Улучшенная полимеразная цепная реакция-рестрикционного фрагмента полиморфизма длины генотипирование Toxic Pufferfish методом жидкостной хроматографии / масс-спектрометрии

Краткое содержание

Усовершенствованный метод полимеразной цепной длины фрагмента реакции-полиморфизм ограничение для генотипирования видов Pufferfish с помощью жидкостной хроматографии / масс-спектрометрии описана. Обратного-фазовой колонке монолита используется для разделения переваренные ампликонов. Этот метод может пролить свет моноизотопном массы олигонуклеотиды, что полезно для идентификации базовой композиции.

Аннотация

Усовершенствованный вариант полимеразной цепной реакции (ПЦР) фрагмента -restriction полиморфизма длины (RFLP) метод для генотипирования токсичных видов Pufferfish с помощью жидкостной хроматографии / ионизацией электрораспылением масс-спектрометрии (ЖХ / МС-ЭРИ) описывается. Выделение ДНК проводят с использованием набора для экстракции ДНК кремнезем мембрана на основе. После ПЦР-амплификации с использованием моющего средства, свободной от ПЦР-буфера, ферменты рестрикции добавляют к раствору без очистки реакционного раствора. Обратного-фазовой колонке монолита и преобразование Фурье масс-спектрометр высокого разрешения с модифицированным KINGDON анализатор ловушки используются для разделения и обнаружения, соответственно. Подвижная фаза, состоящая из 400 мМ 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропанола, 15 мМ триэтиламина (рН 7,9) и метанол, поступает со скоростью потока 0,4 мл / мин. Время цикла для ЖХ анализа / ESI-MS составляет 8 мин, включая уравновешивания колонки. Деконволюция программного обеспечения, имеющего модель распределения изотопов Oе олигонуклеотида используется для вычисления соответствующего моноизотопиче- массы из масс-спектра. Для анализа олигонуклеотидов (диапазон 26-79 нуклеотидов), масса точность была 0,62 ± 0,74 частей на миллион (N = 280) , а также высокую точность и точность были выдержаны в течение 180 ч , без использования стандартного замка массы.

Введение

Масс - спектрометрия (МС) является общепринятой технологией для быстрой и надежной идентификации нуклеиновых кислот, матричной лазерной десорбцией / ионизацией (MALDI) и ионизацией электрораспылением (ESI) используется для ионизации ^1,2. MALDI метод, как правило, в сочетании с временем пролета (TOF) анализатор; Тем не менее, применение MALDI-TOF MS ограничивается короткие олигонуклеотиды (~ 25 нуклеотидов (нт)) в связи с последующей фрагментации, образования аддуктов и низкой эффективностью ионизации ^1,2. В противоположность этому , ESI применима к более длительным олигонуклеотиды (> 100 нт), но многие зарядовые состояния нескольких заряженных ионов ([М-нГн] ^n-) производятся одновременно с биомакромолекулах и, следовательно, масса анализируемого вещества может превышать верхний предел m / z диапазона спектрометра. Это требует интерпретации свернутой спектров, то есть преобразование заряда государственного ряда в соответствующей массыс помощью деконволюции.

В случае измерения массы небольшой молекулы, пик моноизотопном массы, то есть масса молекулы , содержащей только самый общий изотоп каждого элемента является наиболее распространенным и встречающемся в природе ^3. По мере увеличения молекулярного веса, изотопные сдвиги в распределении к более высоким м / г и моноизотопном пика затемняется в зависимости от исходного шума ^3-5. После того , как пик одноизотопные более не определяется для масс , больших , чем 10 кД ^3, средняя молекулярная масса не используется для измерения , а не моноизотопном массы ^5. В таких случаях, изотопное распределение , в котором каждый из индивидуальных пиков , разделенных 1 Da может наблюдаться только тогда , когда масс - анализатор с высоким разрешением , таких как TOF, после преобразования Фурье модифицированного KINGDON анализатору Trap ^6, или преобразование Фурье ионного циклотронного резонанса анализатор используется для анализа. Тем не менее, наиболее распространенный пик sometimes не согласуется со средней молекулярной массой ^5. Эти проблемы могут привести к трудностям для точного определения аналитов.

Учитывая различия в естественном содержании стабильных изотопов и трудности в определении средней молекулярной массы, измерение моноизотопном массы идеально подходит для массового характеристики биомолекул ^3,4. На практике, может ли наблюдаться моноизотопной пик или нет, моноизотопном массы можно оценить путем сравнения картины наблюдаемого изотопного распределения к теоретической , рассчитанной из модели аналита ^4,7-10. Фитинг алгоритм ⁸ теперь включены в проприетарное программное обеспечение.

