Методическая статья

Получение однородных образцов MALDI для количественных измерений

8.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54409

⸱

28 октября 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Genomic Research Center, Academia Sinica, 2Department of Chemistry, National Taiwan University, 3Department of Chemical Engineering and Biotechnology, National Taipei University of Technology

В этой статье

Краткое содержание

Протокол для уменьшения пространственных неоднородностей ионных сигналов в MALDI масс-спектрометрии с помощью регулирования температуры подложки во время процессов сушки образцов демонстрируется.

Аннотация

Этот протокол демонстрирует простую подготовку образцов для уменьшения пространственной неоднородности ионных сигналов во время масс-спектрометрии с помощью матрицы лазерной десорбции/ионизации (MALDI). Неоднородность ионных сигналов является серьезной проблемой в MALDI, что приводит к плохой воспроизводимости данных и делает MALDI непригодным для количественного анализа. Регулируя температуру пробоотборной пластины во время пробоподготовки, термически индуцированные гидродинамические потоки внутри капель пробного раствора способны уменьшить проблему неоднородности. Камера пробоподготовки при комнатной температуре, оснащенная медным блоком с регулируемой температурой, в котором находятся планшеты для образцов MALDI, обеспечивает точный контроль условий сушки образца. После высыхания капель образца температура образцовых планшетов возвращается к комнатной температуре и удаляется из камеры для последующего масс-спектрометрического анализа. Участки образцов исследуются с помощью масс-спектрометрии MALDI-imaging для получения пространственного распределения всех компонентов в образце. По сравнению с традиционным методом с использованием сухих капель, который препарирует образцы в условиях окружающей среды без контроля температуры, образцы, полученные с помощью продемонстрированного здесь способа, демонстрируют значительно лучшее пространственное распределение и интенсивность сигнала. Согласно наблюдениям с использованием образцов углеводов и пептидов, снижение температуры субстрата при поддержании температуры окружающей среды на уровне окружающей среды в процессе сушки может эффективно снижать гетерогенность ионных сигналов. Этот метод в целом применим к различным комбинациям образцов и матриц.

Введение

Масс-спектрометрия (МС) является одним из наиболее важных аналитических методов для анализа молекулярного состава сложных образцов. Среди всех методов ионизации, используемых в МС, матричная лазерная десорбция/ионизация (MALDI) является наиболее чувствительным и широко используемым методом в биоаналитических приложениях. 1 По сравнению с другими методами ионизации, MALDI имеет самую высокую чувствительность и высокую устойчивость к солевым загрязнителям. Такие аналитические свойства делают MALDI первым выбором для анализа углеводов и многих приложений протеомики. Тем не менее, подготовка образцов является важным этапом для получения высококачественных данных в MALDI-MS.

Наиболее часто используемым методом подготовки образцов для MALDI-MS является метод с использованием сухих капель, при котором капли образца наносятся на поверхность и высушаются в условиях окружающей среды. Этот способ сушки прост и в целом эффективен. 2-5 Однако общая проблема метода с использованием сухих капель заключается в том, что результирующие кристаллы аналита/матрицы обычно распределяются неравномерно. Во многих случаях кристаллы агрегируются на периферии участков образца, что приводит к образованию так называемого кольцевого пятна. 6-8 Гетерогенная кристаллическая морфология влияет на пространственное распределение молекул аналита, что приводит к сильным колебаниям ионного сигнала на участках образца. Такие сильные флуктуации сигнала и плохая воспроизводимость данных известны как проблема «зоны наилучшего восприятия» в MALDI-MS. 9 Таким образом, существует большая потребность в уменьшении пространственных неоднородностей при нанесении сухих капель MALDI-MS.

