Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Вкус Предпочтение анализа для взрослых

9.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54403

⸱

8 сентября 2016 г.

 , 
1Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine-South Bend

В этой статье

Краткое содержание

Вкус является важным сенсорным процессом, который способствует привлечению к полезным веществам и избеганию токсичных веществ. Этот протокол описывает простой анализ приема внутрь для определения вкусовых предпочтений дрозофилы к данному химическому соединению.

Аннотация

Обонятельное и вкусовое восприятие окружающей среды жизненно важно для выживания животных. Наиболее очевидное применение этих хемочувств заключается в способности отличать хорошие источники пищи от потенциально опасных. Для дегустации необходим физический контакт с химическим соединением, которое способно передавать сигналы через вкусовые рецепторы, экспрессируемые на поверхности нейронов. У насекомых эти вкусовые нейроны могут быть расположены по всему телу животного, что позволяет вкусу играть важную роль во многих различных формах поведения. Насекомые обычно предпочитают соединения, содержащие сахара, в то время как соединения, которые считаются горькими на вкус, избегают. Учитывая базовую биологическую важность вкуса, существует большой интерес к пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе этой сенсорной модальности. Мы описываем вкусовой анализ взрослой дрозофилы, который отражает предпочтения животных в отношении данного вкусового соединения. Этот анализ может быть применен к животным с любым генетическим происхождением для изучения вкусовых предпочтений в отношении желаемого растворимого соединения.

Введение

Животные используют chemosensation отличить выгодные условия помимо невыгодных условий. Такое восприятие может иметь решающее значение для таких вещей , как определение наилучшего источника пищи, избегая токсичных веществ или определения наилучшего брачного партнера 1. Chemosensation часто делится на две сенсорные компоненты: обоняния и вкусовых ощущений. Главной отличительной особенностью этих чувств является то, что обоняние (запах) используется для образца окружающей газовой среды, в то время как химическая проба на вкус (вкус) требует физического контакта с нелетучим субстратом. Обе сенсорные модальности стимулируют неврологические реакции , которые обрабатываются и декодируются в мозге , чтобы произвести соответствующий притягательные или отталкивающие поведение 2. Эти чувства имеют решающее значение для выживания животных.

Плодовой мушки дрозофилы представляет собой модель организм , который продолжает расти в популярности для использования в понимать ,ING, как насекомые воспринимают запах и вкус. Плодовые мушки предлагают огромные преимущества по сравнению с другими системами модели благодаря богатству генетических инструментов, доступных для рассечения молекулярных, клеточных и поведенческих путей. Работа в течение последних 15 лет было особенно важную роль при характеристике специфических клеточных идентичности, нейронные рецепторы, и механизмы, участвующие в обоих запаха и вкуса сигнализации. Теперь сила дрозофилы генетики используется для дальнейшего выяснения , каким образом эти процессы кодируются на один нейрон и одного контура уровня 3-6. Поэтому анализы, которые обеспечивают забиваются легко считывания изменений в сенсорных путей являются жизненно важными для продолжения наступления этих полей.

В то время как много известно о том, как обонятельные сигналы кодируются и обрабатываются в головном мозге, гораздо меньше понимают о подобных механизмах в вкусового пути. Здесь мы опишем протокол, который может быть использован для установления вкуса preferenв.п. в дрозофилы. дрозофилы, как и у млекопитающих, как правило , предпочитают сладкие соединения дегустации , в отличие от горьких соединений дегустации. Любое сочетание этих источников пищи могут быть использованы в этой экспериментальной конструкции, чтобы определить, как известные генетические изменения влияют на выбор вкуса. Кроме того, фармакологические стратегии вмешательства так же можно оценить на предмет их влияния на вкусовые предпочтения животных. Легкость и гибкость этого анализа делает его полезным для парадигмы понимания природы вкусового восприятия у дрозофилы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Голодание

  1. Приготовьте летать на голодном ампул насыщением ватный тампон с 18,2 МОм воды в нижней части стандартного флакона летать. В качестве альтернативы, так же насыщают небольшую полоску фильтровальной бумаги с 18,2 МОм воды и место под углом в пузырьке.
  2. Сбор мух в наборы ~ 100 животных на CO 2 площадки , а затем добавить мух в подготовленную пробирку.
    Примечание: Наилучшие результаты получают с животными, которые менее чем за 5 дней. Тем не менее, точный возраст животных можно контролировать в качестве экспериментальной переменной для определения изменений вкусовых предпочтений в течение долгого времени.
  3. Используйте ватный шарик или пены пробку, чтобы обеспечить закрытым флаконах. Поместите ампул на их стороне в экологически контролируемом инкубаторе. Поддерживают температуру при 25 ° С, а влажность выше 70%. Оставьте флаконы нетронутым в течение 24 часов.