В контексте ESI-MS, диссоциация ДНК - дуплекс, очистки и обессоливания необходимы для непосредственного измерения , чтобы избежать провала ионизации за счет подавления ионов и аддукта ^2,10-14. Эти процедуры являются troublesome, тем не менее, полностью автоматизированные аналитические системы были разработаны коммерчески с участием полимеразной цепной реакции (ПЦР), пробоподготовки и ESI-MS для обнаружения возбудителей ^15-20. Другой подход представляет жидкостной хроматографии (LC) для разделения. LC обеспечивает он-лайн разделение аналитов из сосуществующих веществ и не требует трудоемкой подготовки образцов до ионизации ^21,22. Тем не менее, отделение нуклеиновых кислот с использованием MS-совместимой подвижной фазы является более трудным, чем для большинства других соединений, таких как лекарственные средства, пептиды и белки в связи с полианионная природы нуклеотидов. Наиболее успешные примеры LC / ESI-МС включают использование ионно-пары с обращенной фазой LC. Подвижная фаза 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропанол (HFIP) -triethylamine (ТЕА) -метанола первоначально был предложен Apffel и др. Для выделения и обнаружения коротких олигонуклеотидов ^23. Применение LC / ESI-MS генотипирования для differentiatioп видов патогенных микроорганизмов, однонуклеотидных полиморфизмов и короткие тандемные повторы сообщается с использованием капиллярного полимер-монолитный столбец , который может отделить более длинные олигонуклеотиды ^1,21,24-33.

В Японии и Соединенных Штатах, серьезное пищевое отравление произошло из - за неправильной идентификации и несоответствующей подготовки Pufferfish, и это несмотря на то , что распределение и подготовка Pufferfish строго контролируется законодательством безопасности пищевых продуктов ^34,35. Более того, умышленное убийство с использованием экстракта Pufferfish имело место в Японии ^36. Таким образом, дифференциация видов Pufferfish требуется как от общественного здравоохранения и судебно-следственных точек зрения. Кроме того, поскольку Бурый Скалозуб гораздо дороже , чем другие виды Pufferfish, возможность дифференциации также необходима в контексте мошенничества еды исследований.

Здесь, подробный способ определения мonoisotopic масса продукта ПЦР с помощью ЖХ / ESI-MS с использованием обращенно-фазовой колонке монолита и масс-спектрометра высокого разрешения описывается. В частности, подход был разработан , чтобы обеспечить дифференциацию токсичных видов Pufferfish , основанных на использовании ПЦР полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) метод ^37, который является первым примером для видовой дифференциации животных с использованием MS.

Протокол

1. ДНК-экстракции

Примечание: Используйте отдельную комнату для экстракции ДНК и пост-ПЦР обследований, таких как гель-электрофореза и LC / ESI-MS. Добавить этанол в промывочный буфер 1 (содержащий гидрохлорид гуанидина) и промывочного буфера 2 (не содержащий гуанидин гидрохлорид) в соответствии с протоколом набора для экстракции ДНК. Образцы рыбы были получены из рыбы оптовых и розничных рынках в Японии.

1. Поместите 30-50 мг ткани рыбы в 0,5 мл или 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Раздавите ткани с помощью микро-шпателем (для плавника и кожи, за исключением).
   Примечание: В случае плавник, используют 0,5 мл трубки для замачивания.
2. Добавить 180 мкл буфера для лизиса и 40 мкл протеиназы К и вихревые кратко. Инкубируют при 56 ° C на нагревательном блоке в течение 2 часов или в течение ночи. Смешайте кратко вортексе каждые 15 мин во время инкубации.
   Примечание: Полный лизис не нужно.
3. Центрифуга в течение 5 мин при 13000 х г. После центрифугирования, если небольшая AMOUNT нефти существует на поверхности, в случае жирного образца, таких как печень, выбросить его. Передача супернатант в новую 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
4. Добавить 200 мкл буфера, содержащего хаотропном гидрохлорид гуанидина и перемешивают встряхиванием. Добавить 200 мкл этанола (99,5%) и смеси встряхиванием снова.
5. Перенести смесь в ротационную колонку, помещенного в пробирку для сбора 2 мл. Центрифуга в течение 1 мин при 13000 х г. Выбросьте проточные.
   Внимание: Не добавляйте отбеливателя отходов, потому что гуанидина может образовывать высокоактивные соединения с отбеливателем.
6. Добавьте 500 мкл промывочного буфера 1 (содержащего гуанидин гидрохлорид) и центрифугировать в течение 1 мин при 13000 х г. Откажитесь от потока через и пробирку для сбора.
7. Поместите колонку спина в новой коллекции трубки 2 мл, снабженный комплектом. Добавьте 500 мкл промывочного буфера 2 и центрифугировать в течение 3 мин при 20000 х г. Откажитесь от проточных и пробирку для сбора. Перенесите столбец спина к новому1,5 мл микроцентрифужных трубки.
8. Пипеткой 200 мкл буфера для элюции в центре мембраны ротационную колонку. Через 1 мин, центрифуги в течение 1 мин при 6000 х г.
9. Пипеткой 50 мкл элюата к одноразовому УФ кювету и измеряют УФ-спектр элюата при 220-300 нм и оптическую плотность при длине волны 260 нм с использованием спектрофотометра.
10. Проверка УФ-спектр ДНК с максимумом при 260 нм. Рассчитать примерную концентрацию ДНК с помощью простого уравнения "концентрации ДНК (нг / мкл) = оптическую плотность при длине волны 260 нм х 50".
    Примечание: Типичная концентрация ДНК , выделенную из плавников Pufferfish составляет 63 ± 30 нг / мкл (п = 20).
11. Если концентрация ДНК превышает 10 нг / мкл, разбавленные образцы ДНК с Трис-ЭДТА (ТЕ) буфера (рН 8) до 5 нг / мкл.
12. Храните образец при температуре -20 ° C или перейти к ПЦР-амплификации (раздел 2).