Гидродинамические потоки в капле образца играют важную роль в определении пространственного распределения образцов, приготовленных методом с использованием сухих капель. 10-12 Установлено, что испарение растворителя индуцирует наружу капиллярные потоки внутри капель, которые ответственны за образование кольцевого пятна. 7,10 Напротив, рециркуляционные потоки, вызванные тангенциальными градиентами поверхностного натяжения, могут уравновешивать внешние капиллярные потоки. 13 Если скорость рециркуляционного потока выше, чем скорость капиллярного потока наружу, образцы могут быть эффективно перераспределены для уменьшения проблемы неоднородности. 14

В этой работе мы демонстрируем подробный протокол подготовки образцов с помощью простой сушильной камеры для создания эффективных рециркуляционных потоков во время процессов капельной сушки. Условия сушки капель точно контролируются, включая температуру планшета с образцом и окружающей его среды, а также относительную влажность в камере. Модельные аналиты включают мальтотриозу и брадикининовую цепь (1-7). Матрица, использованная для демонстрации, представляет собой 2,4,6-тригидроксиацетофенон (ТАП). Образцы исследуются с помощью МС-времяпролетных данных (TOF), а данные количественно анализируются, чтобы показать снижение гетерогенности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Этот протокол разработан для уменьшения пространственной неоднородности мальтотриоза и брадикинина фрагмента (1-7), полученного с использованием метода высохших капель. Протокол состоит из трех основных этапов, включая подготовку и предобусловливанием, осаждение образца и сушки, а также масс-спектрометрического анализа данных. Процедуры изложены и описаны более подробно ниже:

1. Подготовка и Предобусловливание

  1. Очистка образца плиты
    1. Надеть нитриловые перчатки и ручной мыть образец пластины аккуратно с моющим средством и дистиллированной деионизированной воды (DDW).
    2. Промыть образец стекла с метанолом (MeOH) и DDW.
    3. Вставьте образец пластины в стакане емкостью 600 мл и залить DDW.
    4. Разрушать ультразвуком образца пластины в DDW в течение 15 мин в ультразвуковой ванне (200 Вт, 40 кГц).
    5. Удалить DDW из стакана и залейте стакан с метанолом.
    6. Разрушать ультразвуком образца пластины в MeOH в течение 15 мин в ультразвуковой ванне (200 Вт, 40 кГц).
    7. Сдувать растворителя капли на пластине с газообразным азотом и держать образец пластины сухой перед нанесением образца.
  2. Регулирование температуры сушильной камеры
    Примечание:. Сушильная камера 35 х 20 х 45 см 3 (Ш х Г х В ) акриловой камеры На рисунке 1 показана картина этой системы сушки. Камера продувается при комнатной температуре газообразным азотом через газовый расходомер при постоянной скорости потока для поддержания состояния низкой относительной влажности отслеживается с помощью калиброванного гигрометра, установленной внутри сушильной камеры. Медное основание блока в сушильной камере, оснащенной запрограммированной постоянной циркулятор температуры воды используется для размещения образцов из нержавеющей стали пластины. Медное основание блок способен регулировать температуру образца плиты от 5 до 25 ° C. Температуры воздуха, меди базового блока и образец пластины контролируются термопарами К-типа.
    1. Откройте дверь и быстро поместить образец пластину на медибазовый блок затем закройте дверцу.
    2. Ручная регулировка газового расходомера, чтобы установить скорость потока азота до 10 стандартных кубических футов в час (SCFH).
    3. Монитор относительную влажность воздуха в сушильной камере с помощью гигрометра и точной настройки газа расходомер для обеспечения относительной влажности воздуха всегда ниже 25%.
    4. Контролировать температуру образца пластины термопарами К-типа и регулировать температуру воды циркулятора вручную, пока образец пластина не достигнет 5 ° С в течение эксперимента или при комнатной температуре (25 ° C) для контроля.
      Примечание: Для того, чтобы стабилизировать образец стекла при заданной температуры, температура воды циркуляционный обычно устанавливается от 0 до 5 ° С ниже, чем проектируемого образца. Например, чтобы поддерживать на 5 ° C на образце пластины, установка температуры воды циркулятора, находится в диапазоне от 0 до 2 ° C; для поддержания образца пластины при температуре 25 ° С, значение температуры воды циркулятора находится в диапазоне от 23 до 25 ° С.
    5. Обеспечение требуемых значений температуры и относительной влажности достигаются (таблица 1) перед нанесением пробы.
      Примечание: Все параметры, а также их значения параметров для процессов сушки с различными температурами образца пластины приведены в таблице 1.
      Примечание: При низкой температуре образца плиты, конденсацию воды на образце пластины может произойти, если дверь камера открыта в течение длительного времени. Если происходит конденсация воды, закройте дверцу и не предъявляйте любой образец на нем до конденсации воды не высохли.
  3. Получение матричных и аналита решений
    1. Получение матричных решений
      1. Готовят 0,1 М раствора Тап с помощью 50% ацетонитрила (ACN) 50% -ного водного раствора DDW.
    2. Получение аналитов
      1. Приготовьте 10 -4 М мальтотриозу раствор с пониженным содержанием дейтерия.
      2. Приготовьте 10 -5 М фрагмент брадикинина (1-7) в раствор 50% ацетонитрила(АКС): 50% -ный водный раствор DDW.

