Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Разработка слюнных антитела Multiplex иммуноанализа для измерения воздействия на человека окружающей среды патогенам

7.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54415

⸱

12 сентября 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Exposure Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 2National Risk Management Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 3Oak Ridge Institute for Science and Education, 4Department of Biological Sciences, McMicken College of Arts and Sciences, University of Cincinnati

В этой статье

Краткое содержание

В нынешних условиях дефицита ресурсов появляются новые технологии, которые позволяют исследователям проводить исследования дешевле, быстрее и с большей точностью. В данной работе мы описываем разработку мультиплексного иммуноферментного анализа на антитела к слюне на основе гранул для измерения воздействия на человека нескольких патогенов из окружающей среды одновременно.

Аннотация

Этиология и последствия воздействия на человека экологических патогенов вызывают серьезную озабоченность во всем мире и, таким образом, способность оценивать воздействие и инфекции с использованием экономически эффективных, с высокой пропускной способностью подходов было бы обойтись. Эта рукопись описывает развитие и анализ бисерной на основе мультиплексной иммунологического анализа, способного измерять наличие антител в слюне человека к нескольким патогенам одновременно. Слюна является особенно привлекательным в этом приложении, поскольку она является неинвазивным, дешевле и легче собирать, чем сыворотки. Антигены окружающей среды патогенных микроорганизмов были соединены с карбоксилированные микросферы (бусинок) и используется для измерения антител в очень малых объемах образцов слюны человека, используя бусинки на основе раствора фазы анализа. Гранулы в сочетании с антигенами из Campylobacter jejuni, Helicobacter Pylori, токсоплазма, норовирусами (G I.1 и G II.4) и Вирус гепатита А. Для того, чтобы гарантировать, что антигены были в достаточной степени соединены сгранулы, муфта была подтверждена с использованием видоспецифические, животного происхождения антитела первичного захвата, с последующей инкубацией с биотинилированным анти-видовых вторичными антителами обнаружения и стрептавидин-R-фикоэритрин репортер (SAPE). В качестве контроля для измерения неспецифического связывания, один набор шарик обрабатывали идентично другим за исключением того, что не был связан с какой-либо антигена. Антиген связью и контрольные шарики затем инкубировали с перспективно-собранных образцах слюны человека, измеренный на анализаторе с высокой пропускной способностью на основе принципов проточной цитометрии, а наличие антител к каждому антигену измеряли интенсивность единицах Медиана флюоресценции (MFI) , Этот мультиплекс иммунологический имеет ряд преимуществ, в том числе больше данных с меньшим количеством образца; снижение затрат и труда; и возможность настройки анализа для многих целей, представляющих интерес. Результаты показывают, что слюнной мультиплексного иммуноанализа может быть способен идентифицировать предыдущих воздействий и инфекций, которые могут быть EspeciaLLY полезным при изучении наблюдения с участием крупных человеческих популяций.

Введение

Восемьдесят восемь процентов диареи , связанных с болезнью во всем мире связаны с воздействием на человека загрязненной воды, небезопасных пищевых продуктов и плохой санитарии / гигиены, в результате чего около 1,5 миллиона случаев смерти, большинство из которых являются дети 1. Это является основной причиной беспокойства для должностных лиц общественного здравоохранения и лиц, определяющих политику. В целях изучения воздействия и болезней , связанных с водорастворимыми и другими экологическими патогенами, мы разработали мультиплекс иммуноферментного анализа для измерения антител в образцах человеческих тканей 2-4. Этот метод может быть применен к эпидемиологических исследований для определения воздействия на человека этих патогенов и для более четкого определения immunoprevalence и инцидентов инфекции.

