Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Генетическая инженерия нетрадиционный дрожжей по возобновляемым источникам биотоплива и биохимической производства

14.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54371

⸱

20 сентября 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2NUS Synthetic Biology for Clinical and Technological Innovation (SynCTI), Life Sciences Institute, National University of Singapore, 3Food Science and Chemical Engineering, Singapore Institute of Technology

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы сообщаем о методах молекулярно-генетической манипуляции со штаммом Yarrowia lipolitica Po1g для повышения эффективности делеции генов. Полученные сконструированные штаммы Y. lipolitica имеют потенциальное применение в биотопливе и биохимическом производстве.

Аннотация

Yarrowia lipolytica является непатогенные, диморфные и строго аэробные виды дрожжей. Благодаря своим отличительным физиологических особенностей и метаболических характеристик, этот нетрадиционный дрожжей является не только хорошей моделью для изучения фундаментальной природы грибковой дифференциации, но и является перспективным микробная платформой для биохимического производства и различных биотехнологических применений, требующих обширных генетических манипуляций. Тем не менее, генетические манипуляции Y. lipolytica были ограничены в связи с отсутствием эффективной и стабильной генетической трансформации системы, а также очень высокие показатели не-гомологичной рекомбинации , которые могут быть в основном отнесены к гену Ku70. Здесь мы сообщаем простой и быстрый протокол для эффективной генетической трансформации и делеции гена в Y. lipolytica Po1g. Во- первых, это протокол для эффективной трансформации экзогенной ДНК в Y. lipolytica Po1g был создан. Secoго, для достижения повышенной скорости гомологичной рекомбинации двойной кроссовер для дальнейшего удаления генов - мишеней, ген Ku70 был удален путем преобразования кассеты с разрывом , несущий 1 кб гомологий руки. В- третьих, чтобы продемонстрировать эффективность повышенную делеции гена после удаления гена Ku70, мы индивидуально удалены 11 целевых генов , кодирующих алкогольдегидрогеназы и алкогольоксидазы , используя те же процедуры на штамм Ku70 Нокаут платформы. Было отмечено, что скорость точной гомологической рекомбинации существенно увеличилась с менее чем 0,5%, для удаления гена Ku70 в Po1g до 33% -71% для одного делеции гена из 11 генов - мишеней в Po1g Ku70 А. Репликативной плазмиду, несущую маркер устойчивости к гигромицину B и система Cre / LoxP была построена, и ген селекции маркера в штаммах дрожжей нокаутных был в конечном счете удалены путем экспрессии Cre рекомбиназой для облегчения проведения множества раундов щитомTed генетические манипуляции. Полученные мутанты с делецией одного гена имеют потенциальное применение в биотопливе и биохимического производства.

Введение

В отличие от Saccharomyces CEREVISIAE, Yarrowia lipolytica, нетрадиционным дрожжей, может расти в виде дрожжей или мицелия в ответ на изменения условий окружающей среды 1,2. Таким образом, этот диморфизм дрожжи могут быть использованы в качестве хорошей модели для изучения грибкового дифференцировки, формообразования и систематики 3,4,5. Это , как правило , считается безопасным (GRAS) видов дрожжей, которые широко используются для производства различных пищевых добавок , таких как органические кислоты, многоатомные, ароматические соединения, эмульгаторы и поверхностно -активные вещества 6,7,8,9. Это облигатные аэробной и хорошо известный маслянистую дрожжи способны естественным образом накапливать липиды в больших количествах, то есть, вплоть до 70% от сухого веса 10 клеток. Он также может использовать широкий спектр источников углерода для роста, в том числе различные виды остатков в ресурсах отходов в качестве питательных веществ , 11,12,13. Все эти уникальные особенности делают Y. lipolytica очень привлекательным дляразличные биотехнологические приложения.

