Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Очистка Native Комплексы для структурного исследования с использованием метода Tag Тандем Affinity

9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54389

⸱

27 июля 2016 г.

 , 
1Department of Biochemistry, Brandeis University, 2Winship Cancer Institute, Emory University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Метод Tandem Affinity Purification (TAP) широко используется для выделения нативных комплексов из клеточного экстракта, в первую очередь эукариотического, для протеомики. В данной статье представлен протокол метода TAP, оптимизированный для очистки нативных комплексов для структурных исследований.

Аннотация

Affinity подходы очистки были успешными в выделении родных комплексов для протеомики характеристик. Структурная неоднородность и степень композиционной неоднородности комплекса обычно не препятствуют прогрессу в проведении таких исследований. В отличие от этого, комплекс, предназначенный для структурной характеристики должны быть очищены в состоянии, которое является как композиционно и структурно однородными, а также при более высокой концентрации, чем требуется для протеомики. В последнее время были достигнуты значительные успехи в области применения электронной микроскопии для определения структуры крупных макромолекулярных комплексов. Это повысило интерес к подходам, чтобы очистить собственные комплексы достаточного количества и качества для структурного определения с помощью электронной микроскопии. Метод Tandem Affinity очистки (TAP) была оптимизирована для извлечения и очистки 18-субъединицу, ~ 0,8 МДа рибонуклеопротеиновый сборка из почкующихся дрожжей (Saccharomyces CEREVISIAE)

Введение

Многие крупные клеточные процессы осуществляются крупные белковые и белково-РНК комплексов 1. Существенным препятствием для проведения биофизических и структурных исследований таких комплексов их получения подходящего качества (то есть, однородности) и при соответствующей концентрации. Разделительный комплекс из природного источника имеет много преимуществ, в том числе сохранение соответствующих пост-транскрипционные и / или трансляционные модификации субъединиц и надлежащего страхования сложной сборки. Тем не менее, крупные клеточные комплексы часто присутствуют в клетке при низком числе копий, и очистку должны быть высокоэффективным и происходят в условиях, близких физиологических условиях для обеспечения сложной целостность сохраняется. Очищающий комплекс из эукариотической источника является особенно сложным и может быть финансово запретительной. Таким образом, стратегии или методы, которые являются эффективными и дают однородный комплекс являются весьма желательны.

Стратегия, которая былауспешно очистки родных комплексов из эукариотических клеток для их первоначальной характеристике является метод Tandem Affinity очистки (TAP) 2,3. Метод TAP был первоначально разработан для очистки нативного белка из почкующихся дрожжей (S. CEREVISIAE) в комплексе с взаимодействующими фактор (ы) 2. Метод ТАР используются две метки, каждый тэг, слитый в тандеме с той же кодирующей белок последовательности гена. Теги были выбраны таким образом, чтобы сбалансировать потребность в жесткой и селективное связывание с аффинным смолой с желанием поддерживать почти физиологических условиях в растворе. Этот баланс служит для сохранения устойчивого взаимодействия (ов) меченого белка с взаимодействующими фактора (ов) для определения характеристик после очистки. Genomically включены ТАР тег был помещен в конце (С-концевой) гена кодирующей белок и состоит из последовательности, кодирующей кальмодулин связывающий пептид (CBP), а затем белок А - добавление чуть более 20 кДа, к помеченным белок. CBP короткая, 26 аминокислот, и распознаваться ~ 17 кДа белок Кальмодулин (САМ) в присутствии кальция с K D порядка 10 -9 М 4. Белок Тег больше, состоящий из двух повторах 58 остатков с коротким линкером между повторами. Каждый повтор 58 аминокислоты признается иммуноглобулина G (IgG) с K D ~ 10 -8 М 5. Между этими двумя тегами был включен сайт узнавания для TEV протеазы, эндопептидазы из вируса табачной Etch 6,7. Как показано на фиг.1, на первой стадии аффинной метода ПВР меченый белок связывается с IgG смолы с помощью Протеин А. меченый белок элюируют на колонке с расщеплением при добавлении TEV протеазы, сайт-специфически отщеплением между две метки. Это является необходимым шагом, как взаимодействие IgG и белок А является очень сильным и может быть адекватно возмущенных только в денатурирующих условиях решения. Не имея Protein теге, белок связывается с СаМ смолой в присутствии кальция и элюируют из смолы с добавлением металлического иона хелатор EGTA (этиленгликоль этилендиаминтетрауксусной кислоты) (рисунок 1).