Слюна имеет значительные перспективы в качестве альтернативы сыворотки для исследования биомаркеров человека. Среди преимуществ использования слюну являются не-инвазивности и легкость сбора проб, низкая стоимость, и образцы могут быть легко собраны из детей 5-7 </ SUP>. Образцы сыворотки и образцы слюны были изучены на наличие антител против H. пилори 2,3,8, малярийного плазмодия 9, дизентерийная амёба 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus пневмонии 12, вирусов гепатита А и С 13-14, Noroviruses 2-4,15, Т. гондий 2-4, вирус лихорадки денге 16, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) , 17, и кишечная палочка О157: Н7 18.

Многозальный иммунологический позволяет для анализа нескольких аналитов одновременно в пределах одного объема образца и в пределах одного цикла или бега. Мультиплексные антигены из C. jejuni, Т. гондий, H. Pylori, вирус гепатита А, и два Noroviruses были использованы для измерения человеческого IgG в слюне 2-4 и IgA 3,4 и плазмы IgG 2,3 ответ антител на этих патогенов с использованиембусинка мультиплексирование на базе иммунологического анализа. При использовании в сочетании с эпидемиологических исследований воздействия микробов в воде, почве и пищевых продуктов, тип анализа, описанного в данном исследовании, может дать ценную информацию для улучшения понимания инфекций, вызванных экологическими патогенами. Кроме того, слюнные данные , полученные из антител таких исследований могут быть использованы для улучшения моделей оценки риска 19-22.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Утверждение было получено из Совета по институциональному (IRB # 08-1844, Университет Северной Каролины, Чапел-Хилл, Северная Каролина, США) для сбора стимулированных десневой борозды образцов слюны из пляжников в Boqueron Beach, Пуэрто-Рико, как часть Соединенных Штатов Агентство по охране окружающей среды (USEPA) Национальная эпидемиологическая и экологическая оценка рекреационной (NEEAR) Вода исследования 23 для оценки плавания связаны воздействия и болезней. Испытуемых при условии, информированное согласие и было дано указание об использовании устройства сбора слюны обученными подрядчиками USEPA. Образцы слюны были отправлены на льду и, после получения, их центрифугировали и хранили при температуре -80 ° С , как описано 4.

1. Шарик активации

  1. Ресуспендируют шарик набор акций путем встряхивания и обрабатывали ультразвуком в течение 20 сек и передачи приблизительно 5,0 × 10 6 фондовых шариков (400 мкл) в микропробирок.
    Примечание: Tон бисер поставляются в концентрации 12,5 х 10 6 бусин / мл.
  2. Гранул акции шарики центрифугированием при 10000 мкг в течение 2 мин.
  3. Удалить супернатант и ресуспендируют Осажденный бусин в 100 мкл дистиллированной воды (дН 2 O) с помощью вихря и обработки ультразвуком в течение 20 сек. Повторите шаг 1.2.
  4. Удалить супернатант и ресуспендируют промытых бусин в 80 мкл 100 мМ одноосновного фосфата натрия, рН 6,2 с помощью вихря и обработки ультразвуком в течение 20 сек.
  5. Непосредственно перед использованием, чтобы раствор 50 мг / мл N -hydroxysulfosuccinimide (сульфо-NHS) путем добавления 200 мкл дН 2 O до 10 мг сульфо-NHS ​​аликвоты. Смешать вихря.
  6. Добавляют 10 мкл 50 мг / мл сульфо-NHS ​​к шарикам. Смешать вихря.
  7. Непосредственно перед использованием, чтобы 50 мг / мл 1-этил- [3 - диметиламинопропил] карбодиимида раствор (ДХЭ) путем добавления 200 мкл дистиллированной воды (дН 2 O) с 10 мг EDC аликвоты. Смешать вихря.
  8. Добавляют 10 мкл 50мг / мл EDC раствора к шарикам. Смешать вихря. Выдержите шариками в течение 20 мин при комнатной температуре, в темноте, при перемешивании с помощью вихря с интервалом 10 мин. Гранул активированные бусины микроцентрифугированием при 10000 мкг в течение 2 мин.
  9. Удалить супернатант и ресуспендируют бусин в 250 мкл 50 мМ 2- [N -Morpholino] этансульфоновой кислоты (MES), рН 5,0 с помощью вихря и обработки ультразвуком в течение 20 сек.
  10. Гранул активированные бусины микроцентрифугированием при 10000 мкг в течение 2 мин.
  11. Повторите шаги 1.9 и 1.10.
    Примечание: Это обеспечивает в общей сложности двух промывок с помощью 50 мМ MES, рН 5,0.
  12. Ресуспендируют бисером в 100 мкл 50 мМ MES, рН 5,0 с помощью вихря и обработки ультразвуком в течение 20 сек.