2. Образец Отложение и сушки

  1. Премикс 0,25 мкл 0,1 М раствора Тап и 0,25 мкл 10 -4 М мальтотриоза или 10 -5 М фрагмента брадикинина (1-7) растворов в микроцентрифужных трубки.
  2. Vortex смешанный раствор в течение 3 сек.
  3. Центрифуга смешанного раствора в течение 2 с (2000 XG) для сбора раствора в нижней части трубки центрифуги.
  4. Откройте дверцу сушильной камеры, тщательно депонировать 0,1 мкл раствора на образце пластины с пипеткой и закрыть дверь немедленно.
  5. Подождите, пока образец капли, чтобы высохнуть.
    . Примечание: обычно наблюдаемые время сушки с различными температурами образца пластины приведены в таблице 1 для температуры образца пластины 5 ° С, среднее время сушки составляет от 800 до 1000 с; для измерения температуры образца пластины 25 ° С, среднее время сушки составляет от 100 до 150 летес.
  6. После сушки, откройте дверцу сушильной камеры.
  7. Установите температуру воды циркуляционного до комнатной температуры (25 ° C).
    Примечание: Пропустить этот шаг, если образец пластина постоянно хранится при комнатной температуре (25 ° C) в процессе сушки.
  8. После того как температура пластины примере возвращается к комнатной температуре (25 ° C), удалить образец пластины из сушильной камеры.
  9. Изучение морфологии образец под стереомикроскопа 5X и взять ярко-поле моментальный снимок.
    Примечание: Если кристалл морфологию не как ожидалось, необходимо подготовить новый образец с той же процедурой. Типичные морфологию кристаллические показаны на верхних панелях на фиг.2.
    Примечание: В случаях с низкими температурами пластины образца, например, 5 ° С, важно, чтобы нагреть образец пластины до комнатной температуры, прежде чем принимать его из сушильной камеры. При сдаче на хранение образцов, не держат предварительно приготовленного SOLUTIOп в кончика пипетки в течение 10 сек. НЕ использовать заранее приготовленный раствор снова после внесения образцов. Верхние панели Рисунок 2 показывают ярко-полевые изображения образцов , приготовленных с различными температурами образца пластины.

