Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Разработка Антиген-ведомой колита моделью для изучения Презентация антигенами путем антигенпрезентирующих клеток, Т-клеткам

8.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54421

⸱

18 сентября 2016 г.

 ,  ,  , 
1APC Microbiome Institute, University College Cork, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital Basel, 3Institute of Microbiology and Biotechnology, University of Ulm

В этой статье

Краткое содержание

В этой модели колита, вызванного антигеном, CD4+ Т-клетки OT-II, экспрессирующие красный флуоресцентный белок, были адоптивно перенесены мышам RAG-/-, которые экспрессируют зеленый флуоресцентный белок в мононуклеарных фагоцитах (МП). Хозяев подвергали воздействию Escherichia coli (E.coli), экспрессирующей белок овальбумин (OVA), слитый с голубым флуоресцентным белком (CFP).

Аннотация

Воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) - это хроническое воспаление, которое поражает желудочно-кишечный тракт (ЖКТ). Одним из лучших способов изучения иммунологических механизмов, задействованных во время заболевания, является модель переноса Т-клеток колита. В этой модели иммунодефицитные мыши (реципиенты RAG-/-) восстанавливаются наивными CD4+ Т-клетками от здоровых хозяев дикого типа.

Эта модель позволяет исследовать самые ранние иммунологические события, приводящие к заболеванию и хроническому воспалению, когда воспаление кишечника сохраняется, но не зависит от определенного антигена. Для изучения потенциальной роли антигенпрезентирующих клеток (АПК) в процессе заболевания полезно иметь антиген-обусловленную модель заболевания, в которой определенный комменсальный антиген приводит к колиту. В связи с этим была разработана модель антиген-обусловленного колита. В этой модели CD4+ Т-клетки OT-II, которые могут распознавать только специфические эпитопы в белке OVA, переносятся в RAG-/- хозяев, пораженных CFP-OVA-экспрессирующей E. coli. Эта модель позволяет исследовать взаимодействия между APC и Т-клетками в собственной пластинке.

Введение

Кишечника является крупнейшим поверхности тела, которая подвергается воздействию внешней среды. Обширные массивы резидентных микробов колонизировать кишечник человека с образованием кишечной микробиоты (или микрофлору). Это, по оценкам, состоит до 100 триллионов клеток микроорганизмов и является одним из самых густонаселенных бактериальных сред обитания известных в биологии 1-3. В GIT бактерии заселяют кишечную нишу , где они выживают и размножаются 4. В свою очередь, микрофлора жертвует хозяина с дополнительными функциональными особенностями не закодированы на своем геноме 1. Например, микрофлора стимулирует пролиферацию эпителиальных клеток, производит витамины , которые проходят не может производить самостоятельно, регулирует обмен веществ и защищает от патогенных микроорганизмов 4-6. Учитывая это выгодные отношения, некоторые авторы полагают , что люди являются «супер-организмы" или "holobionts" , которые представляют собой сочетание бактериальных и человеческих генов 7,8, Учитывая благотворное влияние микробиоты на (человека) хозяина, кишечная иммунная система должна терпеть комменсальных микробы , с тем чтобы их существование в просвет , но и убивают болезнетворные микроорганизмы , которые вторгаются с полостной стороны 9-11. Кишечный иммунная система разработала механизмы различать между безвредные и потенциально вредных микробов в просвете; Однако эти механизмы еще далеко не понята 12. Поддержание целостности кишечника требует жестко регулируется иммунного гомеостаза , чтобы сохранить баланс между толерантностью и иммунитета 13. Дисбаланс иммунного гомеостаза способствует индукции кишечных заболеваний , таких как воспалительное заболевание кишечника (IBD) 3,14.

Существуют два основных типа IBD: болезнь Крона (CD) и язвенного колита (ЯК). У больных с этими заболеваниями , как правило , страдают от ректального кровотечения, тяжелая диарея и боли в животе 15,16. Единственная причина IBD по-прежнемунеизвестен, но сочетание генетических факторов, воздействия окружающей среды и дизрегуляции иммунных реакций может быть ключевым событием для развития болезни 15.

Животные модели для IBD были использованы в течение более 50 лет. В последние несколько десятилетий новые модельные системы IBD были разработаны для проверки различных гипотез о патогенезе IBD 17,18. Наиболее характеризуется модель хронического колита является модель переноса Т-клеток , что вызывает нарушение Т-клеточного гомеостаза 19,20. Эта модель включает в себя перенос наивных Т - клеток от иммунокомпетентных мышей в хозяев , которые испытывают недостаток Т и В-клеток (например, КГР - / - и SCID мышей) 16,21. Развитие болезни в этой модели отслеживается в течение 3-10 недель, оценивая наличие диареи, снижение физической активности, а также потерю массы тела. Это так называемый синдром расточительствуя 16. По сравнению с здоровых мышей толстой ткани пересаженных хозяев является Тикг, короче и тяжелее 16. С помощью модели переноса Т - клеток, можно понять , каким образом различные популяции Т - клеток может внести свой ​​вклад в патогенез IBD 22. Модель переноса Т-клеток не анализирует взаимодействие между АРС и Т-клеток в процессе болезни в антиген-специфическим образом. Было показано , что взаимодействие между миелоидных клеток и лимфоидные клетки могут быть ответственны за развитие воспаления кишечника 23. Хотя многие аспекты IBD были выяснены, начальные события, которые приводят к развитию болезни по-прежнему необходимо четко понимать.