2. Сцепление из бисера

  1. Пара антигены к наборам бусинки с использованием показанных в таблице 1.
  2. Добавьте каждый антиген к активированным бусинок и довести общий объем до 500 мкл в 50 мМ MES, рН 5,0. Смешать антигеныг бисера вихря.
  3. Выдержите антигены и бусинки в течение 2 ч при перемешивании вращением (~ 15 оборотов в минуту) при комнатной температуре в темноте. Гранул соединенные шарики микроцентрифугированием при 10000 мкг в течение 2 мин.
  4. Удалить супернатант и ресуспендируют бусин в 500 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS), -bovine сывороточного альбумина (БСА) -polyoxyethylenesorbitan монолаурат (Tween-20) -натрий азид (ПБС-ТБН) рН 7,4 с помощью вихря и обработки ультразвуком. Гранул бусинки микроцентрифугированием при 10000 х г в течение 2 мин и удалить супернатант.
    Внимание: азид натрия является остро токсичным химическим веществом. Это приводит к летальному исходу при проглатывании или вступает в контакт с кожей. Не вдыхать пыль / дыма / газа / тумана / паров или аэрозолей. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), когда транспортная обработка и утилизировать в соответствии с соответствующими законами.
  5. Ресуспендируют бисером в 1 мл PBS-ТБН от вихря и обработки ультразвуком в течение 20 сек.
  6. Гранул шарики микроцентрифугированием при 10000 мкг в течение 2 мин.
  7. Повторите шаги 2.5 и 2.6.
    Примечание: Это обеспечивает в общей сложности два промывок PBS-ТБН.
  8. Ресуспендируют спаренной и промытые бусин в 1 мл PBS, 1% бычьего сывороточного альбумина, 0,05% азида, рН 7,4. Храните спаренных бусин в 2-8 ° C холодильнике в темноте.

3. Шарик граф

  1. Приготовьте разведение 1:10 спаренных бусин в воде или буфере PBS.
  2. Нагрузка 10 мкл кромочной разбавлении на гемоцитометра в точке ввода образца.
  3. Граф бусинки видели в одном из 4-х 4 угловых сеток. Подсчитайте общее количество связанных шариков , используя следующую формулу: Count (1 угол 4 х 4 сетки) х (1 х 10 4) х (коэффициент разбавления) х ресуспендирования объем в мл.