Анализ 3. Данные масс-спектрометрии

  1. Масс-спектрометрия сбора данных
    Примечание: После подготовки, образец может быть проанализирован с помощью масс-спектрометрии изображений. В настоящем исследовании, формирующую изображение эксперименты MS проводят с использованием лабораторного встроенной синхронизированную с двойным полярности TOF (DP-TOF) масс - спектрометр с формированием изображения. 15 масс - спектрометры коммерческого MALDI-TOF с возможностью формирования изображения также подходят для таких экспериментов. Масс-спектрометр работает в линейной экстракции и положительных ионов с режимами оптимизированными задержки экстракции. Кинетическая энергия ионов составляет 20 кВ. Размер лазерного пучка составляет 35 мкм в диаметре на поверхности образца, а спектр каждого пятна прярость 5 лазерных выстрелов.
    1. Вставьте образец пластины в MALDI масс-спектрометра.
    2. Выполнение визуализации масс-спектрометрического анализа для образца, полученного на этапах 2.1-2.9.
    3. Выберите характерный пик массы из списка масс-показанного в окне результата и нажмите кнопку "2D", чтобы построить двумерный ионное изображение.
      Примечание: Для получения мальтотриозу смешанного с Тап, характерные пики sodiated мальтотриозу, протонированных Тап и sodiated Тап. Для фрагмента брадикинина (1-7), смешанной с Тап, характерные пики включают протонированные фрагмент брадикинина (1-7), протонированных Тап и sodiated Тап.
    4. Нажмите кнопки регулировки во всплывающем окне, чтобы определить верхний и нижний пределы интенсивности сигнала и нажмите кнопку "Сохранить изображение". Этот параметр определяет контраст ионных изображений.
      Примечание: В каждом отдельном наборе данных, то сломанные регионы и нулевые пятна, показывающие низкую яркость устраняются.
    5. Наблюдать и сравнить ионизображение с ярко-поле изображения, которое было принято на шаге 2.9.
      Примечание: Визуализация масс-спектрометрии и построение образов отдельных ионов может быть достигнуто с коммерческими инструментами. В связи с разнообразием сбора данных и программного обеспечения для анализа, пользователи должны следовать инструкциям программного обеспечения, предоставленного прибора поставщика, чтобы получить высокое качество изображения.
  2. Анализ данных
    Примечание: Неоднородность образцов анализируют количественно. В этой демонстрации, каждый образец делится на несколько концентрических областей с помощью программного обеспечения собственной разработки для анализа пространственного распределения ионов. Анализ также может быть выполнен с использованием автономного программного обеспечения для анализа данных.
    1. Нажмите нулевые пятна и трещины областей в изображении ионов отображается в окне результата для удаления несущественных областей.
      Примечание: Эта процедура определяет существенную область ионного изображения.
    2. Нажмите кнопку "край найти", чтобы найти слой крайнем ионного изображения.
    3. Нажмите кнопку "вычитать", чтобы сохранить информацию о ионом пресыщение слоя в самому дальнему от центра базы данных и удалить этот слой из ионного изображения одновременно. Флажок, представляющий этот слой будет крайнем появится в списке "выходных данных" окна результатов.
    4. Повторите шаги 3.2.2 и 3.2.3 до центра иона изображения не определяется.
    5. Нажмите и выберите все флажки в списке "выходных данных" и нажмите кнопку "Экспорт", чтобы экспортировать данные.
    6. Откройте экспортированные данные с помощью программного обеспечения электронной таблицы для расчета среднего иона обилие каждого слоя, чтобы получить информацию о пространственном распределении ионов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Изображения светлого поля, а также изображения МС мальтотриоза и брадикинина фрагмента (1-7) , полученного с температурой образца пластины 5 и 25 ° С, показаны на рисунке 1. В случае sodiated мальтотриоза, ионного сигнала в основном заполнит на периферии участка образца, когда он приготовлен с температурой образца пластины 25 ° с. При понижении температуры образца пластины до 5 ° C, сигнал заполнит равномерно по всей площади образца. Единственным заметным недостатком при...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

На основе предыдущих теоретических предсказаний, температуры, вызванной гидродинамические потоки внутри капель может преодолеть внешние капиллярные потоки, вызванные испарением растворителя. Эффективность такого внутренней рециркуляции молекул усиливается, когда градиенты температуры в пределах увеличения капелек. В соответствии с прогнозируемыми результатами, при поддержании температуры образца пластины при 5 ° С, поддерживая его окрестности при температуре окружающей среды, средняя скорость потока рециркуляции внутри ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа поддержана Исследовательским центром геномики, Academia Sinica и Министерством науки и технологий Тайваня, Китайская Республика (контракт No 104-2119-M-001-014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Реагент
Моющий порошокAlconox242985
МетанолMerck106009
Ацетонитрил Merck100003
2,4,6-тригидроксиацетофенон (ТАП)Sigma-AldrichT64602 
Фрагмент брадикинина (1-7)Sigma-AldrichB1651
МальтотриозSigma-Aldrich47884
Наконечники для пипетокMettler Toledo17005091
Микроцентрифужная пробиркаAxygenMCT-150-C
Equipment
Milli-Q очистка воды система MilliporeZMQS6VFT1
Неопудренные нитриловые перчаткиMicroflexSU-690
600 млСтакан Duran2110648
Ультразвуковой очистительDeltaDC300H
ГигрометрWisewind5330
Расходомер газообразного азотаDwyerRMA-6-SSV
K-type термопарыDigitron311-1670
CentrifugeSelect BioProductsForce Mini 
ПипеткаRaininpipet-lite XLS
СтереомикроскопOlympusSZX16
Сушильная камера с регулируемой температуройдля этой лаборатории
Синхронизированный двухполярный времяпролетный масс-спектрометр (DP-TOF IMS)для этой лаборатории
MALDI-TOF образец из нержавеющей стали мишеньдля этой лаборатории