Было показано , что при отсутствии передачи микрофлора колита не может быть установлено 24. В последнее время , несколько теорий , позволяют предположить , что ВЗК может быть результатом иммунной реакции против синантропных бактерий 25. Авторы также предложили, что синантропных бактерий необходимы, чтобы вызвать воспаление в дистальной кишке26. В свободных от бактерий (GF) животных кишечной иммунной системы , как правило , с нарушениями 27,28, но колонизация этих мышей со смесью специфических-патогена бактерий приводит к развитию полностью компетентной кишечной иммунной системы 29. Следовательно, микрофлора , как представляется, является ключевым элементом в патогенезе IBD, либо в качестве механизма , который предрасполагает или защищает от развития кишечных воспаления 30,31. Современные теории предполагают , что IBD является результатом микробного дисбаланса, называемого дисбактериоза, у генетически предрасположенных пациентов 32, но пока не ясно , если дисбактериоз является причиной или следствием заболевания 12. Принимая во внимание роль микроорганизмов в развитии IBD, в пробирке эксперименты показали , что CD4 + Т - клетки могут быть активированы с помощью АРС импульсными с кишечными бактериями 33,34.

Кроме того, было показано, что антигены изразличных синантропных видов бактерий, таких как E. палочка, Bacteroides, Eubacterium и Proteus, способны активировать CD4 + Т - клеток 35. Это указывает на то, что представление бактериальных антигенов Т-клеткам имеет важное значение для развития IBD. Для того, чтобы уменьшить сложность нескольких антигенов , полученных микрофлорой в процессе болезни, штамм E.coli был создан , который производит антиген OVA. Передача колиты индуцировали путем инъекции OVA-специфических Т - клеток в КГР - / - животные колонизировали с OVA-экспрессирующие E. палочки.

Эта модель основана на последних данных , свидетельствующих о том , что CX 3 CR1 + депутаты, главным подмножество клеток в собственной пластинке слизистой оболочки толстой кишки (CLP) 36, взаимодействуют с CD4 + Т - клеток во время передачи колита 37. Депутаты образца просвет кишечника по отношению к антигену частиц, таких как бактерии, используя их дендриты 36, 38,39. Предыдущие исследованияпоказали , что депутаты могут также занять растворимые антигены, такие как OVA, введенные в просвете кишечника 40,41. Учитывая обилие СХ 3 CR1 + MPs в ПСЯ, вполне возможно , что эти клетки могут попробовать бактерии и в его стенке взаимодействуют с CD4 - Т - клетками. Конфокальной изображения мышей трансплантировали OVA-специфических CD4 + Т - клеток с колонизацией Е. палочка КФП-ОВА, показывают , что СХ 3 CR1 + депутаты находятся в контакте с ОТ-II CD4 + Т - клеток при разработке антигенного управляемой колита. Эта модель позволяет исследовать процесс презентации антигена между кишечными БТРах и Т-клеток, специфичных только для конкретных антиген-экспрессирующими бактерий в просвет кишечника.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Мыши были выведены и держали под конкретного патогена (SPF) условиях в виварии из университета Ульма (Ульм, Германия). Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами местного использования животных и комитетом по уходу и права национального благосостояния животных.

1. Строительство PCFP-OVA плазмиды

  1. Amplify полный ген размер OVA с использованием праймеров Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') и Ova_ClaI_rev (3'- GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') 37 с использованием плазмиды пКи-OVA (устойчивых к ампициллину) 42 в качестве матрицы. Клонирование продукта ПЦР (то есть последовательности , кодирующей OVA) в коммерчески доступный фагов середине вектор с использованием SpeI и ClaI Ограничения участки праймеров и вектора , чтобы получить конкретную OVA-плазмиды.
  2. Амплификации гена КФП-кодирования вместе с сильным конститутивным промотором Р гипер с использованием плазмиды пэду 1 -cCFP (хлорамфеникол резистентный) 43 в качестве матрицы и праймеров , CFP_SacII_fw (3'-GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5 ') и CFP_SpeI_rev (3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5') 37.
  3. Клонирование гена CFP-кодирования в специфическую ОВА-плазмиды (ампициллин устойчивостью) , используя сайты рестрикции SpeI и SacI праймеров и вектора 37. Это вводит распорку 6 остатков глицина между CFP-кодирования из последовательности OVA-кодирования.