2. Вкус Предпочтение Анализ

  1. Подготовьте все Tastants для анализа на тот же деньs тестирование.
    Примечание: Точные Tastants, которые будут использоваться будет варьироваться в зависимости от экспериментальных нами вопроса. Ниже приведены примеры Tastants, используемые в данном протоколе. Смотрите раздел 4 для оптимизации.
    1. Подготовка управления tastant (1 мМ сахарозы) путем объединения 10 мкл 100 мМ раствора сахарозы, 13 мкл красного пищевого красителя, и 977 мкл 18,2 МОм воды.
    2. Подготовьте экспериментальную tastant (5 мМ сахарозы) путем объединения 50 мкл 100 мМ раствора сахарозы, 10 мкл голубого пищевого красителя, и 940 мкл 18,2 МОм воды.
  2. Сделать опробования камеры с использованием стандартного 100 мм х 15 мм пластиковые чашки блюдо, приготовленное следующим образом:
    1. Поместите три 10 мкл капли управления tastant ближайшего края пластины в 12 часов и еще 3 капли в 6 часов. Убедитесь, что расстояние между каплями аналогично.
    2. Поместите три 10 мкл капли экспериментальной tastant ближайшего края пластины в 3 часа ночи идругие 3 капли в 9 часов. Убедитесь, что расстояние между каплями аналогично.
    3. Повторите шаги 2.2.1 и 2.2.2 столько повторов, как хотелось бы.
  3. Пустой 1 флакон ~ 100 голодающих мух на СО 2 колодки просто достаточно долго , чтобы обезболить всех животных (около 10 сек). Кисть животных в середину подготовленной аналитической камеры и накрыть крышкой блюдо.
    Примечание: более длительные периоды воздействия CO 2 , следует избегать , чтобы улучшить время восстановления и ограничения вмешательства в пищевом поведении. Воздействие льда (~ 5 мин) может быть использован для обезболивающее , чтобы избежать CO 2 , поведенческие эффекты , которые могут возникнуть в результате даже ограниченным воздействием.
  4. Поместите камеру для анализа в непрозрачном картонной коробке. Обязательно маркировать вне коробки с условием и генотип испытывается.
  5. Поместите всю установку (пробирного камеры содержится в картонной коробке с шага 2.4) в 25 ° C инкубаторе с по крайней мере, 70% влажности в течение 2 часов.
  6. Повторите шаги 2,3 через 2,5 для всех повторах.
  7. После 2-х часов, поместите пробирного камеры, все еще содержащиеся в картонные коробки, непосредственно в -20 ° C морозильнике до готовности к количественному.

3. Вкус Предпочтение Анализ Количественное

  1. Разрешить один тест камеры нагреться до комнатной температуры (примерно 5 мин).
  2. Под микроскопом рассечение, используя щетку или пару щипцов, группы животных на основе цвета их живота: красный, синий, фиолетовый или ясно (рисунок 1).
  3. Записывают число животных в каждой группе. Рассмотрим четкие животных не участвовали в анализе, и поэтому не включать их в каких-либо расчетов.
  4. Вычислить индекс предпочтений согласно одному из следующих уравнений:
    1. Если экспериментальная tastant интерес добавляется к красным красителем, а затем использовать (N красный + 0,5н фиолетовый) / (N + N красный синий + N Purplд).
    2. Если экспериментальная tastant добавляется к синим красителем, а затем настроить уравнение к (N синий + 0,5н фиолетовый) / (N синий + красный + N N фиолетовый).
  5. Повторите расчеты для всех условий эксперимента и повторах.

