Очистка Native Комплексы для структурного исследования с использованием метода Tag Тандем Affinity

Summary

Метод Tandem Affinity Purification (TAP) широко используется для выделения нативных комплексов из клеточного экстракта, в первую очередь эукариотического, для протеомики. В данной статье представлен протокол метода TAP, оптимизированный для очистки нативных комплексов для структурных исследований.

Abstract

Affinity подходы очистки были успешными в выделении родных комплексов для протеомики характеристик. Структурная неоднородность и степень композиционной неоднородности комплекса обычно не препятствуют прогрессу в проведении таких исследований. В отличие от этого, комплекс, предназначенный для структурной характеристики должны быть очищены в состоянии, которое является как композиционно и структурно однородными, а также при более высокой концентрации, чем требуется для протеомики. В последнее время были достигнуты значительные успехи в области применения электронной микроскопии для определения структуры крупных макромолекулярных комплексов. Это повысило интерес к подходам, чтобы очистить собственные комплексы достаточного количества и качества для структурного определения с помощью электронной микроскопии. Метод Tandem Affinity очистки (TAP) была оптимизирована для извлечения и очистки 18-субъединицу, ~ 0,8 МДа рибонуклеопротеиновый сборка из почкующихся дрожжей (Saccharomyces CEREVISIAE)

Introduction

Многие крупные клеточные процессы осуществляются крупные белковые и белково-РНК комплексов ^1. Существенным препятствием для проведения биофизических и структурных исследований таких комплексов их получения подходящего качества (то есть, однородности) и при соответствующей концентрации. Разделительный комплекс из природного источника имеет много преимуществ, в том числе сохранение соответствующих пост-транскрипционные и / или трансляционные модификации субъединиц и надлежащего страхования сложной сборки. Тем не менее, крупные клеточные комплексы часто присутствуют в клетке при низком числе копий, и очистку должны быть высокоэффективным и происходят....

Protocol

Примечание: Следующий протокол был разработан для очистки комплекса из 4 л клеточной культуры, приблизительно 40 г сырого веса клеток. После приготовления, все буферы должны храниться при температуре 4 ° С и использовать в течение месяца со дня их получения. Восстанавливающие ингибиторы протеазы агента и добавляются только буферы непосредственно перед использованием.

1. Получение полного клеточного экстракта для Tandem Affinity очистки

1. Рост S. CEREVISIAE Клетки
   1. Streak желаемый TAP помеченный S. CEREVISIAE штамм от хранения (-80 ° C) на дрожжевой пептон декстроза (YPD) пластины. Выдержите в течение 3 - 5 д....

Results

Модифицированный метод ТАР был использован для очистки от S. CEREVISIAE в U1 snRNP, в рибонуклеопротеидные комплекс 18-субъединицу. Первоначальная очистка TAP комплекса после опубликованного протокола ^2,3 дали комплекс , который появился гетерогенным, мигрирующие в три полосы на окрашенных серебром родной полиакриламидном геле (Фигура 2А). Несколько раундов оптимизации метода TAP, дали комплекс , который мигрировал в первую очередь одну полосу на родн.......

Discussion

Метод TAP использует две метки, которые балансируют потребность в жесткой и селективное связывание с аффинной смолой с желанием поддерживать почти физиологических условиях раствора. Этот баланс служит для сохранения устойчивого взаимодействия (ов) меченого белка с взаимодействующими фактора (ов) для определения характеристик после очистки. Кроме того, индивидуальные ТАР меченый ORF, доступны из коммерческих источников, таким образом, что можно получить любой штамм дрожжей с меченый белок для любого дрожжевого комплекса........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
S. cerevisiae TAP помеченный штамм	Open Biosystems	YSC1177	Это основной штамм дрожжей, использованный для разработки протокола TAP. Его предыстория — S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ 1, леу2 и дельта; 0, met15Δ 0, ura3Δ 0, SNU71::TAP::HIS3MX6
Кофемолка	Mr. Coffee	IDS77	Используется для лизиса клеток
Гемоцитометр, Bright Line	Hausser Scientific	3120	Используется для оценки лизиса клеток
JA 9.100 ротор центрифуги	Бекман Коултер, Инк.		Используется для сбора дрожжевых клеток
ротором центрифуги JA 20 с фиксированным углом наклона Beckman	Coulter, Inc.		Используется для очистки клеточного экстракта от нерастворимого клеточного материала
Ti 60 с фиксированным углом наклона центрифуги	Beckman Coulter, Inc.		Используется для дальнейшего очищения растворимого клеточного экстракта
Термомиксер	Eppendorf	R5355	Температурный шейкер
Novex гелевая система	Thermo Fisher Scientific
Смола IgG	GE Healthcare	17-0969-01	Сефароза 6 с быстрым потоком
Кальмодулиновая смола	Agilent Technologies, Inc.	214303	Affinity resin
, мини таблетки	Sigma Aldrich	589297	Mini cOmplete ultra EDTA-free таблетки
Коктейль ингибиторов протеазы, большие таблетки	Sigma Aldrich	5892953	cOmplete ultra EDTA-free таблетки
Фенилметансульфонилфторид (PMSF)			Растворенные в изопропаноле
2 мл Bio-spin колонка	Bio-Rad Лаборатория, Инк.	7326008	Используется для упаковки и промывки смолы Calmodulin
10 мл поли-преп колонки	Bio-Rad Laboratories, Inc.	7311550	Используется для упаковки и промывки смолы IgG Сборный
железобетон нативные гели PAGE Bis-Tris	Life Technologies	BN1002	Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% сборные полиакриламидные гели
NativeMark стандарт белка Thermo	Fisher Scientific	LC0725	Неокрашенный стандарт белка, используемый для нативного белка PAGE. Нагрузка 7,5 μ l для окрашенного в серебро геля и 5 μ l для SYPRO Рубиновый окрашенный гель
Сборный SDS PAGE Бис-Трис гели	Life Technologies	NP0321	Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% сборные полиакриламидные гели
Стандарт белка	PageRuler Thermo Fisher Scientific	26614	Стандарт неокрашенного белка, используемый для вестерн-блоттинга
SDS беговой буфер	Life Technologies	NP0001	1x NuPAGE MOPS SDS Buffer
TAP антитело	Thermo Fisher Scientific	CAB1001	Первичное антитело против метки CBP
Вторичное антитело	Thermo Fisher Scientific	31341	Козья противокроличья щелочная фосфатаза конъюгированная
BCIP/NBT	Thermo Fisher Scientific	34042	5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат/нитро синий тетразолиум
Диалайсные установки	Thermo Fisher	Scientific 88401	Мини-диализные установки Slide-A-Lyzer
Центробежные фильтрующие установки, 100 кДа MWCO	EMD Millipore	UFC5100008	Amicon Ultra-0,5 Центробежный фильтрующий блок с мембраной Ultracel-100
Абсорбирующие моющие средства	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1523920	Био-шарики SM-2 абсорбенты
SYBR Green II	Thermo Fisher Scientific	S-7564	Флуоресцентный краситель для окрашивания нуклеиновых кислот, при детектировании в присутствии SYPRO Ruby используют длину волны возбуждения 488 нм и длину волны излучения 532 нм
SYPRO Ruby	Molecular Probes	S-12000	Флуоресцентный краситель для окрашивания белков, при детектировании в присутствии SYBR Green II, использовать длину волны возбуждения 457 нм и длину волны излучения 670 нм
Медные сетки	Electron Microscopy Sciences	G400-CP