2. Строительство Е. coli PCFP-OVA

  1. Grow E.coli штамма DH10B в 100 мл Лурии Бертани (LB) среде аэробно при 37 ° С на ротационном шейкере в течение ночи.
  2. Смешайте 800 мкл бактериальной культуры с 200 мкл глицерина для создания глицерине и хранят при -80 ° С.
  3. Добавляют 50 мкл E.coli штамма DH10B из раствора в глицерине в 5 мл LB-среды и выращивают их в аэробных условиях при 37 ° С на ротационном шейкере Овеrnight.
  4. Перенести культуру в разделительными перегородками 1-литровую колбу Эрленмейера с 250 мл LB среды при 37 ° С в роторном дрожанием.
  5. Grow бактерии до оптической плотности при 600 нм (OD 600) 0,5, а затем охладить культуру на льду в течение 30 мин. Центрифуга бактерии при 5000 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
  6. Ресуспендируют бактерии с 100 мл ледяной стерильной H 2 O и центрифугами бактерий в количестве 5000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С ресуспендирования бактерий с 100 мл охлажденного льдом 10% глицерина и центрифуге бактерий при 5000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С. Повторите этот последний шаг дважды.
  7. После заключительной стадии промывки, ресуспендируют бактерий в 700 мкл 10% -ного глицерина. Замораживание 50 мкл аликвоты в жидком азоте и хранят при -80 ° С.
  8. Оттепель 50 мкл аликвоты на льду и переноса в предварительно охлажденную кювету для электропорации (2 мм), расстояние между электродами.
  9. Добавьте 5 мкл плазмидной ДНК (100 нг) в 50 мкл E. палочки aliquoц. Выполните электропорации с помощью одного импульса при 25 мкФ, 200 Ом (Ом) и 2,5 кВ.
  10. Ресуспендируют бактерий в 1 мл подогретого SOC среднего (5 г / л дрожжевого экстракта, 2 г / л триптона, 10 мМ хлорида натрия, 2,5 мМ хлорида калия, 10 мМ хлорид магния, 10 мМ сульфат магния) и инкубируют при температуре 37 ° С аэробно в течение 1 часа.
  11. Пластинчатые бактерии на LB-чашках с агаром с добавлением ампициллина, 100 мкг / мл (100 мкл 100 мг / мл ампициллина запаса в 100 мл LB-агар) и инкубировать в течение ночи аэробно при 37 ° С.
  12. Выберите одиночные колонии и повторное их в полосу LB-чашки с агаром, дополненной ампициллин 100 мкг / мл. Выдержите в течение ночи аэробно при температуре 37 ° С.
  13. Выберите одиночные колонии и выращивают их в течение ночи в 10 мл LB среде с ампициллин 100 мкг / мл для выделения плазмид. Используйте имеющиеся в продаже плазмиды мини - набор подготовительную и элюции плазмидной ДНК с 30 мкл дН 2 O (дистиллированная вода) в зависимости от производителя ", S протокол. Проверьте плазмид путем рестрикционного анализа и секвенирования ДНК 37,42,43.
  14. Настройка культуры положительных клонов Е. палочка PCFP-ОВА в 100 мл LB среды с добавлением ампициллина , 100 мкг / мл. Grow аэробно при 37 ° С на ротационном шейкере в течение ночи.
  15. Смешайте 800 мкл бактериальной культуры с 200 мкл чистого глицерина и хранят при -80 ° С.
  16. Центрифуга остальную часть ночной культуры при 5000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре (RT) и ресуспендируют осадок в фосфатно-солевом буфере (PBS). Поместите 10 мкл суспензии на предметное стекло и накройте ее покровным.
  17. Обратите внимание на образцы в стандартной флуоресцентной микроскопии для подтверждения экспрессии флуоресценции CFP-OVA (CFP возбуждение при 450 нм, излучение на длинах волн 480 нм). Анализ бактерий, начиная с увеличением 400X.
  18. Центрифуга 1 мл бактерий из ночных культур в количестве 5000 мкг в течение 10 мин, RT. Ресуспендируют осадок в 40 мклPBS и кипят при температуре 95 ° С в течение 10 мин.
  19. Центрифуга образцов при 30000 х г в течение 10 мин и используют супернатанты для Вестерн - блот - анализа 37. Используйте кролика-рейз против OVA поликлональные антитела, разбавленного 1: 400.

3. Генерация OT-II / Красный Мыши

  1. Крест мужчина / женщина OT-II мышь с женской / мужской мыши , выражающей красный флуоресцентный белок (оба штамма имеются в продаже) для того , чтобы генерировать OT-II / Red мышей 37.