4. Оптимизация вкуса Предпочтение Пробирной

  1. Эмпирически определить концентрацию показателей пищевой краситель для использования таким образом пищевой краситель не влияет на результат анализа вкуса, следующим образом:
    1. Подготовьте 4 Tastants с использованием того же основного соединения (например , 5 мМ сахарозы) , как показано на шаге 2.1, но опустить пищевой краситель.
    2. Добавить 1,3% красный пищевой краситель к одному из Tastants. Выполните оставшиеся 3 Tastants с синим пищевым красителем различных концентраций в каждой пробирке (например , 0,6%, 1% и 1,3%).
    3. Полный протокол шаги 2.2 через 3.4 для каждой пары tastant: 1,3% против 0,6 красный% синий; 1,3% красного против 1% синего и1,3% по сравнению с красным 1,3% синим цветом.
    4. Повторите шаг 4.1.1-4.1.3 с различным процентным содержанием синего пищевого красителя , пока средние значения индекса предпочтения значение 0 (Рисунок 2).
      Примечание: В качестве отправной точки, 1,3% краситель красный пищевой в сочетании с 1% синей окраски пищи, как правило, дает хорошие результаты. Если нет удовлетворительной концентрации синего пищевого красителя не могут быть сопоставлены с 1,3% красителя, а затем шаг 4.1.1 через 4.1.3 можно повторить с различными концентрациями красной окраски и постоянной концентрации синего пищевого красителя.
    5. Анализировать все условия, чтобы быть проверены с помощью тех же самых оптимизированных концентрациях пищевой краситель.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Некоторые типичные результаты вкусовых предпочтений анализов приведены ниже. В большинстве экспериментов некоторые различия в интенсивности окраски брюшной будет видно (рисунок 1). Любая окраска в брюшной полости ли интенсивным или слабым считается положительным проглатывания. Поэтому целесообразно для исследователей забивать животных в то время закрывать глаза на условия эксперимента так, чтобы ограничить любые потенциальные уклоны.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы описали простой , но эффективный протокол для определения вкусовых предпочтений у дрозофилы. Версии этого анализа обычно используются в экспериментах для определения вклада вкусовых рецепторов (ГР), чтобы воспринимать различные качества (горький, сладкий, кислый, соленый, и умами) вкусовых соединений. Геном дрозофилы содержит около 60 генов , которые кодируют 68 идентифицированные вкусовых рецепторов путем альтернативного сплайсинга 8,9. Тем не менее, другие белки , такие как ионотропных ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить членов лаборатории Тессье за критическое прочтение этой рукописи и полезные предложения во время подготовки этого протокола.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Синий пищевой краситель (вода, пропиленгликоль, FD и C Blue 1 и Red 40, Propylparaben)McCormickN/A
Крио/морозильные боксы без разделителейFisher03-395-455
Dumont #5 ЩипцыFine Science Tools11251-20
Ледяная уксусная кислота FisherBP2401-500
Leica S6 E Стереозум 0,63X-4,0Xмикроскоп W. Nuhsbaum, Inc.
Чашка Петри (100 мм x 15 мм)BD Falcon351029Многоразовое использование при тщательной промывке и сушке
Quick-Snap MicrotubesAlkali Scientific Inc.C3017
Красный пищевой краситель (вода, пропиленгликоль, FD и C Reds 40 и 3, пропилпарабен)McCormickN/A
SucroseIBI ScientificIB37160
10446294

Ссылки

  1. Herrero, P. Fruit fly behavior in response to chemosensory signals. Peptides. 38 (2), 228-237 (2012).
  2. Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annu Rev Neurosci. 30, 505-533 (2007).
  3. Harris, D. T., Kallman, B. R., Mullaney, B. C., Scott, K. Representations of Taste Modality in the Drosophila Brain. Neuron. 86 (6), 1449-1460 (2015).
  4. Hong, E. J., Wilson, R. I. Simultaneous encoding of odors by channels with diverse sensitivity to inhibition. Neuron. 85 (3), 573-589 (2015).
  5. Kain, P., Dahanukar, A. Secondary taste neurons that convey sweet taste and starvation in the Drosophila brain. Neuron. 85 (4), 819-832 (2015).
  6. Masek, P., Worden, K., Aso, Y., Rubin, G. M., Keene, A. C. A dopamine-modulated neural circuit regulating aversive taste memory in Drosophila. Curr Biol. 25 (11), 1535-1541 (2015).
  7. Charlu, S., Wisotsky, Z., Medina, A., Dahanukar, A. Acid sensing by sweet and bitter taste neurons in Drosophila melanogaster. Nat Commun. 4, 2042(2013).
  8. Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
  9. Scott, K., et al. A chemosensory gene family encoding candidate gustatory and olfactory receptors in Drosophila. Cell. 104 (5), 661-673 (2001).
  10. Kim, S. H., et al. Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).
  11. Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors. Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).
  12. Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
  13. Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nat Neurosci. 16 (10), 1468-1476 (2013).
  14. Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
  15. Rodrigues, V., Cheah, P. Y., Ray, K., Chia, W. malvolio, the Drosophila homologue of mouse NRAMP-1 (Bcg), is expressed in macrophages and in the nervous system and is required for normal taste behaviour. EMBO J. 14 (13), 3007-3020 (1995).
  16. Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. Genetics. 119 (2), 399-406 (1988).
  17. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
  18. French, A. S., et al. Dual mechanism for bitter avoidance in Drosophila. J Neurosci. 35 (9), 3990-4004 (2015).
  19. Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Тест на вкусовые предпочтения Drosophilaтест на вкусовые предпочтенияанализ концентрации сахарозыколичественное определение пищевого красителяметод анестезии CO2подготовка чашек Петриконтроль условий окружающей среды в инкубатореметод хранения в морозильной камеренаблюдение с помощью диссекционного микроскопагруппировка по цвету брюшка
Вкус Предпочтение анализа для взрослых
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.