Несмотря на то, всю последовательность генома Y. lipolytica опубликованных 14,15, генетические манипуляции этого нетрадиционного дрожжей является более сложным , чем у других видов дрожжей. Во- первых, преобразование этих дрожжей вида значительно менее эффективен из - за отсутствия стабильной и эффективной генетической трансформации системы 16,17. Во- вторых, кропотливое геномная интегрирование линейных кассет экспрессии обычно используется для экспрессии генов , представляющих интерес , как ни одна система плазмида природные эписомная не найдено в этих дрожжей 18. В- третьих, поколение генетических нокауты и постучать модули ограничены , потому что ген ориентации эффективность с помощью точной гомологичной рекомбинации в этих дрожжей является низким , и большинство событий интеграции происходят через негомологичной конец соединительной (NHEJ) 19.

В данном исследовании мы сообщаем оптимизированный протокол преобразования для Y. lipolytica Po1g штамм, который легко, быстро, эффективно и воспроизводимым. Для повышения частоты точной гомологической рекомбинации, мы удалили ген Ku70, который кодирует ключевой фермент в пути NHEJ. Используя оптимизированный протокол преобразования и преобразования линейного нокаутирующий кассету , содержащую фланговые области гомологии в 1 кб, ген Ku70 из Y. lipolytica Po1g был успешно удален. Надежность этой методики удаления гена затем продемонстрирована путем пристреливать алкогольдегидрогеназы и гены алкогольоксидазы в штамм Po1g Ku70 Д. Было отмечено , что удаление штамма Ku70 проявляли значительно более высокую эффективность гомологичной рекомбинации генов-опосредованной ориентации , чем у дикого типа Po1g штамма. Кроме того, замещающий Плазмиду экспрессии Cre несущий маркер устойчивости к гигромицину B был построен для выполнения маркера спасение. Маркер спасательных облегчает несколько раундов гена адресности-гое получены мутанты делеции гена. Помимо делеции гена, наш протокол для генетической трансформации и делеции гена , описанного здесь , могут быть применены для вставки генов в специфические локусы, а также ввести сайт-специфические мутации в Y. lipolytica генома.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Генерация Y. lipolytica Ku70 Удаление Штамм