4. Селезенка Выделение клеток

  1. Эвтаназии ОТ-II / Red мышей путем смещени шейных позвонков после анестезии при вдыхании любого галоидированного эфира (до 5% индукции), коммерчески доступны.
  2. Используйте ножницы, чтобы вырезать левой верхней брюшной части мыши. Под этим брюшной части есть селезенка (овальной формы с темно-красного цвета). Используйте ножницы и пинцет, чтобы удалить его.
    1. Извлечение селезенке / красный мышей ОТ-II и передать его через 100ячейки фильтра мкм расположены по 50 мл пробирку с помощью плунжера шприца емкостью 1 мл, чтобы получить одно-клеточной суспензии. Промыть сетчатый фильтр дважды с 10 мл PBS с добавлением 1% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS).
  3. Центрифуга клеточной суспензии при 390 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют осадок с помощью 5 мл подогретого буфера для лизиса (144 мМ NH 4 Cl, 17 мМ Трис, рН = 7,2) , чтобы лизировать красные кровяные клетки. Инкубировать 10 мин при 37 ° С.
  4. Отмывки образца с 25 мл PBS с добавлением 1% FBS. Центрифуга при 390 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют осадок в 10 мл PBS с добавлением 1% FBS.
  5. Граф клеток с использованием счетной камере Neubauer. Смешайте 10 мкл суспензии клеток с 10 мкл 0,4% раствора трипанового синего. Инкубируют в течение 1-2 мин.
    1. Заполните гемоцитометра камеру с 10 мкл окрашенных клеток. Граф клеток под микроскопом в четырех 1 х 1 мм 2 квадраты одной камеры и determinе среднее число клеток на квадратный. Жизнеспособные клетки появляются белые, мертвые клетки кажутся синими. Для того, чтобы определить количество клеток / мл умножить число клеток на коэффициент разбавления. Если 2-4 квадранта подсчитываются, делят на число квадрантов.

5. CD4 + CD62 L + T Cell Обогащение

  1. Пополните клетки селезенки для CD4 + CD62L + Т - клеток с помощью набора магнитной изоляции с использованием принципов негативного или позитивного отбора. Здесь используют негативный отбор для выделения CD4 + Т - клеток и использовать положительный отбор для дальнейшего обогащения для CD62L + населения в пределах клеточного пула CD4 + T.
    Примечание: В отрицательной процедуре отбора, клетки, которые не будут изолированы (здесь: все CD4 отрицательные клетки) помечены специфическими антителами, связанными с магнитными микрогранул. Во время стирки колонки шаги CD4 + Т - клетки будут проходить через колонку таким образом , чтобы они могли быть ПодобнееLY собраны. В положительном процедура отбора клеток, которые будут изолированы помечены соответствующим антителом в сочетании с магнитными микрогранул. Во время стирки колонки шаги меченые клетки будут оставаться в колонке, и они могут быть собраны путем удаления колонки из магнитного поля и прополоскнуть буфером.
  2. Для отрицательной процедуры отбора, ресуспендируют 10 7 тотального количества клеток селезенки в 40 мкл холодного PBS , дополненной 0,5% бычьим сывороточным альбумином (БСА). Добавьте 10 мкл биотин маркированы коктейль антител , поставляемой в комплекте магнитной изоляции (специфических антител , связывающих не-CD4 + Т - клеток) и инкубировать в течение 15 мин на льду.
    1. Добавьте 30 мкл холодного PBS с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 20 мкл анти-биотин микрогранул. Инкубировать 20 мин на льду.