4. Подтверждение Antigen Муфта

  1. Ресуспендируют запаса смеси шариков, соединенных с антигенами интерес вихрем и ультразвуком в течение 20 сек.
  2. Подготовить рабочую смесь шарик путем разбавления спаренной запасов шарик до конечнойконцентрации 100 бусин / мкл каждого уникального шарика, установленного в PBS-1% BSA буфера (PBS-1% BSA, рН 7,4).
  3. Приготовьте по крайней мере, 7 двукратные серийные разведения анти-IgG видов первичного антитела в соответствии с рекомендациями производителя в 96-луночных круглодонных пластины с PBS-1% BSA буфера.
  4. Предварительное смачивание отдельный столбец 8-а (8 строк) 96-луночного фильтра нижней пластины для каждого испытания подтверждения сцепка антигена с помощью 100 мкл буфера для промывки и удаления надосадочной жидкости с помощью вакуума. Добавьте 50 мкл рабочего шарика смеси (антиген-гранулы) в сочетании с предварительно водосборных колодцах.
  5. Добавляют 50 мкл разведений антител к строкам 1-7 каждого столбца фильтра 96-луночного планшета и 50 мкл PBS-1% BSA буфера к Ряд 8 вместо разведенного антитела , чтобы служить в качестве фоновых скважин. Смешать с многоканальным дозаторов с помощью пипетки вверх и вниз 5 раз. Выполните ту же процедуру для каждого антигена в сочетании набора борта должны быть подтверждены.
  6. Накройте и позволяют инкубировать в темноте при комнатной температурературе в течение 1 ч на микропланшет-шейкере при 500 оборотах в минуту. Удалить супернатант с помощью вакуума.
  7. Промыть лунки со 100 мкл буфера для промывки и удаления надосадочной жидкости с помощью вакуума. Повторить 1 раз. Ресуспендируют бусины в 50 мкл PBS-1% BSA с многоканальным дозаторов с.
  8. Развести биотинилированного антитела против IgG к другому виду специфический вторичного антитела обнаружения до 16 мкг / мл в PBS-1% BSA.
  9. Добавляют 50 мкл разведенной вторичного антитела в каждую лунку с помощью пипетки вверх и вниз в 5 раз.
  10. Крышка фильтра пластины и позволяют инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин на планшетном шейкере. Удалить супернатант с помощью вакуума. Промыть лунки со 100 мкл буфера для промывки и удаления надосадочной жидкости с помощью вакуума. Повторите промывку 1x.
  11. Ресуспендируют бусины в 50 мкл PBS-1% BSA с многоканальным дозаторов с.
  12. Развести стрептавидин-R-фикоэритрин (репортер Sape) до 24 мкг / мл в PBS-1% BSA.
  13. Добавьте 50 мкл репортера в каждую лунку и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз 5 раз.
  14. Снад фильтровальной пластине и позволяют инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин на планшетном шейкере. Удалить супернатант с помощью вакуума. Промыть лунки со 100 мкл буфера для промывки и удаления надосадочной жидкости с помощью вакуума. Повторите промывку 1x.
  15. Ресуспендируют бисером в 100 мкл PBS-1% BSA и анализируют 50 мкл с использованием анализатора 29.
    Примечание: Результаты борта на основе мультиплексного иммуноанализа измеряются в Срединной интенсивности флуоресценции (MFI). Всегда можно найти в последней версии программного обеспечения руководства, если таковые имеются, чтобы избежать ошибок.