2. ПЦР

1. Установите 25 мкл ПЦР для каждого ЕхПИдействовал образец ДНК, положительный контроль (0,2 мкМ синтезированные олигонуклеотида , имеющего последовательность - мишень в ТЕ буфере , рН 8,0) и отрицательного контроля (ultrapurified воды вместо образца ДНК) на льду в таблицах 1 и 2 на чистом столе , чтобы избежать загрязнения.
   Примечание: Для удобства эксплуатации, сделать достаточное количество коктейля, содержащего все реагенты без матричной ДНК и отказаться от этого. С помощью ДНК-полимеразу, обладающую активностью проверочного считывания, чтобы избежать добавления 3 'A заходы на ПЦР-продукта.
2. Проведение ПЦР - амплификации по термическому датчику циклов с использованием программы цикл , как показано в таблице 3.

3. ферментативным расщеплением

1. Добавляют 2 мкл раствора , содержащего 100 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 100 мМ MgCl _2, 10 мМ дитиотреитола и 500 мМ NaCl в раствор для ПЦР.
2. Добавляют 1 мкл каждого фермента рестрикции (DRA I и Msp I) и аккуратно перемешать. Инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С на йErmal велосипедист.
3. Выдержите в течение 5 мин при 72 ° С, чтобы активировать оставшуюся ДНК-полимеразы, заполняющее липким концом, генерируемый Msp I.
4. Дополнительно: Анализ каждого 2,5 мкл реакционного раствора путем электрофореза в полиакриламидном геле с использованием кросс соотношение тяги (% C, процент бис-акриламида) 3,33 (вес%) и концентрацию в полиакриламидном геле (% Т) 15 (% вес / об) ^38. Пятно гель с использованием флуоресцентным красителем ДНК и наблюдать двухцепочечной ДНК на синем света просвечивания с использованием экрана янтарный.
5. Реакционную смесь фильтруют раствор с 0,2-0,5 мкм центробежный фильтр устройства, поддерживающего для предотвращения засорения, которое может повредить аналитическую колонку.
6. Перенесите фильтрат в коническом флаконе полипропилена и хранят при -20 ° C до проведения анализа.