Вскоре после того, как введение метода TAP, он был использован в крупномасштабном исследовании , чтобы сгенерировать "карту" сложных взаимодействий в S. CEREVISIAE 8. Важно отметить, что в результате этих усилий библиотека все дрожжи-TAP Tagged открытой рамки считывания (ORF), а также индивидуальной TAP помеченный ORF , 9 доступны из коммерческих источников. Таким образом, можно получить любой штамм дрожжей с меченый белок для любого дрожжевого комплекса. Метод TAP также стимулировало модификации или вариации TAP тега, в том числе: ее использование для очистки комплексов из других эукариотических, а также бактериальных клеток 10,11; дизайн "Половину метки", в котором белок А и ТПС размещаются на различных белков 12; и таГ.С. изменена, с тем, чтобы удовлетворить потребность исследователя, такие как чувствительность комплекса к Са 2+ или EGTA 13.

Последние достижения в области как инструментария и методологии привели к значительному прогрессу в области применения электронной микроскопии (ЭМ) для определения структуры, которые привели к высоким, близким к изображениям с атомарным разрешением макромолекулярных комплексов 14. Разрешение можно получить из комплекса Е.М., однако, по-прежнему зависит от качества комплекса при исследовании. Это исследование использовало подход TAP тег , чтобы очистить от S. CEREVISIAE и1 snRNP, 18-субъединица (~ 0,8 МДА) с низким числом копий рибонуклеопротеиновый комплекс , который является частью сплайсосома 15,16. Ряд шагов были приняты, чтобы очистить этот комплекс таким образом, что она однородна и адекватной концентрации. Потенциальные проблемы, возникающие на различных стадиях очистки описаны и стратегии, направленные на преодоление Challenges выделены. Путем тщательной оценки и оптимизации шаги в очистке, то U1 snRNP очищают имеет качество и в количестве, подходящем для отрицательного пятна и электронной микроскопии (крио крио-ЭМ) исследований. Оптимизированный ТАР протокол метод очистки нативных комплексов для структурных исследований описан здесь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Следующий протокол был разработан для очистки комплекса из 4 л клеточной культуры, приблизительно 40 г сырого веса клеток. После приготовления, все буферы должны храниться при температуре 4 ° С и использовать в течение месяца со дня их получения. Восстанавливающие ингибиторы протеазы агента и добавляются только буферы непосредственно перед использованием.

