Методическая статья

Аффинное мечение Обнаружение эндогенного Рецепторы из эмбрионов данио рерио

DOI:

10.3791/54405

⸱

31 августа 2016 г.

 ,  , 
1Cell and Developmental Biology, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описан новый метод обнаружения низкоизобилия эндогенных рецепторов, присутствующих в эмбрионах рыбок данио. Мы назвали его AFLIP, потому что он состоит из аффинного мечения рецептора его лигандом, связанным с иммунопреципитацией.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Объединив способности Affinity Labeling и Immunop recipitation(AFLIP), была реализована техника обнаружения рецепторов с низким содержанием у эмбрионов рыбок данио. Этот метод использует преимущества селективности и чувствительности, обеспечиваемых аффинным мечением данного рецептора его лигандом со специфичностью иммунопреципитации. Мы использовали AFLIP для обнаружения рецептора TGF-β типа III (TGFBR3), также известного как бетагликан, на ранних этапах развития рыбок данио. AFLIP сыграл важную роль в валидации эффективности фенотипа морфантных рыбок данио TGFBR3. На первом этапе подготавливаются экстракты эмбриональных белков, которые используются для получения 125комплексов I-TGF-β2-TGFBR3, которые очищаются с помощью иммунопреципитации. В дальнейшем эти комплексы ковалентно сшиваются и выявляются с помощью разделения SDS-PAGE и авторадиографического детектирования. Этот способ требует наличия меченого лиганда и специфического антитела против детектируемого рецептора, и должен быть легко адаптирован для идентификации любого фактора роста или цитокинового рецептора, отвечающего этим требованиям.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Специфическое обнаружение белков, экспрессируемых во время эмбрионального развития, требуется для валидации профилей экспрессии, полученных путем измерения их родственных мРНК с помощью ОТ-ПЦР или гибридизации in situ (ISH). Обычно это достигается путем вестерн-блоттинга экстрактов эмбрионов с последующим обнаружением специфическими антителами. Однако этот подход трудно применить к белкам, которые находятся в очень низком распространении или обладают свойствами, препятствующими их количественному переносу во время блоттинга. Бетагликан, также известный как рецептор трансформирующего фактора роста β типа III (TGF-β) (TGFBR3), является примером этих трудностей. TGFBR3 представляет собой мембранный протеогликан, который связывается с TGF-β через его основной белок1, с заметно более высоким сродством к изоформе TGF-β2, свойство, которое отличает его от любого другого TGF-β связывающего белка2. TGFBR3 у рыбок данио экспрессируется от 8 hpf и далее, достигая максимума на 72 hpf, что было обнаружено с помощью ОТ-ПЦР его мРНК3.

Однако, несмотря на наличие очень специфического антитела3, все попытки обнаружить его транслируемый продукт с помощью вестерн-блоттинга оказались безуспешными. Учитывая, что причиной этого сбоя может быть протеогликанная природа TGFBR3, а также предполагаемая низкая распространенность, был разработан метод детектирования AFLIP, который использует высокую аффинность TGFBR3 к TGF-β2. В этом способе белковый экстракт из объединенных эмбрионов может специфически связываться со 125меченым I-меченным TGF-β2, а рецептор-лигандные комплексы очищают иммунопреципитацией и сшивают перед разделением с помощью SDS-PAGE. Характер миграции, наблюдаемый с помощью авторадиографии гелей, выявил наличие и природу меченых видов рецепторов. Этот подход сочетает лигандную специфичность аффинного мечения с иммунопреципитацией специфическими антителами, увеличивая дальность обнаружения, избегая неэффективного трансферного блоттинга TGFBR3. Благодаря присущим ему свойствам, анализ AFLIP не является количественным анализом, но может быть использован для уверенной оценки относительных экспериментальных различий в анализируемом рецепторе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты, проведенные на животных были одобрены Комитетом по лабораторному уходу и использованию автономного национального университета Мексики (УНАМ) животного происхождения, под номером CICUAL-протокола: FLC40-14. (CICUAL: "Comité Institucional пункт эль Cuidado у Uso-де-лос-Animales де Laboratorio дель Instituto де Fisiologìa Celular, Национальный автономный университет Мехико").