5. слюнных Multiplex иммуноферментный

  1. Удалить слюну от -80 ° C морозильника и позволяют оттаивают при комнатной температуре.
  2. Ресуспендируют антиген в сочетании запасов бусинки вихрем и ультразвуком в течение 20 сек.
  3. Подготовьте рабочую шарик смеси путем разбавления спаренной запасов шарик до конечной концентрации 100 бусин / мкл каждого уникального набора шарик в PBS-1% BSA буфера.
  4. Подготовьте 1: 4 разведение слюны шIth PBS-1% BSA буфера в 96-луночный, глубокий луночный планшет.
  5. Предварительно влажной фильтровальной пластины с 100 мкл буфера для промывки и удаления надосадочной жидкости с помощью вакуума.
  6. Добавляют 50 мкл рабочей смеси и бисерной равным объемом разбавленной слюны до 95 лунок 96-луночных фильтровальных пластин для 1: окончательного разведения, 8. Смешайте реакции с многоканальным дозаторов с. К одной контрольной лунки, добавляют 50 мкл с иммобилизованным антигеном бусин плюс 50 мкл PBS-1% BSA буфера (в качестве замены для слюне).
  7. Накройте и позволяют инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 1 ч на микропланшет-шейкере со скоростью 500 оборотов в минуту. Удалить супернатант с помощью вакуума. Промыть лунки со 100 мкл буфера для промывки и удаления надосадочной жидкости с помощью вакуума. Повторите промывку 1x.
  8. Ресуспендируют бусины в 50 мкл PBS-1% BSA с многоканальным дозаторов с.
  9. Развести биотинилированным козьим IgG против человеческого антитела вторичного обнаружения до 16 мкг / мл в PBS-1% BSA.
  10. Добавляют 50 мкл разведенного вторичного антитела в каждую лунку и перемешать содержимое сМногоканальная пипетки а.
  11. Крышка фильтра пластины и позволяют инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин на планшетном шейкере. Удалить супернатант с помощью вакуума. Промыть лунки со 100 мкл буфера для промывки и удаления надосадочной жидкости с помощью вакуума. Повторите промывку 1x.
  12. Ресуспендируют бусины в 50 мкл PBS-1% BSA с многоканальным дозаторов с.
  13. Развести стрептавидин-R-фикоэритрин (репортер Sape) до 24 мкг / мл в PBS-1% BSA.
  14. Добавляют 50 мкл репортера в каждую лунку и смешайте с многоканальным дозаторов с.
  15. Крышка фильтра пластины и позволяют инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин на планшетном шейкере. Удалить супернатант с помощью вакуума. Промыть лунки со 100 мкл буфера для промывки и удаления надосадочной жидкости с помощью вакуума. Повторите промывку 1x.
  16. Ресуспендируют бисером в 100 мкл PBS-1% BSA и анализируют 50 мкл с использованием анализатора 29.
    Примечание: Результаты мультиплексного иммуноанализа измеряются в Медиана единицах интенсивности флуоресценции (MFI). Всегда можно найти впоследняя версия программного обеспечения руководства, если таковые имеются, чтобы избежать ошибок.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Один уникальный набор шарик был использован в качестве контроля для измерения неспецифического связывания и образца к образцу изменчивости. Эти шарики обрабатывали идентично с антигеном в сочетании бусинок, за исключением, что они не были инкубированы с любым антигеном, на стадии присоединения. Значения MFI> 500, полученные из шариков управления инкубированных со всеми образцами слюны были удалены из дальнейшего анализа в связи с подозрением на загрязнение из сыворотки, а остальные от...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Эти результаты указывают на то, что мультиплекс метод иммуноанализа полезен для различения между образцами слюны, которые иммунопозитивные или immunonegative. Для определения иммунопозитивность, одна точка отсечения была разработана путем вычисления среднего значения плюс три стандартных отклонения логарифмических MFI откликов контрольных несвязанных шариков тестируемых со всеми образцами слюны. Точка отсечки дает возможность оценить степень воздействия и immunoprevalence либо к одному или нескольким патогенам. Эта диск...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Агентство США по охране окружающей среды через ее Управление по научным исследованиям и разработкам финансируется и управляется исследований, описанных здесь. Он был подвергнут административному пересмотру Агентства и одобрен для публикации. Упоминание торговых наименований или коммерческих продуктов не означает одобрения или рекомендации для использования.

Благодарности

Кларисса Куриозо получила поддержку в рамках Программы участия в исследованиях в Агентстве по охране окружающей среды США, управляемой Институтом науки и образования Оук-Ридж, в рамках межведомственного соглашения между Министерством энергетики США и Агентством по