1. Получение полного клеточного экстракта для Tandem Affinity очистки

  1. Рост S. CEREVISIAE Клетки
    1. Streak желаемый TAP помеченный S. CEREVISIAE штамм от хранения (-80 ° C) на дрожжевой пептон декстроза (YPD) пластины. Выдержите в течение 3 - 5 дней (30 ° С), пока дрожжевые клетки не появляются белые и пушистые.
    2. Инокулируйте полоса размером примерно 2 мм 2 -х из свежих клеток из пластины в 10 мл YPD сред в 50 мл коническую полипропиленовую центрифужную пробирку. Встряхивать пробирку при 180 оборотов в мин (оборотов в минуту) в течение ночи (30 м ° С).
    3. Привить 2 мл за кадромночь культуры на литр YPD сред в 2 л Эрленмейера или коническую колбу. Встряска при 180 оборотах в минуту (30 ° C). Монитор не рост клеток при оптической плотности 600 нм (OD 600) до поздней лог - фазы, OD 600 от 1,8 до 2, обычно 20 - 24 часов.
  2. Сбор С. CEREVISIAE Клетки
    1. Урожай клеток путем центрифугирования при 5,400 мкг в течение 15 мин (4 ° С).
    2. Быстро сливают надосадочную жидкость и сохранить клетки при 4 ° С или на льду.
    3. Приостановка каждый литр клеточного осадка с помощью 2 мл охлажденной лизирующего буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0; 300 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 0,2 мМ ЭДТА, рН 8,0; 5 мМ имидазола, рН 8,0; 10% глицерина, 0,1% об / об NP-40). Приостановить клеток с помощью закрученного и / или повторить пипеткой с использованием 10 мл серологические пипетки.
      Примечание: Важность NP-40, как она относится к сложному качества и анализ после очистки обсуждается ниже.
    4. Передача клеточной суспензии в пустой 50 мл конической полипропиленовой центрифужной пробирке кЕРТ на льду. Промыть каждую бутылку центрифуг с дополнительными 2 мл охлажденного лизирующего буфера и добавить к суспензии клеток в 50 мл трубки.
    5. Определение сырого веса клеточного осадка путем взвешивания трубки и вычитанием веса пустой трубы, а также добавлены лизирующего буфера.
      Примечание: Литр культуры клеток , имеющей наружный диаметр 600 1,8 составляет примерно 10 г.
    6. Создать ванну жидкого азота в 50 мл коническую полипропиленовую центрифужную пробирку. Draw суспендированные клетки в 5 мл шприца. Подключите 16 G иглу шприца. Замораживание суспензии клеток путем пропускания его через шприц / иглу, чтобы генерировать клетка "капли". Скорость замораживания должна составлять приблизительно 1 мин / мл.
    7. Хранить капли замороженных клеток (-80 ° C) или перейти к лизису.
  3. Лизирующий клетки и лизат Разъяснение
    1. Lyse дрожжевые клетки, используя кофемолку. Лизировать клетки от восьми до девяти раз с 25 сек размола очередями, а встряхивая грОффи мясорубки. Перед использованием предварительно охладить кофемолку с жидким азотом. Каждые два раунда шлифования, добавить неполную слой жидкого азота в мясорубке и дать ей испариться.
    2. Перемешать с жидким азотом охлажденным шпателем по мере необходимости, чтобы держать клетки от слипания. Соблюдайте осторожность, чтобы предотвратить таяние клеток, которые могут привести к клеточной слипания. Клетки должны появиться в виде тонкого белого порошка следующего лизиса. Максимальный осадок клеток из 4 л культуры дрожжей (~ 40 г) могут быть измельчены в то время.
      Примечание: Замечания относительно метода лизиса обсуждаются ниже.
    3. Оценить степень лизиса клеток с использованием гемоцитометра или альтернативный метод подсчета клеток. Для того, чтобы обеспечить адекватный анализ, принимать следующие образцы: (1) перед лизисом; (2) после четырех раундов лизиса; и (3) после лизиса. Для проверки этих образцов, возьмите небольшое количество клеток с жидким азотом охлажденным шпателем и поместить в 1,5 мл трубки.
    4. После того, как клетки размораживают, пипеткой 5 мкл клетоки смешать с 495 мкл воды. Если 40 - наблюдается 60% лизис клеток, переходите к следующему шагу в протоколе.
      Примечание: данные наблюдений в отношении влияния длительных периодов лизиса обсуждаются ниже.
    5. После того, как адекватный лизис наблюдается, магазин лизируют клетки (-80 ° С) или перейти к следующему шагу.
    6. Приготовьте два 50 мл коническую полипропиленовые центрифужные пробирки каждый с 15 мл лизирующего буфера, в том числе 1 мМ фенилметансульфонилфторид (ФМСФ), 1 мМ дитиотреитола (ДТТ), и коммерчески доступный коктейль ингибиторов протеазы.
      Примечание: Если наблюдается значительная протеолиза, рассмотреть вопрос об использовании протеазы дефицитный штамм.
    7. С помощью жидкого азота охлажденного лопаточку, чтобы выкопать замороженного лизису порошка клеток в подготовленные 50 мл пробирки. Добавьте порошок клеток / твердое вещество с приращением до лизирующего буфера, содержащие как восстановитель и ингибитор (ы) протеазы.
    8. Поворот 50 мл пробирки осторожно при комнатной температуре, с тем, чтобы растопить / растворения клеток, но и для предотвращения образования пузырей.S порошок клеток / твердые растворяется, добавляют дополнительной ячейки твердый / порошок.
    9. Заполните каждую из двух 50 мл пробирок, пока каждый не имеет приблизительно 20 г клеток или всех клеток, добавленных. Продолжить оттаивание / растворяющимися пока нет замороженных сгустки клеток наблюдали в 50 мл пробирки. Это должно занять приблизительно 50 мин.
    10. Центрифуга подвешенный лизата клеток в течение 20 мин при 25000 мкг (4 ° С). Хорошо лизированных клеток могут проявлять небольшое количество черного осадка.
    11. Перенесите 50 мл супернатанта поликарбонатные ультра-центрифужные пробирки (26,3 мл пробирки, используемые) и добавляют 10 мкл 200 мМ ФМСФ в каждую полную пробирку.
    12. Центрифуга в течение 1 ч при 100000 х г (4 ° C). Четыре слоя должны быть видны, снизу вверх: (1) твердый осадок ясно, содержащий рибосомные комплексы; (2) мягкий с высоким содержанием липидов гранул; (3) большой прозрачный желтый окрашенными слой, содержащий большую часть растворимых белков и комплексов ор клетки; и (4) 'чешуйчатый' верхний слой, состоящий из липидов.
    13. Выполните все Subsequent шаги в холодном помещении (4 ° С). Удалить как большая часть верхнего '' чешуйчатым липидного слоя, как это возможно с использованием 1 мл пипетку и выбросьте. Используйте 10 мл серологические пипетки, чтобы восстановить большую часть желтого, прозрачного слоя.
    14. Восстановить последние несколько мл этого слоя с использованием 1 мл пипетки, чтобы не потревожить нижние два слоя. Из 40 г сырого осадка клеток, приблизительно 48 мл среднего слоя, как правило, извлекают и 8 мл липидного слоя удаляют / отбрасывают.
      Примечание: Поток Очистка на колонке весьма затруднено наличием липидов, которые также могут привести к снижению качества комплекса, обсуждается ниже.