    2. Добавить в образце 10 мл PBS с 0,5% BSA и центрифуге, дополненной при 390 х г в течение 5 мин. Повторите этот шаг дважды. Ресуспендируют клеток в 1 мл холодного PBS, дополненной 0,5% BSА.
    3. Поместите колонку, специфичного для отрицательной процедуры отбора в магнитном поле и промыть 3 мл холодного PBS с 0,5% BSA, дополненной на колонку. Добавить клеточной суспензии на колонку и промыть 3 раза с 3 мл холодного PBS с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина.
    4. Центрифуга клетки истекающей при 390 х г в течение 5 мин. Стоки прохождения через колонку содержит немаркированные CD4 + Т - клеток. Ресуспендируют осадок в 1 мл PBS, дополненной 0,5% БСА и подсчета клеток.
    5. Граф клеток с использованием счетной камере Neubauer. Смешайте 10 мкл суспензии клеток с 10 мкл 0,4% раствора трипанового синего. Инкубируют в течение 1-2 мин.
      1. Заполните гемоцитометра камеру с 10 мкл окрашенных клеток. Граф клеток под микроскопом в четырех 1 х 1 мм 2 квадраты одной камеры и определить среднее число клеток на площади. Жизнеспособные клетки появляются белые, мертвые клетки кажутся синими. Для того, чтобы определить количество клеток / мл умножить Celл число на коэффициент разбавления. Если 2-4 квадранта подсчитываются, делят на число квадрантов.
  3. Для положительного процедуры отбора, добавьте 10 мкл CD62L микрошариков на 10 7 предварительно обогащенной фракции клеток CD4 + T. Инкубировать 15 мин на льду.
    1. Добавить в образце 10 мл PBS с 0,5% BSA и центрифуге, дополненной при 390 х г в течение 5 мин. Повторите этот шаг дважды. Ресуспендируют в 500 мкл холодного PBS с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина.
    2. Поместите конкретный столбец для отрицательной процедуры отбора в магнитном поле и промыть 500 мкл холодного PBS, дополненной 0,5% бычьего сывороточного альбумина на колонку. Добавить клеточной суспензии на колонку и промыть 3 раза с 500 мкл холодного PBS с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина.
    3. Удалить столбец из магнитного поля и поместить его на подходящую пробирку. Добавить 1 мл PBS , дополненной 0,5% БСА в колонку и вымывать CD4 + CD62L + Т - клеткиы удерживается в колонке, плотно нажимая на поршень в колонну.
      Примечание: Выделенные CD4 + CD62L + Т - клетки теперь готовы для последующих приложений, таких как эксперименты в естественных условиях. В соответствии с инструкцией изготовителя из комплекта изоляции клетки CD4 + CD62L + Т, микрошариков не являются токсичными. Из-за небольшого размера (около 50 нм), они не активируют клетки, и они не будут насыщать клеточной поверхности эпитопы. Поэтому выделенные клетки могут быть перенесены в иммунодефицитных мышей , чтобы побудить колита 37,44,45.
    4. Граф клеток с использованием счетной камере Neubauer. Смешайте 10 мкл суспензии клеток с 10 мкл 0,4% раствора трипанового синего. Инкубируют в течение 1-2 мин.
      1. Заполните гемоцитометра камеру с 10 мкл окрашенных клеток. Граф клеток под микроскопом в четырех 1 х 1 мм 2 квадраты одной камеры и определить среднее число клеток на площади. Жизнеспособные клетки appeaг белые, мертвые клетки кажутся синими. Для того, чтобы определить количество клеток / мл умножить число клеток на коэффициент разбавления. Если 2 - 4 квадранта подсчитываются, делят на число квадрантов.