охране окружающей среды США.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Equipment and Software
MicrocentrifugeThermo Electron Corporation75002446Используется для центрифугирования образцов
Vortex MixerVWR G560Используется для смешивания образцов
Sonicator (mini)Fisher Scientific15-337-22Используется для разделения шариков
Пипетки P10, P20, P100, P1000, 8 сн. Капулеттиразличные
гемацитометры (яркая линия)Housser Scientific 3200Используется для подсчета спаренных шариков
Мультиситовый вакуумный коллекторMilliporeMSVMHTS00Используется на этапах промывки для удаления надосадочной жидкости
MicroShakerVWR12620-926Используется для перемешивания шариков во время инкубации
Штатив для пробирок (1,5 мл и 0,5 мл) (ассорти)VWR30128-346
Весы для взвешиванияMettler или другиеИспользуется для измерения промывочных реагентов для изготовления буферов
Dynabead Sample MixerInvitrogen947-01Используется на этапе инкубации сцепления
MatLab (R2014b)The MathWorks, Inc.Используется для анализа данных об ответе антител
Microsoft Excel 2014Microsoft CorporationИспользуется для анализа данных об ответе антител
Luminex Analyzer с программным обеспечением xPonent 3.1Luminex CorporationLX200-XPON3.1Прибор и программное обеспечение, используемые для проведения анализа
<сильные>антигены
GI.1 Вирус Норуолка: p-частицаXi Цзян (CCHMC)*NA*Детская больница Цинциннати. Итоговая конc. 5 &m;g.
GII.4 Норовирус VA387: p-частицаXi Jiang (CCHMC)*NA*Детская больница Цинциннати. Итоговая конc. 5 &m;g.
Вирус гепатита А: концентрат II степени из клеточной культурыMeridian Life Sciences8505антиген, сопряженный при 100 & микро; g
Helicobacter pylori: лизатMeridian Life SciencesR14101антиген, сопряженный при 25 & микро; g
Toxoplasma gondii: рекомбинантный антиген p30 (SAG1)Meridian Life SciencesR18426связанный при 25 & микро; g
Campylobacter jejuni: тепло убивает целые клеткиKPL50-92-93в сочетании при 50 &микро; g
Primary Антитела
Gunia pig anti-Norovirus(CCHMC)*NAИспользуется для подтверждения сопряжения
Мышиный анти-гепатит А IgGMeridian Life SciencesC65885MИспользуется для подтверждения сопряжения
Мышиный анти-гепатит А IgGMeridian Life SciencesC65885MИспользуется для подтверждения сопряжения
BacTraceAffinity Очищенное антитело к Helicobacter pyloriKPL01-93-94Используется для подтверждения сопряжения
Goat pAb to Toxoplasma gondiiAbcamAb23507Используется для подтверждения сопряжения
BacTrace Goat anti-Campylobacter видаKPL01-92-93Используется для подтверждения сопряжения
<сильный>Вторичный  Антитела
Биотин-SP-Конъюгированный AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L)Jackson705-065-149Используется для подтверждения
сцепления Биотинилированный кролик против коз IgG (H+L)KPL16-13-06Используется для подтверждения сцепления
Биотинилированный козий анти-мышиный IgG (H+L)KPL16-18-06Используется для подтверждения