1. Получение экстракта Эмбрион белка

  1. Собирают 100 - 200 эмбрионов для каждого условия для сравнения (морфанты против дикого типа) на желаемой стадии, например, 72 часов после оплодотворения (HPF).
  2. Место эмбрионов в чашки Петри , содержащие воду рыбы (см таблицу 1) и вручную dechorionate эмбрионов с помощью остроконечного пинцета. Не следует использовать проназу во время этого шага (или любой другой протеазы по всему протоколу), поскольку она может переваривать целевой рецептор.
  3. Место эмбрионов в 1,5 мл пробирке с и мыть эмбрионов Twлед с раствором 1x фосфатного буфера (PBS) (таблица 1).
  4. Добавьте 500 мкл буфера deyolk (таблица 1).
  5. Выпуск большинство желтка, осторожно пипеткой вверх и вниз (около 30 - 40 раз) эмбрионов в растворе. Для 72 и 48 часов после оплодотворения эмбрионов HPF используют синие и желтые наконечники пипеток, соответственно. Желтые советы, возможно, должны быть немного сократить, чтобы избежать уничтожения эмбрионов. Успешный выпуск желток может быть проверена путем наблюдения эмбрионов под микроскопом.
  6. Сбор эмбрионов путем центрифугирования при 600 мкг в течение 15 сек.
  7. Удалите супернатант осторожно с помощью пипетки.
  8. Вымойте эмбрионов в два раза с 500 мкл буфера для промывки (таблица 1), осторожно встряхивая на самой низкой скорости.
  9. Сбор эмбрионов путем центрифугирования при 600 мкг в течение 15 сек.
  10. Начиная отсюда, продолжить процедуру при температуре 4 ° С.
  11. Удалите супернатант осторожно с помощью пипетки.
  12. Ресуспендируют эмбрионов в 350 мкл буфера для лизиса (Таблица 1) и гомогенизируют с помощью пластикового пестика.
  13. Выдержите лизируют эмбрионов через 30 мин при перемешивании на качалке пробирке при 4 ° С.
  14. Центрифуга лизируют эмбрионов при 11000 х г в течение 15 мин, чтобы удалить нерастворимые твердые частицы.
  15. Передача очищается супернатанта с помощью пипетки в свежую пробирку.
  16. Определить общий белок по Бредфорда белка 4, или другой подходящей процедурой. Если Бредфорда используется, выполняют калибровочную кривую в присутствии эквивалентных концентраций детергентов подарков в буфере для лизиса, так как они вызывают недооценку белка стандартного 4.