6. Индукционный антигенпрезентирующих ведомой Колит

  1. Вводят внутрибрюшинно 3 х 10 5 OT-II / Красный CD4 + CD62L + Т - клеток в CX 3 CR1 / GFP + х КГР - / - мышей. Для индукции антиген-специфического колита, администрировать E. палочка PCFP-ОВА каждый второй день в дозе 1 × 10 8 колониеобразующих единицы (CFU) в 100 мкл PBS на одно животное через желудочный зонд или пероральном инстилляции за резцами.
  2. Монитор два раза в неделю вес тела трансплантированных мышей и их клиническое состояние (наличие крови в стуле, консистенции стула и активности мышей).

7. Образцы ткани для гистопатологического исследования

  1. Возьмите образцы ткани из-йе толстой кишки мышей, фиксируют в нейтральном буферном растворе формалина (10%), встраивает в парафине , как описано выше 36,46.
  2. Раздел образцы парафина на микротомом, смонтировать на слайдах, а также выполнять пятно 47,48 H & ​​E.
  3. Классифицировать гистологию толстой кишки, опубликованной ранее 47,48: нормальный (0 баллов); мягкий колиты (1 балла), умеренная колиты (оценка 2) и тяжелой колита (3 балла).

8. Выделение Толстокишечная Propria клеток Lamina

  1. Эвтаназии трансплантированных мышей путем смещения шейных позвонков после анестезии при вдыхании любого галогенированного эфира (до 5%) для индукции коммерчески доступного.
  2. Поместите животное вниз с животом вверх. Используйте пинцет, чтобы захватить кожу кпереди, чтобы отверстие мочеиспускательного канала. Используйте ножницы, чтобы разрезать кожу вдоль вентральной срединной линии от паха до груди. Потяните кожу обратно по бокам.
  3. Вырезать через прозрачную брюшную стенку мышц иоткрывая полость тела. Определить толстую кишку , которая идет от заднего прохода к слепая кишка 49. Нарезать 2 конечностями и освободить ткань от любого жира.
  4. Откройте толстую кишку в продольном направлении с использованием рассечение ножницами. Используйте пинцет, чтобы встряхнуть ткани толстой кишки в чашку Петри, содержащую 25 мл PBS с добавлением 1% FBS для удаления мусора и слизистой. Вырезать толстую кишку на 5 - 8 мм штук.
  5. Поместите сегменты толстой кишки в 50 мл пробирку, содержащую 20 мл промывочного буфера. Буфер Wash содержит 500 мл DPBS, 10мм Hepes и 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).
  6. Vortex через трубку в течение 30 с при максимальной скорости.
  7. Инкубируйте пробирку с сегментами двоеточием в водяной бане при температуре 37 ° С с 200 оборотов в минуту встряхивания в течение 10 мин.
  8. После инкубации вихревые трубки в течение 30 с при максимальной скорости.
  9. Откажитесь супернатанты и поместить образцы ткани в новой 50 мл пробирку, содержащую 20 мл буфера для промывки. Повторите шаги 6-9 три раза
  10. Откажитесь от Supernatants и поместить образцы ткани в чашку Петри, содержащую 25 мл PBS. Используйте пинцет, чтобы осторожно встряхните образцы ткани в чашке Петри в течение нескольких секунд, чтобы удалить остаточные эпителиальные клетки. Повторите этот шаг три раза.
  11. Вырезать толстой ткани в 2 х 2 мм 2 части и переваривают их путем инкубации в 10 мл института Roswell Park Memorial (RPMI) среде с 0,5 мг / мл коллагеназы типа VIII из Clostridium histolyticum и 10 ед / мл DNAseI.
  12. Vortex через трубку в течение 30 с при максимальной скорости.
  13. Инкубируют фрагменты толстой кишки на водяной бане при температуре 37 ° С при 200 оборотов в минуту встряхивания в течение 35 мин и вихревые трубки в течение 30 с при максимальной скорости через каждые 5 мин.
  14. В конце инкубации вихревой трубки в течение 30 с при максимальной скорости.
  15. Сбор переваренных фрагментов, пропуская их через сито 70 ячейки мкм, расположенной на новой 50 мл пробирку.
  16. Отмывки образца путем добавления 20 мл ДЗФР и центрифугировать при 400 г в течение 5 мин. Тогда ресуспендируют тон клеток в 1 мл ДЗФР.
  17. Граф клеток с использованием счетной камере Neubauer. Смешайте 10 мкл суспензии клеток с 10 мкл 0,4% раствора трипанового синего. Инкубируют в течение 1-2 мин.
    1. Заполните гемоцитометра камеру с 10 мкл окрашенных клеток. Граф клеток под микроскопом в четырех 1 х 1 мм 2 квадраты одной камеры и определить среднее число клеток на площади. Жизнеспособные клетки появляются белые, мертвые клетки кажутся синими. Для того, чтобы определить количество клеток / мл умножить число клеток на коэффициент разбавления. Если 2-4 квадранта подсчитываются, делят на число квадрантов.

9. внеклеточной Окрашивание для анализа ТСМ

  1. Центрифуга клетки 5 ClP мин при 390 х г. Ресуспендируют клеток в 1 мл FACS А (ФБР с добавкой 1% БСА и 0,1% азида натрия)
    Примечание: азид натрия очень токсичен. Это может привести к гипотонии, гипотермия, головная боль судороги или смерти. Разбавленные растворы азида натрия (00,1 до 1,0%), как правило, не представляют чрезвычайные опасности для пользователя, но они глаз и кожи раздражающие вещества. Поэтому использовать азид натрия только в химической капотом во время ношения лабораторный халат и двукратную пару одноразовых нитриловые перчатки.
  2. Инкубируйте клетки в течение 15 мин при комнатной температуре с моноклональными антителами (МКА) 2.4G2 , направленной против FcγRIII / II CD16 / CD32 (0,5-1 мкг моноклональными / 10 6 клеток) , разведенного в FACS А.
  3. Добавить 200 мкл FACS-A к клеткам и центрифугировать 5 мин при 390 х г. Повторите этот шаг дважды. Инкубируйте клетки с 0,5 нг / 10 6 клеток соответствующего мАт в течение 20 мин при 4 ° C. Развести антитела в FACS А.
  4. Добавить 200 мкл FACS-A к клеткам и центрифугировать 5 мин при 390 х г. Повторите этот шаг дважды. Ресуспендируют образцы в 100 мкл FACS А.
  5. Анализ Т - клеток из CX 3 CR1 GFP / + х КГР - / - мышей воссозданные с OT-II / Красный CD4 Т - клеток на проточном цитометре 37.
  6. Анализ данных с использованием коммерчески доступного программного обеспечения.