сцепленияAffinity Purified Antibody Biotin Меченый козий анти-кролик IgG (H+L)KPL176-1506Используется для подтверждения
<сильно>Расходные материалы
1,5 мл сополимерные микроцентрифужные пробиркиСША Scientific1415-2500Используется в качестве микроцентрифужных пробирок с низким связыванием
10 & микро; l наконечник для пипеткиBioVentures5030050C
200 &; l наконечник для пипеткиBioVentures5030080C
1,000 &; l наконечник для пипетки заправкаBioVentures5130140C
Алюминиевая фольгаРазличные поставщикиИспользуется для хранения бусин в темноте во время инкубации
Планшеты для глубоких лунокVWR40002-009Используются для разбавления образцов слюны
Multiscreen Фильтрующие пластиныMilliporeMABVN1250Используются для проведения анализов
Система сбора слюны OracolMalvern Medical Разработки ограниченыИспользуется для сбора слюны
<сильно>Реагенты
карбоксилированные микросферы (шарики)Luminex CorporationВ зависимости от набора шариковантигены связаны с микросферами
EDC (1-этил-3-[3-диметиламинопропил] карбодиимида гидрохлорид)Пирс77149 или 22980Используется для активации
шариковSulfo-NHS (N-гидроксисульфосукцинимид)Pierce24510Используется для активации шариков
Steptavidin-R-phycoerythrin (1 мг/мл)Молекулярные зондыS-866Используется в качестве репортера
MES (2-[N-Morpholino]этансульфоновая кислота)SigmaM-2933Используется для связывания
Tween-20 (Полиоксиэтиленорбитан монолаурат)SigmaP-9416Используется в буфере для промывки для удаления неспецифических связывающих
<сильных>белковых буферов
<сильных>PBS-TBN блокирующих/хранящих буферов (PBS, 0,1% BSA, 0,02% Tween-20, 0,05% азида, pH 7,4)**Фильтр Стерилизовать и хранить при температуре 4 ° C
PBS, pH 7,4SigmaP-3813138 mM NaCl, 2,7 mM KCl
BSASigmaA-78880,1% (w/v)
Tween-20SigmaP-94160,2% (v/v)
Азид натрия (0,05% азид)**SigmaS-8032**Caution: Азид натрия остро токсичен. Избегайте попадания на кожу и в глаза. Носите соответствующие СИЗ. Утилизировать в соответствии с действующим законодательством.
MES/Coupling Buffer (0,05 М MES, pH 5,0)
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)SigmaS-3139
5 N NaOHFisherSS256-500
Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7,4)  Фильтр Стерилизовать и хранить при температуре 4 °°С; C
PBS, 1% BSA, pH 7,4SigmaP-3688138 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 1% BSA
Activation Buffer (0,1 м2PO4, pH 6,2)Фильтр Стерилизовать и хранить при температуре 4 °°; C
2PO4 (Фосфат натрия, одноосновной безводный)SigmaS-31390,1 M2PO4
5 N NaOHFisherSS256-500
Буфер для промывки (PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4)Фильтр Стерилизовать и хранить при температуре 4° C
PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4SigmaP-3563138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,05% TWEEN
, Антиген