4. ЖХ / МС-ЭРИ Анализ

1. Взвешивание 67,2 г (приблизительно 42 мл) ГФИП и 1,52 г (приблизительно 2,0 мл) чая в 1 л бутылку. Добавить 955 мл воды ultrapurified (ЖХ / МС ГРАде) и перемешивают с помощью магнитной мешалки до тех пор пока реагенты полностью не растворится. Берут аликвоту раствора и проверить рН (между 7,85 и 7,95, в идеале рН = 7,9), используя рН-метр.
   Примечание: Не вернуть аликвоты к бутылке, чтобы избежать загрязнения ионами металлов. Если значение рН не 7.9, добавить небольшое количество либо ГФИП или TEA для регулирования рН и измерения рН снова.
2. Подключите бутылку к линии А жидкостного хроматографа с охлаждением бутылки с использованием прямого охлаждения портативного холодильника (для домашнего использования), чтобы предотвратить испарение. Подключите другой бутылку с метанолом до линии В.
3. Подключите колонки охраны и аналитическую колонку (2,0 х 50 мм, размер мезопор = 30 нм) к жидкостный хроматограф. Начало протекающий начальный подвижной фазы (95% A и 5% B) для уравновешивания колонки.
4. Готовят 0,5 мг / мл натрия трифторацетат (рН 3,5) в качестве калибрующего ^39.
   1. Взвешивают 50 мг (приблизительно 34 мкл) трифторуксусного переменногоID в химическом стакане.
   2. Добавить 30 мл воды ultrapurified и титруют до рН 3,5 с помощью 10 мМ гидроксида натрия с помощью рН-метра.
   3. Заполнить до 50 мл с ultrapurified водой. Добавьте 50 мл ацетонитрила (LC / MS класса) и перемешать.
   4. Отбирали часть рабочего раствора и хранить его при комнатной температуре. Хранить остаток раствора при 4 ° С.
5. Снизить давление азота в C-ловушки следующим образом.
   Примечание: преобразование Фурье Последние масс-спектрометры, которые подходят для неповрежденной анализа белков, имеют программное обеспечение управления для контроля давления.
   1. Снимите левую верхнюю крышку масс-спектрометра. C-ловушка клапан находится в углу слева на переднем плане.
   2. Проверить значение давления высокого вакуума в окне состояния инструмента программного обеспечения управления.
      Примечание: Значение , как правило, 3 × 10 ^-8 бар.
   3. Потяните ручку, чтобы разблокировать и повернуть ручку против часовой стрелки очень медленно, чтобы уменьшить высокий вакуумный прессЮр до 1/3 ( как правило, 1 х 10 ^-8 бар). Указанное давление должно постепенно изменяться в замедленном режиме. Не обращайте внимания на предупреждающее сообщение о низком давлении. Нажмите ручку, чтобы зафиксировать.
   4. Восстановить верхнюю крышку для безопасности.
6. Калибровка масс - спектрометра с использованием трифторацетата натрия ^39.
   Примечание: калибровка Ежедневная масса может быть заменен этим протоколом, однако, рекомендуемая калибровка предложенном производителем должны быть завершены до этой калибровки.
   1. Настройка параметров сканирования и параметров источника нагретые ESI в блоке управления инструментом программного обеспечения настройки следующим образом: тип сканирования полный MS; сканирования диапазона м / з 500-4,000; фрагментация (в исток столкновения индуцированной диссоциации (ИДС) напряжение 60 эВ; полярность отрицательная; автоматическая регулировка усиления (AGC) цель 1 × 10 ^6, максимальное время инъекционные 50 мс, скорость потока газа 5 оболочки; Окс скорость потока газа 0; продувочный газ скорость потока 0; распылить напряжение 3 кВ; капиллярная температура 320 ° С; S-объектив радиочастотная (RF) уровень 100; Температура нагревателя 30 ° C.
      1. Введите список отрицательных ионов, подлежащих мониторингу , как m / z 792,85908, 1064,80870, 1336,75832, 1608,70794, 1880,65755, 2152,60717, 2424,55679, 2696,50640, 2968,45602, 3376,38045.
   2. Перемещение с подогревом ESI зонд ближе к границе раздела масс-спектрометра (положение B). Подключите датчик и шприц с трубкой.
   3. Влить калибрующего постоянно при скорости потока 10 мкл / мин с помощью встроенного шприцевой насос. Проверьте только 6 меньшую массу ионов (m / z 792.85908-2152.60717) в настраиваемой таблице калибровки.
      1. Продолжайте калибровку после того, как интенсивность сигналов стабилизируются. После калибровки, проверьте только шесть большей массой ионов (m / z 1880.65755-3376.38045) и продолжить процесс калибровки. Избегайте калибровки с использованием всех ионов сразу, чтобы избежать неудачи.
7. Перемещение зонда к appropriaт.е положение при скорости потока 0,4 мл / мин (положение D) и подключить к жидкостный хроматограф с металлической трубкой инертным.
8. Установите параметры источника ESI нагретые в блоке управления инструментом программного обеспечения настройки следующим образом: скорость 50 потока газа оболочки; Скорость потока газа AUX 15; подметать расхода газа 1; распылить напряжение 2,5 кВ; капиллярная температура 350 ° C; S-объектив РФ уровень 100; температура нагревателя 350 ° C.
9. Установить параметры приобретения масс-спектрометра в инструментальном окне настройки следующим образом: продолжительность метод 8 мин; переадресовать клапан, 3.5-6 мин до масс-спектрометра, 0-3,5 и 6-8 мин для отходов; Среда выполнения 3.5 до 6 мин; полярность отрицательная; в исходном УУР напряжении 15,0 эВ; microscans 3; Номинальная мощность разрешение (при м / з 200) 140000; Мишень AGC 1 × 10 ^6; максимальное время ионов 50 мс; количество сканирований 1; сканирования диапазона м / з 700-3,500; Спектр тип данных профиля.
10. Установить параметры жидкостного хроматографа следующим образом: колонка температуры печи 20 ° C; SAMPLе температура лотка 10 ° С; Градиент программа 0-0,5 мин 5% В, 0,5-1 мин 5-30% В, 1-3,5 мин 30-40% В, 3,5-5 мин 40-98% В, 5-6 мин 98% В, 6- 6,05 мин 98-5% В, 6.05-8 мин 5% В; скорость потока 0,4 мл / мин.
11. Purge пузыри, нажав на дно флаконов. Установите образцы чаш на стойке образца и вводят 1,0 мкл образца с помощью пробоотборника, чтобы начать анализ.
12. Открыть файлы исходных данных с помощью программного обеспечения браузера и подтвердить, что все приобретения будут успешно завершены, в том числе положительных и отрицательных контролей.
    Примечание: Как правило, два или три пика будет наблюдаться в общем ионного тока хроматограмме при времени удерживания 4-5,5 мин при рыбу фугу ДНК успешно усиливается и переваривается.

5. Деконволюция и интерпретация

1. Запустите программу деконволюции. Выберите тип эксперимента "автоматический экстракт (изотопно разрешен)".
2. Изменение метода с использованием следующих параметров: выходной массы М; S / N threshold 3, относительное обилие порог 0; отрицательный заряд да; вычислить извлекаемого ионного тока хроматограмме (XIC) да, диапазон м / з 700-3,500; носителей заряда H ^+; Минимальное количество обнаруженного заряда 3; Изотоп соотношение нуклеотид; пригодный коэффициент 80%; остаток порог 0%; рассмотреть возможность перекрытия да; зарядки диапазон 3-50; минимальная интенсивность 1; Ожидается ошибка интенсивности 3.
   1. Сохранить как новый метод и выберите его.
3. Выберите каталог, в котором существуют исходные файлы данных. Выберите файлы исходных данных, подлежащих анализу и нажмите кнопку "Добавить в очередь" кнопку.
4. Нажмите кнопку "Выполнить" на вкладке "Run Queue" для запуска деконволюции.
5. После того, как очередь будет завершена, выберите строку и нажмите кнопку "Открыть" Результат в верхней подписи, чтобы получить результаты деконволюции.
6. Интерпретировать результаты моноизотопном масс , полученных из пиков при времени удерживания 4-5,5 мин с использованием таблице 4.