Анализ 10. конфокальной микроскопии

  1. Анализ толстой кишки CX 3 CR1 GFP / + мышей разведенных или не с OT-II / Красный CD4 + CD62L + Т - клеток и кормили перорально каждый второй день с 1 х 10 8 КОЕ Е. штамм E.coli DH10B PCFP-OVA.
  2. Удалить толстую кишку у мышей с помощью ножниц и пинцетов. Открыть его в продольном направлении с помощью рассечения ножницами.
  3. Вырезать 5-8 мм часть образца толстой кишки с помощью ножниц, положить на стеклах и накрыть покровные.
  4. Анализ образцов толстой кишки с помощью конфокального микроскопа при увеличении в 40 / 1.30.
  5. Обнаружить CX 3 CR1 + парламентариям, меченый зеленым флуоресцеина белка (GFP), используя набор фильтров с возбуждением при длине волны 488 нм и эмиссии при 509 нм.
  6. Обнаружить CD4 + Т - клетки , экспрессирующие красный белок , используя набор фильтров с возбуждением при 554 нм и эмиссии на 586 нм.
  7. Обнаружение E.coli PCFP-OVA , используя набор фильтров с возбуждением при длине волны 450 нм и излучение на длине волны 480 нм.
  8. Определить область интереса и генерировать диаграммы рассеяния , как описано выше 50 , чтобы провести анализ совместной локализации. Используйте 2 различные формулы: Перекрытие коэффициент согласно Manders и коэффициент Пирсона.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для того, чтобы установить антиген управляемой колиты моделирующие E. штамм был построен , который содержит плазмиду , в которой ген для CFP слита с последовательностью , кодирующей белок куриного овальбумина и слитой конструкции экспрессируется под контролем сильного конститутивного промотора P гипер (фиг.1А). Флуоресцентная микроскопия показывает , что рекомбинантный E. PCFP палочка-OVA, но не родительская Е...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Как и с любой другой моделью, антиген управляемой модели колита описано выше, может представлять несколько вопросов, которые следователь, выполняющий технику должны быть в курсе. При инъекции OT-II / красный + CD4 + T CD62L + клетки в хостах, исследователь должен быть очень нежным и осторожным , чтобы вставить иглу в брюшную полость. Несоблюдение этого правила может привести к разрыву кишечника мыши, которая может привести к смерти или подкожного введения клеток, которые не вызывают каки...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

JHN поддерживается Швейцарским национальным фондом (SNSF 310030_146290).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)Difco244620
Rotary ShakeReiss Laborbedarf e. K.Модель 3020 GFL
Зазор 2 мм куветы Peqlab Biotechnologie GmbH71-2020
ГлицеринSigma-AldrichG5516-100ML
Ген Пульсер Система Xcell BioRad Laboratories GmbH1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Difco244510
AmpicillinSigma-AldrichA9393-5G
SOC MediumSigma-AldrichS1797-100ML
Набор для выделения плазмид высокой чистотыRoche11754777001
AgaroseCarl Roth GmbH & Co3810.1
EDTASigma-AldrichE9884-100G
Tris-HClSigma-AldrichT5941
Ледяная уксусная кислотаSigma-Aldrich537020 
Гелевая камера PEQLAB Biotechnology GmbH40-0708
Загрузочный красительThermo FisherR0611
GeneRuler 1 кб Лестница для ДНК Thermo FisherSM0312
Раствор бромида этидииCarl Roth GmbH & Co. KG2218.3
Система фотодокументирования Decon Science Tech GmbHDeVision G 
Секвенирование ДНК MWG-Biotech GmbH
Фосфатный буферный раствор (PBS)Biochrom L182-50
 ZeissHBO 100
Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad Laboratories GmbH1658005
PageRuler Prestained Protein Ladder Fermentas, St. Leon-Rot, Германия
IstanBlue SolutionExpedeon, Кембриджшир, Великобритания
Нитроцеллюлозная мембрана Macherey-Nagel GmbH & Co. KG741280
Электроблоттер Biometra GmbH846-015-600
Сывороточные альбумины крупного рогатого скота (БСА)Sigma-AldrichA6003-25G
Антитела к овальбуминам Abcamab181688
Анти-кролик IgG  HRPSigma-AldrichA0545 
Pierce ECL Plus Western Blotting SubstratePierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc32132
ForeneAbbott2594.00.00
FBSInvitrogen10500-064
Falcon Cell SitherFischer Scientific 08-771-2
Хлорид аммонияSigma-Aldrich254134-5G
Tris BaseSigma-Aldrich10708976001
CD4+ CD62 L+ T изоляционный комплект Милтеньи Биотек130-093-227 
MACS LS Колонны Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MS Колонны Miltenyi Biotec130-042-201
MidiMACS СепараторMiltenyi Biotec130-042-302
MiniMACS СепараторMiltenyi Biotec130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Подающая игла 20GSouthPointe Surgical Supply, IncFN-7903
Раствор формалина, нейтральный буферный, 10%Сигма-ОлдричHT501128
ПарафинСигма-Олдрич1496904
ГематоксилинСигма-ОлдричH9627
Эозин ИСигма-Олдрич230251 
ДитиотреитолСигма-ОлдричD9779 
Коллагеназа типа VIIISigma-AldrichC-2139
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) средаAppliChemA2044, 9050
Азид натрияSigma-Aldrich438456
мышиный BD Fc BlockBD Pharmingen553141
FITC-конъюгированное связывание mAb Vß 5.1, 5.2 BD Pharmingen553189
APC-конъюгированное связывание mAb CD4 GK1.5 eBioscience17-0041-83
FACS Calibur Программное обеспечение BD Biosciences
FCS Express V3 СканирующийDeNovo
Meta ZeissLSM 710 
Рабочая станция ZeissZeissLSM 7
Zeiss ZEM программное обеспечение Zeissv4.2.0.121
Иммунопланшеты Maxisorp NUNC, Roskilde442404
стрептавидин конъюгированная щелочная фосфатазаJackson Immuno Research016-050-084
Щелочной фосфатазный субстрат 4-нитрофенилфосфат динатриевая соль гексагидратSigma-Aldrich71768-5G
mAb R4-6A2BD Biosciences551216
mAb XMG1.2 BD Biosciences554410
TECAN микропланшет-ИФА считывательTecan
EasyWin программное обеспечениеTecan
DNаза I рекомбинантная4536282001
Флуоресцентный микроскоп конфокальный микроскоп

