacher 80 Классические мешкиSewardBA6040/STR
Sorvall Legend XFRCentrifuge Thermo ScientificИли аналогичное оборудование 
ГемоцитометрЭлектронная микроскопия Sciences63514-11
Аналитический проточный цитометрBD LSR-X20 Fortessa
Percoll SigmaP1644
Dulbecco' s фосфатный буферный физиологический раствор 1x (DPBS)Gibco, Life Technologies14190-250
Полипропиленовые трубки, без колпачкаBecton Dickinson352002
Фиксируемая жизнеспособность StainBD Biosciences FVS510,  564406
Anti-CD16/32 (клон: 93)EBioscience14-0161
анти-CD45 (клон: 30-F11)  BV421 BD Pharmingen103133/4
Anti-Foxp3 (клон: FJK-16s) APCEBioscience17-5773
Anti-CD127 (клон: A7R34) PE/Cy7Biolegend135013/4
анти-CD44 (клон: IM7) PerCP/Cy5.5Biolegend103031/2
анти-CD4 (клон: RM4-5) APC-Cy7Biolegend100413/4
анти-CD8 (клон: 53-6.7) BV785Biolegend100749/50
Anti-Ly6G (клон: 1A8) FITCBiolegend127605/6
Anti-CD11b (клон: M1/70) PerCP-cy5.5Biolegend101227/8
Anti-F4/80 (клон: BM8) APCBiolegend123115/6
Anti-CD11c (клон: N418) BV785Biolegend117335/6
Anti-CD301 (клон: LOM-14) PE-Cy7Biolegend145705/6
Anti-CD26 (клон: H194-112) PEBiolegend137803/4
100 μ m filter Пробирки Fisher Scientific22363548
Fisherbrand 50 млFisherили аналогичное оборудование 
Пробирки Fisherbrand 15 млFisherИли аналогичное оборудование 
СахарозаFisher chemicalS5-3
Трансферная пипетка с тонким наконечникомSamco Scientific232Или аналогичное оборудование 
Буферный раствор для окрашивания проточной цитометрииEBioscience00-4222-26или аналогичное оборудование 
1x Буфер для лизиса эритроцитовEBioscience00-4333-57Или аналогичное оборудование 

Ссылки

  1. Ascon, D. B., et al. Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury. J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).
  2. Ascon, M., et al. Renal ischemia-reperfusion leads to long term infiltration of activated and effector-memory T lymphocytes. Kidney Int. 75 (5), 526-535 (2009).
  3. Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (6), 1363-1377 (2015).
  4. Chen, Z., et al. Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes. J. Immunol. Methods. 413, 57-61 (2014).
  5. Dong, X., et al. Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia-reperfusion injury. Kidney Int. 71 (7), 619-628 (2007).
  6. Hickey, F. B., Martin, F. Diabetic kidney disease and immune modulation. Curr. Opin. Pharmacol. , (2013).
  7. Kawakami, T., et al. Resident renal mononuclear phagocytes comprise five discrete populations with distinct phenotypes and functions. J. Immunol. 191 (6), 3358-3372 (2013).
  8. Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp. Ther. Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
  9. Picot, J., Guerin, C. L., Le Van, K. C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
  10. Ricardo, S. D., van, G. H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J. Clin. Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
  11. Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Herrera-Acosta, J., Johnson, R. J. Role of immunocompetent cells in nonimmune renal diseases. Kidney Int. 59 (5), 1626-1640 (2001).
  12. Vielhauer, V., et al. Efficient renal recruitment of macrophages and T cells in mice lacking the duffy antigen/receptor for chemokines. Am. J. Pathol. 175 (1), 119-131 (2009).
  13. Weisheit, C. K., Engel, D. R., Kurts, C. Dendritic Cells and Macrophages: Sentinels in the Kidney. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. , (2015).
  14. Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
  15. Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
  16. Zhou, J., Nagarkatti, P., Zhong, Y., Nagarkatti, M. Immune modulation by chondroitin sulfate and its degraded disaccharide product in the development of an experimental model of multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 223 (1-2), 55-64 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Проточная цитометрияцентрифугирование в градиенте плотностимеханическая дезинтеграция тканейстромально-васкулярная фракцияизоляция клетокпротокол перфузиилизис эритроцитоввыделение лейкоцитарного слоямногоцветная проточная цитометрия
Надежность и высокая эффективность Извлечение почки иммунных клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.