Результаты

Три коммерчески доступные колонки были оценены для разделения длинных олигонуклеотидов при расходе 100-400 мкл / мин. Широкоэкранном поре октадецил углеродной цепи (С ₁₈₎ колонка -bonded частиц диоксида кремния (а), коммерчески доступный поли (стирол-дивинилбензола) (PS-DVB) монолит колонка (б) и -bonded кремнезем колонка монолит С ₁₈ ( с) были сопоставлены (рисунок 1). Три пары дуплексов ДНК (26, 37 и 53 п.н.) были разделены с использованием всех столбцов, а -bonded колоночная монолит С ₁₈ использовали в последующих исследованиях.

Типичные результаты для анализа образца ДНК , извлеченной из мышцы T. rubripes показана на рисунке 2. Изотопически разрешенных пиков, как это показано на рисунке 2а, необходимы для успешного расчета моноизотопиче- массы. Теоретическое и тезряться одноизотопные масса Т. rubripes показаны на рисунке 2b. Поскольку переваривание с эндонуклеаз осуществляется сразу после ПЦР-амплификации без очистки, 3'-липким концом, порожденный МПВ I эндонуклеазы заполняется оставшейся ДНК-полимеразы. В соответствии с анализом ампликонов , полученных из синтетических ДНК - матриц, массовая точность в диапазоне от -2.48 до 2,40 частей на миллион (0,62 ± 0,74 частей на миллион в среднем, п = 280). Таким образом, массовый допуск 3 частей на миллион был использован для дифференциации видов (таблица 4). С помощью таблицы, все образцы , полученные из Pufferfish рынков и магазинов были должным образом дифференцированы в качестве конкретных видов ^37.

В соответствии с периодическим анализом образца , полученного из шаблона синтетической ДНК Т. Chrysops, все моноизотопные массы аналитов были успешно определены в пределах ± 3 промилле , по крайней леAST 180 ч без каких - либо массовой калибровки (рисунок 3). Это означает, что масса калибровки потребуется на еженедельной основе.

Рисунок 1: Общее количество ионного тока хроматограммы продукта ПЦР-ПДРФ , полученный из шаблона синтезированной ДНК Т. Pardalis , используя колонку с C ₁₈ -bonded частиц кремнезема (а, 3 × 250 мм, размер частиц 3 мкм), поли (стирол-дивинилбензола) (ПС-ДВБ) монолит колонка (б, 1,0 × 250 мм) , и С ₁₈ -bonded колонка монолита кремнезема (с, данный способ) условия (а):. скорость потока 0,2 мл / мин; Отношение метанола, 0-2 мин 5%, 2-5 мин 5% -25%, 5-20 мин 25% -40%, 20-35 мин 40% -98%, 35-50 мин 98%, 50- 51 мин 98% -5%, 51-65 мин 5%. Условия (б):скорость потока 0,1 мл / мин; Отношение метанола, 0-2 мин 5%, 2-5 мин 5% -25%, 5-35 мин 25% -40%, 35-40 мин 40% -98%, 40-55 мин 98%, 55- 56 мин 98% -5%, 56-70 мин 5%. Температура для обеих колонн составляла 20 ° C. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Представитель результаты анализа первичных мышцы T. rubripes. (а) Типичные суммарный ионный ток хроматограммы и масс - спектр. (Б) Теоретические и измеренные моноизотопные массы ПЦР-ПДРФ продуктов , полученных из шаблона синтезированной ДНК Т. rubripes. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большоег версии этой фигуры.

Рисунок 3:. Тест на стабильность дайджестом ампликонов , полученных из синтетической ДНК T. Chrysops анализировали через каждые 10 ч. Масса калибровка не была выполнена во время теста. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

имя	Последовательность
lago86F	5'-3'-CCATGTGGAATGAAAACACC
taki114F	5'-3'-AAAAACAAGAGCCACAGCTCTAA
fugu86-114R	5'-3'-CCCTAGGGTAACTCGGTTCG

Таблица 1: ПЦР - праймеры.

реагент ПЦР	Объем используется	Конечная концентрация
Ultrapurified вода	15,75 мкл
Моющее средство свободной 5x буфера	5,0 мкл	1x
дНТФ смесь (10 мМ каждый)	0,5 мкл	0,2 мМ
Грунтовка смесь (10 мкМ каждого из lago86F, taki114F и fugu86-114R в ТЕ буфере, рН 8,0)	1,0 мкл	0,4 мкМ каждого
ДНК-полимеразы (2,5 ед / мкл)	0,25 мкл	0,1 ед / мкл
Шаблон ДНК в ТЕ буфере, рН 8,0 (5.0-10 нг / мкл для извлеченного образца, 0,2 мкМ для синтетической ДНК в качестве положительного контроля)	2,5 мкл	0,5-1,0 пг / мкл для ДНК, извлеченной и 20 нМ для синтетической ДНК
	Всего: 25 мкл

Таблица 2: Компоненты 25 мкл ПЦР - шкале.