2. Обнаружение эндогенного белка рецептора

  1. Аффинное мечение и иммунопреципитация (все эти шаги при 4 ° С)
    1. Поместите 400 - 500 мкг общего белка эмбрионов в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку и разбавляют до 1 мкг / мкл буфера 1 (таблица 1).
      Примечание: Для того чтобы получить 500 мкг общего белка эмбрионов, около 100 - 200 эмбрионов должны быть первоначально обработаны. 72 HPF эмбрионов обычно дают ~ 5 мкг общего белка эмбриона, который является достаточным для обнаружения betaglycan.
    2. Добавьте достаточный объем меченого TGF-бета 2 запаса для достижения конечной концентрации 150 мкМ и инкубировать при перемешивании на пробирке качающегося 2 ч при 4 ° С. TGF-β2 должны быть помечены перед запуском AFLIP, с 125 I с помощью метода хлорамина Т , как описано Cheifetz и др. 5.
      ВНИМАНИЕ: Используйте экранирование для минимизации воздействия при обращении с 125 I меченый лиганд.
    3. Добавьте достаточно объема неразбавленного антител против рецептора интереса для того, чтобы достичь разведение 1: 100 и продолжают инкубацию еще в течение 2 ч при 4 ° С (инкубационный может быть O / N). Это оптимальное разведение антисыворотки # 31, используемый в данном исследовании , и описано в другом месте 3, но в зависимости от качества апtibody, большее или меньшее разбавления может быть оптимальным.
    4. Добавляют 50 мкл подходящей иммуноглобулина связывания гранул (например, G-белок-сефарозой, которая была предварительно уравновешенную в TNTE и ресуспендировали 1: 5 своего первоначального объема в TNTE) и инкубировать в течение 50 мин при перемешивании на качалке пробирке при 4 ° C.
    5. Восстановить бусы микроцентрифугированием при 11000 мкг в течение 20 сек.
    6. Удалите супернатант в соответствующем контейнере радиоактивного хлама.
    7. Вымойте IP - бусинок три раза с 1 мл промывочного буфера IP (см таблицу 1), путем встряхивания и микроцентрифугированием при 11000 мкг в течение 20 секунд каждый раз.
    8. Ресуспендируют IP-бусины в 250 мкл буфера IP промывной.
    9. Добавить 1,5 мкл дисукцинимидилсуберат (DSS, растворенного в ДМСО с концентрацией 10 мг / мл). Приготовьте раствор DSS как раз перед его использованием в этом шаге.
    10. Инкубировать в течение 15 мин при 4 ° С при перемешивании.
    11. Для того, чтобы погасить реакцию сшивания, добавляют 500 мкл Oе IP промывочный буфер, с добавлением достаточно Трис-Cl рН 7,4 запаса достигнет 25 мМ Трис-Cl. Свободные аминогруппы в Трис захвата непрореагировавший DSS.
    12. Центрифуга при 11000 мкг в течение 20 секунд, чтобы собрать IP-шарики и отбросить супернатант.
    13. Ресуспендируют IP-бусины в 30 мкл буфера снижения Laemmli.
    14. Варить образцы 5 мин при 94 ° С.
    15. Необязательно проводить анализ проб в гамма-счетчике с использованием протокола производителя.
  2. Анализ проб
    1. Предметные образцы денатурирующих SDS-PAGE. Использование полиакриламида на соответствующий процент по массе рецептора и гель-под стандартной процедурой.
    2. Погружают гель в Фиксирующий раствор (таблица 1) в течение 30 мин при комнатной температуре.
    3. Вымойте гель с дистиллированной водой в течение 15 мин.
    4. Поместите гель в предварительно гидратированных фильтровальную бумагу и накрыть Саран оберточной пленкой.
    5. Сухой гель при 80 ° С в течение 1 часа.
    6. Expose гель на белом Phosphorimager Screан при RT O / N.
    7. Сканирование подвергается экран с помощью Phosphorimager с использованием протокола производителя.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1 показана репрезентативная результат , полученный с AFLIP. Сигналы в Дорожка 1 поступают из 125 I-лиганд , ковалентно связанный либо с данио betaglycan корового белка (сердечник BG, ниже 150 кДа маркер) или ядро BG, которое было обработано в его протеогликанов форме путем присоединения гликозаминогликаны (ГАГ, мазка в пределах от 170 кДа до верхней части геля). Эта модель миграции, острый белок ядра плюс смазывают протеогликанов (из - за неоднородн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование Вестерн - блоттинга со специфическим антителом против представляющего интерес белка является ценным инструментом для изучения его экспрессии 7 во время эмбриогенеза. Тем не менее, иммуно высоко гликозилированных белков не был очень успешным из - за их неэффективной передачи и слабое связывание на нитроцеллюлозные или PVDF мембраны 8,9.