  1. Строительство кассеты с разрывом
    Примечание: смотри таблицу 1 для всех используемых праймеров в полимеразной цепной реакции (ПЦР) усилений.
    1. Дизайн праймеров 20 для ПЦР - амплификации экспрессии LEU2 кассету (см таблицу 1) из Y. Вектор экспрессии lipolytica и ввести LoxP сайтов в 5'- и 3' - концы LEU2 кассеты с длинной прямой праймер (# 1, таблица 1) и длинной обратного праймера (# 2, таблица 1), соответственно. Для того, чтобы ввести дополнительный сайт рестрикции для последующих этапов процесса клонирования, добавить сайт рестрикции Bam HI сайт в праймер # 1.
    2. Выполните ПЦР с использованием ДНК - полимеразы с высокой точностью воспроизведения , как подробно описано в таблице 2.
    3. Очищают продукт ПЦР LoxP-промотор-LEU2-терминатор-LoxP кассета с использованием purificatio PCRп комплект в соответствии с инструкциями изготовителя. Добавить свесы 3'-A к очищенного продукта ПЦР в соответствии с инструкциями изготовителя 21. Использование ДНК - лигазы Т4 для лигирования A-белохвост ПЦР - продукт в клонирующий вектор ТА с получением плазмиды Т-leu2 согласно Таблице 3.
    4. ПЦР - амплификации 1 т.п.н. 5 'вверх по течению последовательности гена Ku70 с использованием праймеров # 3 / # 4 из Y. lipolytica Po1g геномную ДНК 22 в соответствии с таблицей 2. Очищают продукт ПЦР с использованием набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями изготовителя.
      1. Двойной переваривать как очищенный продукт ПЦР и Т-LEU2 плазмиду с ферментами Sac II и Bam HI согласно Таблице 4. Очищают переваривания смеси с использованием набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями изготовителя. С помощью ДНК - лигазы Т4 для лигирования Очищенный и переваривают ПЦР - продукта в Sac II / Bam HI сайты T-LEU2 с получениемплазмида T-LEU2-5E согласно Таблице 3.
    5. ПЦР - амплификации 1 кб 'вниз по течению последовательность гена Ku70 3 с использованием праймеров # 5 / # 6 из Y. lipolytica Po1g геномную ДНК 22 в соответствии с таблицей 2. Очищают продукт ПЦР с использованием набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями изготовителя. Двойной переваривать как очищенный продукт ПЦР и Т-LEU2-5E плазмиду с Not I и NDE I ферментов в соответствии с таблицей 4.
      1. Очищают смесь переваривания с использованием набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями изготовителя. Затем, перевязывать очищенный и переваривают ПЦР - продукта в Not I / Nde I - сайты T-LEU2-5E с получением плазмиды Т-KO с использованием ДНК - лигазы Т4 в соответствии с таблицей 3.
    6. Дайджест плазмиды Т-KO с Sac II и Nde I ферментов в соответствии с таблицей 4 для получения кассеты с разрывом (рис 1 ). Очищают переваренных фрагментов ДНК с использованием набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями изготовителя.
  2. Подготовка Компетентная клеток и превращение Y. штамм lipolytica Po1g
    1. подготовка Компетентная клеток
      1. Привить колонии Y. штамм lipolytica Po1g из свежей дрожжевой экстракт-пептон-декстроза (YPD) пластины в 10 мл среды YPD (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% декстрозы и 50 мМ цитратный буфер рН 4,0) в 100 мл колбе. Выдержите в качалке инкубаторе 30 ° C при 225 оборотах в минуту в течение 20 ч до уровня насыщения (OD 600 около 15, измеренная с помощью спектрофотометра).
      2. Гранул клетки центрифугированием в течение 5 мин при 5000 х г при комнатной температуре. Промывают клетки с 20 мл Трис-ЭДТА (ТЕ) буфера (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5), и осадка клеток, как описано в шаге 1.2.1.2. Ресуспендируют клеток в 1 мл 0,1 М ацетата лития (рН 6,0, настроенная с помощью уксусной кислоты), и инкубируют в течение 10 мин при комнатной Tempeратура.
      3. Аликвотировать компетентных клеток (100 мкл) в стерильные 1,5 мл пробирки. Перейдите к шагам преобразования ниже немедленно, или добавить глицерин до конечной концентрации 25% (об / об) и хранят при -80 ° С в течение длительного хранения.
    2. трансформация
      1. Аккуратно смешайте 10 мкл денатурированной ДНК спермы лосося (10 мг / мл) и 1-5 мкг очищенного кассеты с разрывом вместе со 100 мкл компетентных клеток, и инкубировали при 30 ° С в течение 15 мин.
      2. Добавьте 700 мкл 40% полиэтиленгликоля (ПЭГ) -4000 (растворенного в 0,1 М ацетата лития рН 6,0), хорошо перемешивают и инкубируют в качалке инкубаторе 30 ° C при 225 оборотах в минуту в течение 60 мин.
        Примечание: Важно использовать ПЭГ со средней молекулярной массой 4000, а не PEG-3350 (обычно используется в преобразовании обычных дрожжей).
      3. Теплового шока и трансформированные смеси, поместив трубку в водяной бане при 39 ° С в течение 60 мин.
      4. Добавить 1 мл YPD среды ивосстановить в течение 2 ч при температуре 30 ° C и 225 оборотов в минуту. Центрифуга при 9000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре, удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 1 мл ТЕ-буфера.
      5. Repellet клетки центрифугированием при 9000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре и отбросить супернатант. Ресуспендируют осадок в 100 мкл ТЕ - буфера и пластину на селективных планшетах (например, лейцин-дефицитных пластин), и инкубируют при температуре 30 ° C в течение 2-3 дней.
      6. Pick 4 до 10 отдельных колоний и прививают по отдельности в 2 мл среды YPD. Выдержите в течение ночи в шейкере инкубаторе 30 ° C при 225 оборотах в минуту. Выявление положительных колоний с помощью ПЦР - анализа геномной ДНК из трансформантов 22 согласно таблице 5 , с использованием двух наборов праймеров # 55 / # 56 и # 56 / # 57, соответственно.
        Примечание: Не я линеаризованный вектор pYLEX1 превращается в Y. lipolytica Po1g компетентные клетки с целью определения эффективности трансформации путем подсчета числаколониеобразующих единиц (КОЕ) на мкг плазмидной ДНК использовали 23.