2. Колонка очистки Шаг 1: IgG хроматографии

  1. Смола Уравновешивание и Binding
    1. Подготовить 300 мкл IgG сефарозой суспензии 40 г клеточного осадка. Отрежьте конец наконечника пипетки 1 мл для облегчения пипетирования суспензии. Мытье / уравновешивания смоле IgG три раза, каждый раз 5 мл IgGD150 Buffeг (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0; 150 мМ NaCl, 150 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 5 мМ имидазола, рН 8, 0,1% об / об NP-40; 1 мМ ДТТ, ингибитор протеазы таблетка на 50 объем мл).
      1. Спин для осаждения при 160 мкг (4 ° С) между стирок и удалить супернатант.
    2. Поворотом смолы IgG с средней фазой надосадочной жидкости, и два мини-таблетки ингибитора протеазы на 40 г клеток, с помощью соответствующего поворотного устройства, в течение 2 ч (4 ° C). Это IgG партия раствора.
    3. Приготовьте два 10 мл поли-Prep колонки для использования разрезанием конец колонки, чтобы произвести плоский срез. Чтобы ускорить упаковку и промывки колонки самотеком, нагрузка максимум 200 мкл упакованной IgG смолы или ~ 25 мл указанного IgG пакетного раствора на 10 мл колонку.
    4. Налейте IgG пакетное раствор в колонку и позволяют оседать под действием силы тяжести. Если седиментация занимает больше времени, чем 30 мин, то, скорее всего, было липидный загрязнение при восстановлении средней фазы из центрифуги т. и массовые рассылки
    5. Промыть насадочной колонны с четырьмя последовательными 10 мл объемами IgGD150 буфера.
  2. На колонке TEV Расщепление
    1. Уплотнение из нижней части колонны и добавьте 1 мл IgGD150 буфера и 100 мкл TEV протеазы (0,6 мг / мл запаса, мутантный вариант S219V ТэВ собственного производства). Уплотнение верхней части колонны, и перемешивают в течение 20 мин (18 ° C) с использованием теплового смесителя, встряхивая при 750 оборотах в минуту. Ресуспендируют смолы и снова перемешать в течение 20 минут, повторите еще раз, в общей сложности 1 ч инкубации.
      Примечание: Очень важно, чтобы сохранить время инкубации до минимума.
    2. Возвращает колонку до 4 ° С и элюции белка / комплекса под действием силы тяжести. Элюции мертвую объем с дополнительным 200 мкл IgGD150 буфера.