цикл	Состояние	функция
1	2 мин при 95 ° C	Первоначальная денатурация
2	30 с при 95 ° C	денатурация
3	30 с при 56 ° C	отжиг
4	30 с при 72 ° C	относительное удлинение
5	Повторить 2-4 (всего 30 циклов)
6	7 мин при 72 ° C	Final удлинение
7	Удержание при 12 ° С до удаления образца

Таблица 3: Программа ПЦР.

Пиковое количество при времени удерживания 4,0-5,5 мин	Моноизотопных масса третьего пика в диапазоне (Da)		Моноизотопных масса второго пика в диапазоне (Da)		виды Pufferfish
	Меньший нить	Изображение большего размера нити	Меньший нить	Изображение большего размера нити
2	→	→	15890.707-15890.803	16177.531-16177.629	Л. тепшз
			15921.702-15921.797	16146.537-16146.634	Л. gloveri
			15930.713-15930.809	16137.525-16137.622	L. Lunaris
			15937.697-15937.792	16131.537-16131.634	Л. wheeleri
			24173.034-24173.179	24566.905-24567.053	Т. Chrysops
3	16295.706-16295.804	16467.610-16467.709	11341.851-11341.919	11466.875-11466.944	Т. Pardalis Т. snyderi Т. ocellatus Т. xanthopterus Т. stictonotus
			11654.908-11654.978	11770.920-11770.991	Т. niphobles
	16296.701-16296.799	16468.605-16468.704	→	→	Т. rubripes
	16311.701-16311.799	16452.610-16452.709	→	→	Т. poecilonotus Т. exascurus
	16320.713-16320.811	16443.599-16443.697	→	→	Т. porphyreus Т. Obscurus
	16599.751-16599.851	16780.667-16780.767	→	→	Т. vermicularis

Таблица 4: Дифференцирование Pufferfish из моноизотопических масс , полученных из ЖХ / МС-ЭРИ.

Таблица 5: амплифицированной последовательности ДНК (а) последовательность идентична.что из других видов Pufferfish , как описано в таблице 4. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.

Обсуждение

Для того, чтобы извлечь ДНК, коммерческий набор для экстракции ДНК из крови и тканей используется в соответствии с протоколом производителя с незначительной модификацией (количества протеиназы К и центрифугирование раствора для лизиса). Тем не менее, любой набор для выделения может быть использован до тех пор, как клеточной ДНК может быть извлечена с соответствующим восстановлением и чистоты для ПЦР. Этот метод был протестирован с использованием мышц, FIN, печени, яичников и кожи ^37. Fin особенно подходит из - за большой площади поверхности, что дает возможность быстрого лизиса протеиназой К. свежие, мороженые, сушеные, вареные и запеченные образцы Pufferfish были успешно испытаны ^37.

Набор праймеров ПЦР (таблица 1) предназначена для Pufferfish и усиливает митохондриальной 16S рибосомальной РНК гена из Pufferfish. ДНК - мишень для амплификации составляет 114-115 пар оснований (род Takifugu) и 86 пар оснований (род Lagocephalus) (таблица 5). Для облегчения метода developmeнт, использовались синтезированные олигонуклеотиды, имеющие последовательности-мишени для справки, а не собирать подлинные образцы Pufferfish. Набор праймеров может быть заменен другим набор праймеров в ответ на цели, тем не менее, конечная длина ДНК после ферментативного расщепления должна быть не менее 100 нт с точки зрения поддержания качества масс-спектра, необходимого для успешного деконволюции. Кроме того, давление азота в C-ловушки должна быть уменьшена, когда целевой олигонуклеотид больше, чем приблизительно 75 нт, а качество масс-спектра недостаточна для успешного деконволюции. Такие ограничения могут контролироваться с помощью последних разработок в области программного обеспечения устройства, в противном случае клапан для C-ловушки внутри корпуса должны быть настроены, как описано в разделе протокола. Что касается подготовки проб, использование моющих средств , свободных от реагентов имеет решающее значение для последующего LC с точки зрения соответствующей формы пика, достаточной интенсивности пика и стабильным временем удерживания ^31.