2. Маркер спасения

  1. Конструирование плазмиды экспрессии Cre
    1. Строительство pYLEX1-CRE и pYLEX1-ПВД
      1. Дизайн праймеров 20 для ПЦР - амплификации открытые рамки считывания CRE и ПВД. Добавить дополнительный аденин нуклеотид перед старт - кодонов в прямых праймеров # 82 и # 84, и вставить сайты рестрикции Kpn I ниже по потоку от стоп - кодонов в обратных праймеров # 83 и # 85. ПЦР - амплификации открытые рамки считывания CRE и ПВД от pSH69 (инвентарный номер HQ412578) 24 в соответствии с таблицей 2.
      2. Очищают как CRE и фрагменты РВД с использованием набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями изготовителя. Digest и очищенного CRE и РВД фрагменты с Kpn I фермента согласно TABLе 4. Двойной переварить pYLEX1 плазмиду с ферментами Pml I и кф I в соответствии с таблицей 4. Очищают переваривания смеси с использованием набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями изготовителя.
      3. Использование ДНК - лигазы Т4 в соответствии с таблицей 3 для лигирования очищенные и переваривают CRE и HPH фрагменты сайтов Pml I / Kpn I в Y. Вектор для экспрессии lipolytica, получая pYLEX1-CRE и pYLEX1-HPH, соответственно.
    2. Строительство pSL16-CRE-ПВД
      1. ПЦР - амплификации промотор-ген-терминатор кассету CRE из pYLEX1-CRE с использованием праймеров # 86 / # 87 фланговые сайты Sal I / Pst I ограничение, в соответствии с таблицей 2. Очищают продукт ПЦР с использованием набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями изготовителя ,
        1. Двойной переваривать как очищенный продукт ПЦР и pSL16-CEN1-1 (227) плазмиды 25 с Sal I иPst I ферменты в соответствии с таблицей 4. Очищают смесь переваривания с использованием набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями изготовителя. Затем, перевязывать очищенный и переваренной ПЦР - продукт в pSL16-CEN1-1 (227) , расположенных на соответствующих сайтах для создания pSL16-CRE с использованием ДНК - лигазы Т4 в соответствии с таблицей 3.
      2. ПЦР - амплификации промотор-ген-терминатор кассету ПВД из pYLEX1-ПВД с использованием праймеров , # 88 / # 89 фланкирующих сайтов рестрикции Xho I / Bgl II согласно Таблице 2. Очищают продукт ПЦР с использованием набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями изготовителя ,
        1. Двойной переваривать как очищенный продукт ПЦР и pSL16-CRE плазмиду с ферментами Xho I и Bgl II в соответствии с таблицей 4. Очищают переваривания смеси с использованием набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями изготовителя. Затем, лигирование очищенный и переваривают продукта ПЦР в pSL16-CRE в соответствующийсайты для создания pSL16-CRE-HPH с использованием ДНК - лигазы Т4 в соответствии с таблицей 3.
          Примечание: Полученное выражение плазмиду Cre, pSL16-CRE-РВД, таит в себе селективный маркер гигромицину B и является центромерная и эписомально тиражирование вектор (рисунок 2).
      3. Проверьте все конструкции расщеплением соответствующими ферментами рестрикции (например, Sal I / Pst I, акцизным вставку из вектора) в соответствии с таблицей 4.
  2. Cre рекомбиназа-опосредованной маркер спасательного
    1. Transform pSL16-CRE-HPH в компетентные клетки штамма нокаутных Ku70 в соответствии с протоколом , описанным в трансформации разделе 1.2 выше. Пластинчатые трансформированные клетки на YPD плюс гигромицину B (YPDH) пластины (содержащей 400 мкг / мл гигромицину В), и инкубируют при температуре 30 ° C в течение 2-3 дней.
    2. Выполняют колонии PCR в соответствии с таблицей 5 с использованием праймеров # 84 / # 85 , чтобы определить положительныйколонии, содержащие pSL16-CRE-HPH плазмиды после трансформации.
      Примечание: Прямой праймер # 84 и обратный праймер # 85 расположены внутри кодирующей области гена л.с.ч (таблица 1). Только положительные клоны генерируют конкретный продукт ПЦР в ПЦР-реакции.
    3. Выберите позитивный клон и прививают в 2 мл YPDH среды, и инкубируют в качалке инкубаторе 30 ° C при 225 оборотах в минуту в течение ночи до насыщения. Измерьте оптическую плотность клеток 600 с помощью спектрофотометра. Сбора клеток при OD 600 ~ 15. Центрифуга при 5000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, и мыть один раз с 2 мл стерильной воды.
    4. Повторное инокуляции клеток в 2 мл среды YPD с начальной OD 600 0.1 и позволяют клеткам расти в качалке инкубаторе 30 ° C при 225 оборотах в минуту в течение ночи. Streak Ночную культуру клеток на YPD пластин для выделения отдельных колоний 23. Реплика пластины колоний на YPD, YPDH и лейцин-дефицитных пластины 23 .
      Примечание: Колонии, которые потеряли обоих LEU2 маркер и pSL16-CRE-HPH плазмиду могут расти только на YPD пластин (рисунок 3).