3. Колонна очистки Шаг 2: Кальмодулин Affinity хроматографии

  1. Смола Уравновешивание и Binding
    1. Подготовьте 200 мкл кальмодулин сродства смолы на 40 г клетокгранул. Промыть Смолу трижды, каждый раз 5 мл Кальмодулин связывающем буфере (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0; 150 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 5 мМ имидазола, рН 8, 2 мМ CaCl 2; 0,1 % об / об NP-40, 10 мМ β-меркаптоэтанол), центрифугирование при 160 х г (4 ° C), чтобы осадить для каждой промывки.
    2. К каждому 1 мл IgG элюат, добавьте 3 объема кальмодулин буфера для связывания. Для поддержания постоянного уровня кальция, добавляют CaCl 2 и β-меркаптоэтанола , чтобы учесть отсутствие этих составляющих в элюирование IgG. Конечные концентрации должны быть 2 мМ CaCl 2 и 10 мМ β-меркаптоэтанола.
    3. Добавить образец в смоле кальмодулин и связываются в течение 1 ч (4 ° C) с использованием трубки ротатора.
  2. Упаковка и элюирования из кальмодулин смолы
    1. Приготовить 2 мл поли-Prep колонку на 100 мкл суспензии кальмодулин путем разрезания конец колонки, чтобы создать плоскую отверстие. Максимально допустимая нагрузка не более 100 мкл суспензии кальмодулин за соlumn, чтобы свести к минимуму количество смолы образец приходит в контакт с во время элюции.
    2. Упаковать колонку под действием силы тяжести и мыть смолы в колонку три раза 5 мл кальмодулин связывающем буфере.
    3. Элюции белка с добавлением 200 мкл кальмодулин элюции буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0; 150 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 5 мМ имидазола, рН 8,0; 4 мМ EGTA, pH 8,0; 0,08% V / об NP-40, 10 мМ β-меркаптоэтанол). Повторите шесть раз добавлением 200 мкл буфера для элюции кальмодулин.
    4. Для ELUTIONS от 1 до 3, нанесите громкость на колонку и соберите элюат немедленно. Для элюирования 4, уплотнение в нижней части колонны и инкубировать с элюирующего буфера в течение 2,5 мин, а затем распечатывает и позволяют вымывается под действием силы тяжести. Для элюции 5, инкубировать в течение 5 мин, а затем распечатывает и элюции. Для элюирования 6, инкубировать в течение 10 мин, а затем распечатывает и элюции.
      Примечание: Целостность комплекса может варьироваться от ELUTIONS / фракции (см репрезентативные результаты раздел) <./ Li>
    5. Диализировать ELUTIONS 2 до 6 индивидуально в течение ночи с использованием соответствующего метода микро диализа. Диализировать фракций против диализного буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0; 150 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 5 мМ имидазола, рН 8, 10 мМ β-меркаптоэтанол).
      Примечание: NP-40 не проходит заметно, если вообще, через диализную мембрану.