Ссылки

  1. Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. , World Health Organization. Geneva. (2008).
  2. Augustine, S., et al. Statistical approaches to developing a multiplex immunoassay for determining human exposure to environmental pathogens. J Immunol Methods. 425, 1-9 (2015).
  3. Griffin, S., et al. Application of salivary antibody immunoassays for the detection of incident infections with Norwalk virus in a group of volunteers. J Immunol Methods. 424, 53-63 (2015).
  4. Griffin, S., Chen, I., Fout, G., Wade, T., Egorov, A. Development of a multiplex microsphere immunoassay for the quantitation of salivary antibody responses to selected waterborne pathogens. J Immunol Methods. 364 (1-2), 83-93 (2011).
  5. Ferguson, D. Current diagnostic uses of saliva. J Dent Res. 66, 420-424 (1987).
  6. Mandel, I. The diagnostic uses of saliva. J Oral Pathol Med. 19, 119-125 (1990).
  7. Malamud, D. Saliva as a Diagnostic Fluid. Brit Med J. 305, 207-208 (1992).
  8. Ballam, L., et al. Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection. J Clin Pathol. 53, 314-317 (2000).
  9. Estevez, P., Satoguina, J., Nwakanma, D., West, S., Conway, D., Drakeley, C. Human saliva as a source of anti-malarial antibodies to examine population exposure to Plasmodium falciparum. Malar J. 10, 104(2011).
  10. Abd-Alla, M., Jackson, T., Reddy, S., Ravdin, J. Diagnosis of invasive amebiasis by enzyme-linked immunosorbent assay of saliva to detect amebic lectin antigen and anti-lectin immunoglobulin G antibodies. J Clin Microbiol. 38 (6), 2344-2347 (2000).
  11. Toyoguchi, A., et al. Antibody reactivity to Cryptosporidium parvum in saliva of calves after experimental infection. J Vet Med Sci. 62 (11), 1231-1234 (2000).
  12. Choo, S., Zhang, Q., Seymour, L., Akhtar, S., Finn, A. Primary and booster salivary antibody responses to a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in infants. J Infect Dis. 182 (4), 1260-1263 (2000).
  13. Tourinho, R., et al. Importance of the cutoff ratio for detecting antibodies against hepatitis A virus in oral fluids by enzyme immunoassay. J Virol Methods. 173 (2), 169-174 (2011).
  14. Moorthy, M., Daniel, H., Kurian, G., Abraham, P. An evaluation of saliva as an alternative to plasma for the detection of hepatitis C virus antibodies. Indian J Med Microbiol. 26 (4), 327-332 (2008).
  15. Moe, C., Sair, A., Lindesmith, L., Estes, M., Jaykus, L. Diagnosis of norwalk virus infection by indirect enzyme immunoassay detection of salivary antibodies to recombinant norwalk virus antigen. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1028-1034 (2004).
  16. Yap, G., Sil, B., Ng, L. Use of saliva for early dengue diagnosis. PLoS Negl Trop Dis. 5 (5), e1046(2011).
  17. Schramm, W., Angulo, G., Torres, P., Burgess-Cassler, A. A simple saliva-based test for detecting antibodies to human immunodeficiency virus. Clin Diagn Lab Immunol. 6 (4), 577-580 (1999).
  18. Chart, H., Perry, N., Willshaw, G., Cheasty, T. Analysis of saliva for antibodies to the LPS of Escherichia coli O157 in patients with serum antibodies to E. coli O157 LPS. J Med Microbiol. 52 (Pt 7), 569-572 (2003).
  19. Ashbolt, N., Bruno, M. Application and refinement of the WHO risk framework for recreational waters in Sydney, Australia. J Water Health. 1 (3), 125-131 (2003).
  20. Westrell, T., Schonning, C., Stenstrom, T., Ashbolt, N. QMRA (quantitative microbial risk assessment) and HACCP (hazard analysis and critical control points) for management of pathogens in wastewater and sewage sludge treatment and reuse. Water Sci Technol. 50 (2), 23-30 (2004).
  21. Ashbolt, N. Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions. Toxicology. 198 (1-3), 229-238 (2004).
  22. Eisenberg, J., Soller, J., Scott, J., Eisenberg, D., Colford, J. Jr A dynamic model to assess microbial health risks associated with beneficial uses of biosolids. Risk Anal. 24, 221-236 (2004).
  23. Wade, T. J., et al. Report on 2009 National Epidemiologic and Environmental Assessment of Recreational Water Epidemiology Studies, US EPA. US EPA Report Number: EPA/600/R-10/168: US EPA2011. , (2011).
  24. Fujii, Y., et al. Serological surveillance development for tropical infectious diseases using simultaneous microsphere-based multiplex assays and finite mixture models. PLoS Negl Trop Dis. 8, e3040(2014).
  25. Rota, M., Massari, M., Gabutti, G., Guido, M., De Donno, A., Ciofi degli Atti, M. Measles serological survey in the Italian population: interpretation of results using mixture model. Vaccine. 26 (34), 4403-4409 (2008).
  26. Vyse, A., Gay, N., Hesketh, L., Pebody, R., Morgan-Capner, P., Miller, P. Interpreting serological surveys using mixture models: the seroepidemiology of measles, mumps and rubella in England and Wales at the beginning of the 21st century. Epidemiol Infect. 134 (6), 1303-1312 (2006).
  27. Baughman, A., et al. Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1045-1053 (2004).
  28. Clotilde, L., Bernard, C. IV, Hartman, G., Lau, D., Carter, J. Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods. J Food Prot. 74 (3), 373-379 (2011).
  29. Luminex User Software Manual (RUO) xPONENT 3.1 Rev. 2. 3, 6-102 (2014).
  30. Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays. J Immunol Methods. 309 (1-2), 200-204 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

R PE
Разработка слюнных антитела Multiplex иммуноанализа для измерения воздействия на человека окружающей среды патогенам
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.