3. Удаление алкогольдегидрогеназы и алкогольоксидазы Гены

  1. Выполнить поиск по Y. базы данных генома lipolytica с использованием Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) для определения кандидатов для удаления генов 26. Входные белковая последовательность S. CEREVISIAE алкогольдегидрогеназы I в поисковой BLAST инструмент (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa).
    Примечание: Инструмент поиска BLAST возвращает наиболее сходные последовательности белка в Y. lipolytica генома базы данных.
  2. Построить делеция кассеты с помощью ПЦР с праймерами # 7 до # 56 (таблица 1), а также выполнять расщепления ферментами рестрикции и реакции лигирования с использованием тех же методов , как описано в разделе 1.1 выше.
  3. приготовительныйкомпетентные клетки штамма Ku70 нокаута, осуществлять преобразования и выполнять ПЦР для выявления положительных колоний с использованием праймеров # 55, # 58, # 81 (таблица 1), следуя протоколу , описанному в разделе 1.2 выше.
    Примечание: В качестве примера, процедура для удаления гена YALI0E17787g описана на фигурах 4 и 5. Эффекты 1 кб и 2 кб длинной гомологичной области по гомологичной скорости рекомбинации сообщается.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Линеаризованная Ю.В. Выражение lipolytica вектор был вставлен в док - платформу PBR в геноме Y. lipolytica штамм Po1g путем выполнения одной рекомбинации кроссовера 27. Используя быструю процедуру химического превращения , установленный в данном исследовании, линеаризованная Y. Выражение lipolytica вектор был успешно преобразован в дикого типа штамма Po1g при эффективности трансформации> 100 КОЕ / мкг ДНК. Нокаут кассеты по бокам...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наша цель данного исследования заключается в обеспечении быстрого и эффективного формирования целевых нокауты генов в Y. lipolytica Po1g штамм. Несколько соображений необходимо решить для достижения этой цели. Во-первых, требуется высокая эффективность преобразования. Таким образом, эффективный и удобный протокол химического преобразования для Y. lipolytica Po1g штамм был описан в данном исследовании. Применение ПЭГ-4000 является критическим фактором для успешной трансформации этого штамма. Не...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы выражаем глубокую признательность за финансовую поддержку со стороны Национального агентства по окружающей среде Сингапура (ПОПК 1201102), Конкурентный Программа исследований Национального исследовательского фонда Сингапура (NRF-CRP5-2009-03), Агентства по науке, технологиям и исследованиям Сингапура ( 1324004108), Global R & D Программа проекта, Министерство экономики знаний, Республика Корея (N0000677), Агентство по уменьшению угрозы обороны (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) и Синтетическая биология Инициатива Национального университета Сингапура ( DPRT / 943/09/14).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Реагент/Материал
Олигонуклеотидные праймерыИнтегрированные ДНК Технологии25 нмоль ДНК олигос<
эм>Y. lipolitica штамм Po1gYeastern Biotechлейцин ауксотрофное производное дикого типа штамма W29 (ATCC 20460)
Вектор pYLEX1Yeastern BiotechFYY203-5MGY. lipolitica экспрессия
вектораE. coli TOP10InvitrogenДля клонирования и размножения плазмид
pGEM-T vector PromegaA3600TA вектор
клонирования QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106Для выделения плазмид
Wizard SV Gel and
PCR Clean-Up System		PromegaA9282Извлечение фрагментов ДНК из агарозных гелей
и очистка продуктов ПЦР от реакции амплификации
Высоко<точная ДНК->полимераза iProofBio-Rad172-5302Высокоточная ДНК-полимераза
BamHI Новая Англия BiolabsR0136SФермент рестрикции
BglII New England BiolabsR0144LФермент рестрикции
KpnINew England BiolabsR0142SФермент рестрикции
NdeI New England BiolabsR0111SФермент рестрикции
NotINew England BiolabsR0189LФермент рестрикции
PmlINew England BiolabsR0532SФермент рестрикции
PstI New England BiolabsR0140SФермент рестрикции
SacIINew England BiolabsR0157SФермент рестрикции
SalINew England BiolabsR0138SФермент рестрикции
XhoINew England BiolabsR0146LФермент рестрикции
T4 ДНК-лигазаNew England BiolabsM0202L
Taq ДНК-полимераза& НБСП;Bio-RadM0267L
АмпициллинGibco-Life Technologies11593-027Антибиотики
Гигромицин BPAAP21-014Антибиотики
GeneRuler 1 кб Лестница ДНКThermo ScientificSM03121 кб Лестница ДНК
PEG4000Sigma95904-F
TrisPromegaH5135
EDTABio-Rad161-0729
Сперма лосося ДНКInvitrogen15-632-011
Ацетат литияСигма
Уксусная кислотаСигма
Стеклянные бусины (425-600 & микро; m)SigmaG8772
РНКазаA Thermo ScientificEN0531
Краситель для загрузки ДНКThermo ScientificR0611
Экстракт бакто-дрожжейBD212750
Бакто-пептонBD211677
D-глюкозой1-е основаниеBIO-1101
YNB без аминокислотSigmaY0626
DO Добавка-LeuClontech630414
глицеринаSigmaG5516
Difco LB БульонBD244620
Difco LB АгарBD244520
Бакто АгарBD214010
Оборудование
ПЦР-машинаBioradT100 Термоамплификатор
Водяная баняMemmertWNB 14
Стационарный/встряхивающий инкубаторYihderLM-570RD
ТермошейкерAllshengMS-100
МикроцентрифугаEppendorf5424R
ЦентрифугаEppendorf5810R
СпектрофотометрEppendorf Биофотометр плюс
гелевый имиджерGEAmersham Imager 600