4. После очистки Анализы для оценки качества комплекса

  1. Родные гель и окрашиванием серебром
    1. Подготовьте 4 - 16% сборного нативный гель для анализа комплекса в соответствии с инструкциями производителя. Используйте соответствующий стандартный молекулярный вес белка и нагрузки 15 мкл каждого из Диализированный Кальмодулин элюирования / фракций на гель.
    2. Electrophorese геля при 150 В в течение приблизительно 3 ч (4 ° C).
    3. Silver окрашивает гель для оценки качества каждого из шести ELUTIONS. В качестве альтернативы, использовать столь же чувствительный рекламный роликфлуоресцентный краситель (ы). На данном этапе, концентрация комплекса, скорее всего, ниже уровня обнаружения для окрашивания кумасси синим.
  2. Дополнительные методы анализа гель
    1. Для обнаружения белка методом Вестерн-блоттинга, решить комплекс с помощью SDS или нативного PAGE, а затем исследовать гель для Кальмодулин связывания пептида (CBP) эпитопа с использованием TAP тега антитела в соответствии с инструкциями производителя.
    2. Использование конкретного флуоресцентным красителем (ы), подтверждают наличие и целостность белка и / или нуклеиновой кислоты в ТАР очищенный комплекс. Заботьтесь, что никакая спектральное перекрытие не обнаруживается между этими пятнами.
  3. Отрицательный Визуализация Stain электронной микроскопии
    1. Используйте непрерывные сетки углерода свечение разряжен при температуре от -15 мА в течение 30 секунд, в течение 30 мин комплексного применения.
    2. Нанесите 3 мкл TAP очищено комплекса (как правило, при концентрации 1 нМ) в сетке. Выдержите в течение одной минуты. Клякса еПЗУ стороне сетки, чтобы удалить избыток буфера.
    3. Промыть дважды с 20 мкл капель деионизированной воды. Side-блот между стирок.
    4. Применение сетки к 50 мкл отрицательного капли красителя и инкубировать в течение мин. Окрашивание с уранилацетате (2%) или уранила формиат (0,75%) рекомендуется.
      Внимание: уранила соли и растворы слаборадиоактивный и содержат тяжелые металлы. К ним следует обращаться с осторожностью и все материалы, который входит в контакт с этими решениями должны удаляться с соблюдением руководящих принципов институциональных рекомендованных отходов.
    5. Применить сетку на свежий 50 мкл капли негативного красителя, без блоттинга. Выдержите в течение мин, затем боковой блоттинга, и, наконец, воздух сухой и визуализировать.
  4. Крио электронной микроскопии (крио-ЭМ) Визуализация
    1. Выполните крио-ЭМ с TAP очищено комплексом, хотя оптимизация может быть необходимо, в соответствии с протоколом производителя.
      Примечание: Наличие моющих средств при высоких концентрациях мау препятствуют прогрессу и обсуждается ниже.

5. Комплексное хранение

  1. Подготовка комплекса для систем хранения данных
    1. Концентрат комплекс, при необходимости, с использованием центробежного фильтра, имеющего соответствующую молекулярную массу отсечку для комплекса. Спин при 14000 мкг в течение 1 мин с шагом до желаемой концентрации не будет достигнута.
      Примечание: концентрация НП-40 будет возрастать в концентрации во время концентрирования, поскольку она не проходит через фильтр, ни диализной мембраны.
    2. Флэш-замерзнуть комплекс в 30 мкл аликвоты в жидком азоте или с сухим льдом охлаждают ванну этанола, а затем хранят при -80 ° С.
  2. Дополнительно после очистки Удаление детергентов

Примечание: при наличии моющего средства, такие как NP-40, и при концентрации выше, чем его критической концентрации мицелл может затруднять или препятствовать прогрессу в некоторых областях применения. Последствия его удаления из протоCol, а также замену с другими добавками или сорастворителей, обсуждаются ниже. Если нет NP-40 не желательно, вариант заключается в использовании коммерческого применения для удаления, например Bio-Beads.