Микросотовый-ДВБ капиллярная колонка монолит ^21,24-33, C ₁₈ с обращенной фазой ^23,40,41 в виде частиц диоксида кремния и хроматографии гидрофобного взаимодействия (HILIC) колонка ⁴² были использованы для LC / ESI-МС анализ олигонуклеотидов. Среди них, капиллярная колонка монолит превосходит другие с точки зрения способности разделения, однако, капиллярная колонка монолита используется в последних исследованиях было сделано в доме и работает при низкой скорости потока (2 мкл / мин), что требует приборов посвященный микро-LC. Для облегчения операции, коммерчески доступные столбцы были оценены для разделения длинных олигонуклеотидов при более высоких скоростях потока (100-400 мкл / мин). Три пары дуплексов ДНК (26, 37 и 53 п.н.) были разделены с использованием указанных выше столбцов, однако, длительность цикла подачи -bonded колонны в виде частиц диоксида кремния C ₁₈ и колонки PS-ДВБ монолита были 65 и 70 мин, соответственно , в то время как у с _{18 -bonded колонка монолита составляла 8 мин (Рисунок 1). Принимая быстрый анализ во внимание, колонка монолита C 18 -bonded был выбран для наших целей , несмотря на ограниченные возможности разделения; однако остальные две колонны, могут быть использованы, когда требуется улучшенное разделение. Теоретически, в случае колонны монолита, нет интерстициального объема и подвижная фаза будет вынуждена течь через поры твердой фазы при сохранении последовательной длины пути, таким образом , что позволяет эффективное разделение ^27. Такие процессы будут проявляться, в частности, при анализе биомакромолекулах таких как олигонуклеотид, как медленной диффузии крупных молекул. Одним из практических достоинств колонны монолита является то , что обратное давление ниже , чем у колонке с диоксидом кремния частиц ^27. Несмотря на высокой скорости потока (400 мкл / мин) и низкой температуре колонки (20 ° C), максимальное обратное давлениеСистема была 12,5 МПа ^37. Это первая демонстрация преимущество -bonded колонны монолита в C 18 для быстрого анализа длинного олигонуклеотида. Из-за большой скорости потока воды, выделенный инструмент для микро-LC и точного выравнивания на границе раздела не требуется. Вместо этого нагретый ЭРИ зонд требуется диссоциировать ДНК-дуплекса и помочь ионизацию ДНК, как описано позже.}

Ионно-пара-хроматографии обычно используется для МС-совместимого разделения олигонуклеотидов. Тем не менее, реагент, ионную пару, как правило вмешивается в процесс ESI и снижает чувствительность ESI-MS. Поэтому HFIP часто используется для подвижной фазы, чтобы улучшить чувствительность олигонуклеотида. Тем не менее, HFIP (точка кипения 59 ° С) быстро испаряются на границе раздела до того (точка кипения 65 ° С) , метанол , и, следовательно, эта потеря растворителя повышает рН и способствует диссоциации реагента ионной пары (т.е., ТЭА)от олигонуклеотида. Поскольку настоящий способ использует нагретый ESI зонд, который nebulizes элюата с горячим газообразным азотом при 350 ° С, этот эффект может быть преувеличена. Вместо того , чтобы HFIP-TEA буфера, Эрба и Oberacher рекомендовал cyclohexyldimethylammonium ацетат (CycHDMAA, рН 8,4) для анализа генотипирования из - за снижения образования аддуктов с трассировка ионами металлов ^33. Авторы сделал вывод, что само по себе CycHDMAA подавлено образование металлического аддукта. Несмотря на литературу, образование значительное аддукт не наблюдалось в настоящем способе. Кроме того, следует отметить преимущество системы HFIP-ТЭА-метанол , что площадь пика , полученный с системой HFIP-ТЭА-метанол в 17 раз больше , чем полученный из CycHDMAA-ацетонитрил системы при анализе ампликона 86 п.н. Т. poecilonotus (данные не показаны). Одним из недостатков системы HFIP-ТЭА-метанол, тем не менее, является увеличение стоимости по сравнению с CycHDMAA-ацетонитрил системы.

Расчет моноизотопном массы требует разделения изотопных пиков многозарядных ионов. Таким образом, разрешение является критическим для настоящего анализа. Несмотря на то необходимая мощность разрешение зависит от длины пары оснований аналита, обычные TOF анализаторы, которые имеют разрешающую способность нескольких десятков тысяч, может быть ограничено для анализа коротких олигонуклеотидов.

Теоретические моноизотопные массы , показанные в таблице 4 , были рассчитаны из соответствующих базовых композиций аналитов. В качестве альтернативы, Muddiman и др. Разработали программное приложение для расчета базовой композиции из точной массы ^43. Аналогичная программа была интегрирована в автоматизированную систему ESI-MS ^16-18. Использование этих алгоритмов может повысить надежность данного способа, так как измеренный одноизотопные масса не всегда соответствует уникальной базовой композиции Oкрыло к массовой допуском 3 промилле в результате неизбежной погрешности измерения. К сожалению, мы не смогли получить эти программные продукты для настоящего исследования.

Настоящее определение видов одноизотопные массы на основе могут быть пригодны не только для дифференциации Pufferfish, но и для обнаружения других полиморфизмов ДНК, так как данный способ основан на анализе базовой композиции и не включает в себя процедуры, специально предназначенные для Pufferfish. Что касается обнаружения полиморфизма ДНК, выделенная система ESI-МС полностью автоматизирован и прост в эксплуатации, которые могут быть пригодны для диагностического применения , таких как обнаружение патогенных микроорганизмов ^{15,17,18,20,30.} С другой стороны, данный способ является осуществимым с общих исследовательских инструментов и аппаратов и, следовательно, пригодных для применения в исследовательских целях. ESI-MS уже был применен к полиморфизма ДНК человека , такие как полиморфизм единичного нуклеотида ^13,28,32, коротких тандемных повторов ²⁶И митохондриальной ДНК analsis ^16,19. Микро РНК также анализировали с помощью капиллярной ЖХ / ESI-MS ^44. Эти опубликованные заявки также могут быть реализованы в соответствии с настоящим способом. Кроме того, этот метод может быть пригоден для мониторинга взаимодействия между олигонуклеотидом и низким молекулярным весом соединений, таких как взаимодействие антибиотиков и рибосомальной РНК ⁴⁵ вследствие разделения низкотемпературной. В таких случаях, олигонуклеотиды и низкомолекулярных соединений веса должны быть обнаружены одновременно, что является преимуществом использования LC / ESI-MS.