Ссылки

  1. Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M. Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis. J, R. uiz-H. errera , 58-66 (2012).
  2. Coelho, M., Amaral, P., Belo, I. Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. Méndez-Vilas, A. , 930-940 (2010).
  3. Martinez-Vazquez, A., et al. Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Plos One. 8 (6), e66790(2013).
  4. Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).
  5. Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene. Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).
  6. Domìnguez, Á, et al. Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production. Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).
  7. Zinjarde, S. S. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem. 152, 1-10 (2014).
  8. Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects. Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).
  9. Groguenin, A., et al. Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds. J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).
  10. Meng, X., et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).
  11. Papanikolaou, S., Aggelis, G. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture. Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).
  12. Tai, M., Stephanopoulos, G. Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production. Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).
  13. Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future. Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).
  14. Liu, L., Alper, H. S. Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host. Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).
  15. Dujon, B., et al. Genome evolution in yeasts. Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).
  16. Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).
  17. Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).
  18. Matsuoka, M., et al. Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica. Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).
  19. Kretzschmar, A., et al. Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining. Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).
  20. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).
  21. Kobs, G. Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems. Promega Notes. 62, 15-18 (1997).
  22. JoVE Science Education Database. Isolating Nucleic Acids from Yeast. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast (2016).
  23. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064(2012).
  24. Hegemann, J. H., Heick, S. B. Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).
  25. Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission. J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).
  26. McGinnis, S., Madden, T. L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).
  27. Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).
  28. Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones. J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Yarrowia lipolyticaKU70Cre LoxP
Генетическая инженерия нетрадиционный дрожжей по возобновляемым источникам биотоплива и биохимической производства
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.