  1. Предварительно уравновешивания имеющиеся в продаже моющие средства поглощая шарики в диализного буфера. Смешайте пять шариков на 30 мкл комплекса (обычно при концентрации 10 нМ).
  2. Выдержите уравновешенные бусы из стадии 5.2.1 с TAP очищенного комплекса в течение 15 минут на льду. Использование комплекса в течение нескольких часов после удаления моющего средства.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Модифицированный метод ТАР был использован для очистки от S. CEREVISIAE в U1 snRNP, в рибонуклеопротеидные комплекс 18-субъединицу. Первоначальная очистка TAP комплекса после опубликованного протокола 2,3 дали комплекс , который появился гетерогенным, мигрирующие в три полосы на окрашенных серебром родной полиакриламидном геле (Фигура 2А). Несколько раундов оптимизации метода TAP, дали комплекс , который мигрировал в первую очередь одну полосу на родн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метод TAP использует две метки, которые балансируют потребность в жесткой и селективное связывание с аффинной смолой с желанием поддерживать почти физиологических условиях раствора. Этот баланс служит для сохранения устойчивого взаимодействия (ов) меченого белка с взаимодействующими фактора (ов) для определения характеристик после очистки. Кроме того, индивидуальные ТАР меченый ORF, доступны из коммерческих источников, таким образом, что можно получить любой штамм дрожжей с меченый белок для любого дрожжевого комплекса....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарны за поддержку и советы Николаусу Григорьеву. Мы благодарим Анну Лавленд, Акселя Брилота, Чэнь Сюя и Майка Ригни за полезные обсуждения и рекомендации по ЭМ. Эта работа была профинансирована Национальным научным фондом, премия No 1157892. Центр Brandeis EM поддерживается грантом Национальных институтов здравоохранения P01 GM62580.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
S. cerevisiae TAP помеченный штаммOpen BiosystemsYSC1177Это основной штамм дрожжей, использованный для разработки протокола TAP. Его предыстория — S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ 1, леу2 и дельта; 0, met15Δ 0, ura3Δ 0, SNU71::TAP::HIS3MX6
КофемолкаMr. CoffeeIDS77Используется для лизиса клеток
Гемоцитометр, Bright LineHausser Scientific3120Используется для оценки лизиса клеток
JA 9.100 ротор центрифуги Бекман Коултер, Инк.Используется для сбора дрожжевых клеток
ротором центрифуги JA 20 с фиксированным углом наклона BeckmanCoulter, Inc.Используется для очистки клеточного экстракта от нерастворимого клеточного материала
Ti 60 с фиксированным углом наклона центрифугиBeckman Coulter, Inc.Используется для дальнейшего очищения растворимого клеточного экстракта
ТермомиксерEppendorfR5355Температурный шейкер
Novex гелевая системаThermo Fisher Scientific 
Смола IgGGE Healthcare17-0969-01Сефароза 6 с быстрым потоком
Кальмодулиновая смолаAgilent Technologies, Inc.214303Affinity resin
, мини таблеткиSigma Aldrich589297Mini cOmplete ultra EDTA-free таблетки
Коктейль ингибиторов протеазы, большие таблеткиSigma Aldrich5892953cOmplete ultra EDTA-free таблетки
Фенилметансульфонилфторид (PMSF)Растворенные в изопропаноле
2 мл Bio-spin колонкаBio-Rad Лаборатория, Инк.7326008Используется для упаковки и промывки смолы Calmodulin
10 мл поли-преп колонкиBio-Rad Laboratories, Inc.7311550Используется для упаковки и промывки смолы IgG Сборный
железобетон нативные гели PAGE Bis-TrisLife TechnologiesBN1002Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% сборные полиакриламидные гели
NativeMark стандарт белка ThermoFisher ScientificLC0725Неокрашенный стандарт белка, используемый для нативного белка PAGE. Нагрузка 7,5 μ l для окрашенного в серебро геля и 5 μ l для SYPRO Рубиновый окрашенный гель
Сборный SDS PAGE Бис-Трис гелиLife TechnologiesNP0321Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% сборные полиакриламидные гели 
Стандарт белкаPageRuler Thermo Fisher Scientific26614Стандарт неокрашенного белка, используемый для вестерн-блоттинга
SDS беговой буферLife TechnologiesNP00011x NuPAGE MOPS SDS Buffer
TAP антителоThermo Fisher ScientificCAB1001Первичное антитело против метки CBP
Вторичное антителоThermo Fisher Scientific31341Козья противокроличья щелочная фосфатаза конъюгированная
BCIP/NBTThermo Fisher Scientific340425-бром-4-хлор-3-индолилфосфат/нитро синий тетразолиум 
Диалайсные установкиThermo FisherScientific 88401Мини-диализные установки Slide-A-Lyzer
Центробежные фильтрующие установки, 100 кДа MWCOEMD MilliporeUFC5100008Amicon Ultra-0,5 Центробежный фильтрующий блок с мембраной Ultracel-100
Абсорбирующие моющие средстваBio-Rad Laboratories, Inc.1523920Био-шарики SM-2 абсорбенты
SYBR Green IIThermo Fisher ScientificS-7564Флуоресцентный краситель для окрашивания нуклеиновых кислот, при детектировании в присутствии SYPRO Ruby используют длину волны возбуждения 488 нм и длину волны излучения 532 нм
SYPRO RubyMolecular ProbesS-12000Флуоресцентный краситель для окрашивания белков, при детектировании в присутствии SYBR Green II, использовать длину волны возбуждения 457 нм и длину волны излучения 670 нм
Медные сеткиElectron Microscopy SciencesG400-CP
Коктейль ингибиторов протеазы