Существует ограничение, что аппаратура не подходит для проведения параллельного анализа, как и в обычных методов, таких как Sanger секвенирования и ПЦР в реальном времени. Кроме того, способ согласно настоящему изобретению идентифицирует только базовый состав и любое основание, подмена в пределах одной молекулы не могут быть выделены. Тем не менее, МС-анализ на основе ДНК, описанный здесь, возможно, еще заслугу в срокs точности по сравнению с ДНК-связывающего методы на основе красителей, таких как гель-электрофорез и ПЦР в реальном времени.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DNeasy Blood & Набор для салфеток (50)	Qiagen	69504	Набор для экстракции ДНК
Proteinase K	Qiagen	19131
Этанол (99.5+ об.%)	Wako	054-07225	Для разведения буферов промывки
TE buffer (pH 8.0)	Wako	310-90023	Для разведения образца ДНК
ПЦР праймер	Fasmac	NA	Очищен с помощью картриджной колонки обратной фазы от поставщика
Шаблон DNA	Eurofins Genomics	NA	Очищен ВЭЖХ поставщиком
Ультраочищенная вода	NA	NA	Сгенерирована с помощью системы прямой очистки воды Milli-Q (Merck Millipore), использована для подготовки образцов Моющее
средство Free 5x Phusion HF Buffer	Thermo Fisher	F-520L	Использование вместо предоставленного буфера ДНК-полимеразы
Pfu-X ДНК-полимеразы	Jena Bioscience	PCR-207S
dNTP смесь (по 20 мМ каждая)	Jena Bioscience	NA	Поставляется с ДНК-полимеразой
10 раз; Универсальный буфер M	Takara Bio	NA	содержит 100 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 100 мМ MgCl2, 10 мМ дитиотреитол и 500 мМ NaCl
Dra I	Thermo Fisher	FD0224	Фермент рестрикции
Msp I	Thermo Fisher	FD0544	Фермент рестрикции
1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропанол (HFIP)	Fluka	42060-50ML	Добавка к элюенту для класса LC-MS.
Триэтиламин (TEA)	Fluka	65897-50ML	Добавка к элюенту для класса LC-MS.
Трифторуксусная кислота	Sigma-Aldrich	T6508	Для приготовления калибра.
Гидроксид натрия (1,0 М)	Fluka	72082	разбавить до 10 мМ ультраочищенной водой и использовать для титрования трифторуксусной кислотой.
Ацетонитрил	Fluka	34967	Для приготовления калибра, класс LC/MS.
Метанол	Kanto	25185-76	Для подвижной фазы, марка LC/MS.
Вода	Thermo Fisher	W6-1	Для подвижной фазы, класс LC/MS.
Микроцентрифужная пробирка (0,5 мл)		Eppendorf	PCR clean grade
(1,5 мл)	Eppendorf	0030123328	PCR clean grade
UVette	Eppendorf	0030106300	одноразовая УФ-кювета.
Гель зеленый	Biotium	41004	Флуоресцентное окрашивание ДНК
Cosmospin filter G (0,2 μ m)	Nakalai Tesque	06549-44	Изготовлен из гидрофильной мембраны политетрафторэтилена (ПТФЭ). Любой центробежный фильтрующий блок (размер пор, 0,2– 0,5 μ н) изготовлен из гидрофильного ПТФЭ или другой мембраны с низкой связываемостью.
300 μ l Винтовой флакон из полипропилена	Американские хроматографические расходные материалы	V0309P-1232
Предварительно собранная винтовая крышка и перегородки	Finneran	5395-09R
Monobis C18 аналитическая колонка (2,0 раза; 50 мм, размер мезопоры = 30 нм)	Kyoto Monotech	2050H30ODS	за пределами Японии, доступно для покупки у GL Sciences через дистрибьюторов. (http://www.glsciences.com/distributors/)
Защитная колонна Monobis C18	Kyoto Monotech	GCSET-ODS3210	Держатель в комплекте.
Cadenza CW-C18 (в 3,0 раза; 250 мм)	Imtakt	CW036	C18-bonded particle silica column
ProSwift RP-4H (1,0&крат; 250 мм)	Thermo Fisher	066640	Поли(стирол-дивинилбензол) монолитная колонна
Themo Mixer C	Eppendorf	5382 000.023	Для переваривания тканей рыб.
Спектрофотометр	Shimadzu	UV-3150	Количественная оценка концентрации ДНК.
Термоамплификатор	Bio-Rad	T100
Портативный холодильник	Twinbird	D-CUBE	Для водной подвижной фазы во избежание испарения HFIP. Его можно заменить холодильником.
Жидкостный хроматограф Ultimate 3000	Масс-спектрометр Thermo Fisher	NA
Q Exactive масс-спектрометр	Thermo Fisher	NA	с преобразованием Фурье оснащен модифицированным анализатором ловушек Кингдона.
Деконволюция белка 3.0	Thermo Fisher	NA	Используйте версию 3.0 или выше, имеющую изотопную модель нуклеотида.