Ссылки

  1. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10000 Daltons. Anal. Chem. 60, 2299-2301 (1988).
  2. Beavis, R. C., Chait, B. T. Velocity Distributions of Intact High Mass Polypeptide Molecule Ions Produced by Matrix Assisted Laser Desorption. Chem. Phys. Lett. 181, 479-484 (1991).
  3. Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-Assisted Laser Desorption Mass-Spectrometry. Org. Mass Spectrom. 27, 156-158 (1992).
  4. Ehring, H., Karas, M., Hillenkamp, F. Role of Photoionization and Photochemistry in Ionization Processes of Organic-Molecules and Relevance for Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry. Org. Mass Spectrom. 27, 472-480 (1992).
  5. Strupat, K., Karas, M., Hillenkamp, F. 2,5-Dihydroxybenzoic Acid - a New Matrix for Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. Ion Process. 111, 89-102 (1991).
  6. Hu, H., Larson, R. G. Evaporation of a Sessile Droplet on a Substrate. J. Phys. Chem. B. 106, 1334-1344 (2002).
  7. Deegan, R. D., et al. Capillary Flow as the Cause of Ring Stains from Dried Liquid Drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
  8. Hu, J. -B., Chen, Y. -C., Urban, P. L. Coffee-Ring Effects in Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chim. Acta. 766, 77-82 (2013).
  9. Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct Tissue Analysis Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry: Practical Aspects of Sample Preparation. J. Mass Spectrom. 38, 699-708 (2003).
  10. Hu, H., Larson, R. G. Marangoni Effect Reverses Coffee-Ring Depositions. J. Phys. Chem. B. 110, 7090-7094 (2006).
  11. Bhardwaj, R., Fang, X., Attinger, D. Pattern Formation During the Evaporation of a Colloidal Nanoliter Drop: A Numerical and Experimental Study. New J. Phys. 11, 075020(2009).
  12. Savino, R., Paterna, D., Favaloro, N. Buoyancy and Marangoni Effects in an Evaporating Drop. J Thermophys Heat Tr. 16, 562-574 (2002).
  13. Probstein, R. F. Surface Tension. in Physicochemical Hydrodynamics : An Introduction. , John Wiley & Sons. Ch. 10 305-361 (1994).
  14. Lai, Y. -H., et al. Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27, 1314-1321 (2016).
  15. Hsiao, C. -H., et al. Comprehensive Molecular Imaging of Photolabile Surface Samples with Synchronized Dual-Polarity Time-of-Flight Mass Spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 25, 834-842 (2011).
  16. Vorm, O., Roepstorff, P., Mann, M. Improved Resolution and Very High-Sensitivity in MALDI TOF of Matrix Surfaces Made by Fast Evaporation. Anal. Chem. 66, 3281-3287 (1994).
  17. Gabriel, S. J., Schwarzinger, C., Schwarzinger, B., Panne, U., Weidner, S. M. Matrix Segregation as the Major Cause for Sample Inhomogeneity in MALDI Dried Droplet Spots. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25, 1356-1363 (2014).
  18. Mampallil, D., Eral, H. B., van den Ende, D., Mugele, F. Control of Evaporating Complex Fluids through Electrowetting. Soft Matter. 8, 10614-10617 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MALDIMALDI

Похожие статьи