Ссылки

  1. Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
  2. Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Seraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  3. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: A general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
  4. Vaillancourt, P., Zheng, C. F., Hoang, D. Q., Breister, L. Affinity purification of recombinant proteins fused to calmodulin or to calmodulin-binding peptides. Methods Enzymol. 326, 340-362 (2000).
  5. Braisted, A. C., Wells, J. A. Minimizing a binding domain from protein A. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 5688-5692 (1996).
  6. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
  7. Nallamsetty, S., et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 38 (1), 108-115 (2004).
  8. Ghaemmaghami, S., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
  9. Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comp Funct Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
  10. Cox, D. M., Du, M., Guo, X., Siu, K. W., McDermott, J. C. Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells. Biotechniques. 33 (2), 267-268 (2002).
  11. Gully, D., Moinier, D., Loiseau, L., Bouveret, E. New partners of acyl carrier protein detected in Escherichia coli by tandem affinity purification. FEBS Lett. 548 (1-3), 90-96 (2003).
  12. Tharun, S. Purification and analysis of the decapping activator Lsm1p-7p-Pat1p complex from yeast. Methods Enzymol. 448, 41-55 (2008).
  13. Xu, X., Song, Y., Li, Y., Chang, J., Zhang, H., An, L. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr Purif. 72 (2), 149-156 (2010).
  14. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  15. Gottschalk, A., et al. A comprehensive biochemical and genetic analysis of the yeast U1 snRNP reveals five novel proteins. RNA. 4 (4), 374-393 (1998).
  16. Neubauer, G., Gottschalk, A., Fabrizio, P., Seraphin, B., Luhrmann, R., Mann, M. Identification of the proteins of the yeast U1 small nuclear ribonucleoprotein complex by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (2), 385-390 (1997).
  17. Lucast, L. J., Batey, R. T., Doudna, J. A. Large-scale purification of a stable form of recombinant tobacco etch virus protease. Biotechniques. 30 (3), 544-546 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

IgG SepharoseTEVSDS PAGE
Очистка Native Комплексы для структурного исследования с использованием метода Tag Тандем Affinity
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.