Протеогликанов являются хорошим примером этого недостатка, из-за их ковалентно присоединенных гликозаминогликановых цепей ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Хильберто Моралеса за уход и содержание рыб, а также докторов Клаудию Риверу и Гектора Малагона (IFC-UNAM Animal Facility) за их помощь в иммунизации кроликов. Эта работа была поддержана грантами CONACYT 131226 и PAPIIT-DGAPA-UNAM IN204916.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Дисукцинимидил субперат (DSS)ThermoFisher Scientific21555
Protein G Sepharose 4 Fast FlowGE Healthcare Life Sciences17-0618-01
Гелевая сушилка Модель 583 BIO-RAD1651745
Typhoon 9400GE Здравоохранение Медико-биологические науки63-0055-78
Cobra II Автоматический гамма-счетчикКассета экспозиции Packard
Молекулярная динамика63-0035-44
NaClJ.T. Baker3624
KClJ.T. Baker3040
Na2HPO4J.T. Baker3828
K2HPO4J.T. Baker3246
CH3OHJ.T. Baker9070
CH3COOHJ.T. Baker9508
HCHOJ.T. Baker2106
SDSSigma-AldrichL4509
EDTASigma-AldrichED
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
CaCl2Sigma-AldrichC3306
NaHCO3Fisher ScientificS233
PMSFSigma-AldrichP7626
Кристал Си Марин МиксМарин Энтерпрайзс Интернэшнлhttp://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. López-Casillas, F., et al. Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system. Cell. 67 (4), 785-795 (1991).
  2. Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J. The transforming growth factor-beta receptor type III is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor. J. Biol. Chem. 263 (32), 16984-16991 (1988).
  3. Kamaid, A., et al. Betaglycan knock-down causes embryonic angiogenesis defects in zebrafish. Genesis. 53, 583-603 (2015).
  4. Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  5. Cheifetz, S., et al. Distinct transforming growth factor-b receptor subsets as determinants of cellular responsiveness to three TGF-b isoforms. J. Biol. Chem. 265, 20533-20538 (1990).
  6. López-Casillas, F., Wrana, J. L., Massagué, J. Betaglycan presents ligand to the TGFβ signaling receptor. Cell. 73 (7), 1435-1444 (1993).
  7. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. PNAS USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  8. Maccari, F., Volpi, N. Direct and specific recognition of glycosaminoglycans by antibodies after their separation by agarose gel electrophoresis and blotting on cetylpyridinium chloride-treated nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 24 (9), 1347-1352 (2003).
  9. Volpi, N., Maccari, F. Glycosaminoglycan blotting and detection after electrophoresis separation. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1312, 119-127 (2015).
  10. Guesdon, J. L., Ternynck, T., Avrameas, S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem. 27 (8), 1131-1139 (1979).
  11. Bratthauer, G. L. The avidin-biotin complex (ABC) method and other avidin-biotin binding methods. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 588, 257-270 (2010).
  12. Heimer, R., Molinaro, L., Sampson, P. M. Detection by 125I-cationized cytochrome c of proteoglycans and glycosaminoglycans immobilized on unmodified and on positively charged Nylon 66. Anal. Biochem. 165 (2), 448-455 (1987).
  13. Das, M., et al. Specific radiolabeling of a cell surface receptor for epidermal growth factor. PNAS USA. 74 (7), 2790-2794 (1977).
  14. Massague, J., Guillette, B., Czech, M., Morgan, C., Bradshaw, R. Identification of a nerve growth factor receptor protein in sympathetic ganglia membranes by affinity labeling. J. Biol. Chem. 256 (18), 9419-9424 (1981).
  15. Massague, J., Pilch, P. F., Czech, M. P. Electrophoretic resolution of three major insulin receptor structures with unique subunit stoichiometries. PNAS USA. 77 (12), 7137-7141 (1980).
  16. Hoosein, N. M., Gurd, R. S. Identification of Glucagon Receptors in Rat Brain. PNAS USA. 81, 4368-4372 (1984).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

TGFBR3SDS PAGE

Похожие статьи