Ссылки

  1. Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
  2. Cario, E., Podolsky, D. K. Intestinal epithelial TOLLerance versus inTOLLerance of commensals. Mol Immunol. 42, 887-893 (2005).
  3. Sartor, R. B., Mazmanian, S. K. Intestinal Microbes in Inflammatory Bowel Diseases. Am J Gastroenterol Suppl. 1, 15-21 (2012).
  4. Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90, 859-904 (2010).
  5. Metges, C. C. Contribution of microbial amino acids to amino acid homeostasis of the host. J Nutr. 130, 1857S-1864S (2000).
  6. Rossi, M., Amaretti, A., Raimondi, S. Folate production by probiotic bacteria. Nutrients. 3, 118-134 (2011).
  7. Ley, R. E., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine. Cell. 124, 837-848 (2006).
  8. Sleator, R. D. The human superorganism - of microbes and men. Med Hypotheses. 74, 214-215 (2010).
  9. Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition by the innate immune system. Int Rev Immunol. 30, 16-34 (2011).
  10. Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition in the innate immune response. Biochem J. 420, 1-16 (2009).
  11. Smith, P. M., Garrett, W. S. The gut microbiota and mucosal T cells. Front Microbiol. 2, 111(2011).
  12. Fava, F., Danese, S. Intestinal microbiota in inflammatory bowel disease: friend of foe? World J Gastroenterol. 17, 557-566 (2011).
  13. Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122, 107-118 (2005).
  14. Muzes, G., Molnar, B., Tulassay, Z., Sipos, F. Changes of the cytokine profile in inflammatory bowel diseases. World J Gastroenterol. 18, 5848-5861 (2012).
  15. Koboziev, I., Karlsson, F., Grisham, M. B. Gut-associated lymphoid tissue, T cell trafficking, and chronic intestinal inflammation. Ann N Y Acad Sci. 1207 Suppl. 1207, Suppl 1. E86-E93 (2010).
  16. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G135-G146 (2009).
  17. Elson, C. O., Sartor, R. B., Tennyson, G. S., Riddell, R. H. Experimental models of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 109, 1344-1367 (1995).
  18. Boismenu, R., Chen, Y. Insights from mouse models of colitis. J Leukoc Biol. 67, 267-278 (2000).
  19. Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. Int Immunol. 5, 1461-1471 (1993).
  20. Rivera-Nieves, J., et al. Emergence of perianal fistulizing disease in the SAMP1/YitFc mouse, a spontaneous model of chronic ileitis. Gastroenterology. 124, 972-982 (2003).
  21. Ostanin, D. V., et al. T cell-induced inflammation of the small and large intestine in immunodeficient mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G109-G119 (2006).
  22. Barnett, M., Fraser, A. Animal Models of Colitis: Lessons Learned, and Their Relevance to the Clinic. Ulcerative Colitis - Treatments, Special Populations and the Future. O'Connor, M. , InTech. (2011).
  23. Reindl, W., Weiss, S., Lehr, H. A., Forster, I. Essential crosstalk between myeloid and lymphoid cells for development of chronic colitis in myeloid-specific signal transducer and activator of transcription 3-deficient mice. Immunology. 120, 19-27 (2007).
  24. Yoshida, M., et al. CD4 T cells monospecific to ovalbumin produced by Escherichia coli can induce colitis upon transfer to BALB/c and SCID mice. Int Immunol. 13, 1561-1570 (2001).
  25. Eun, C. S., et al. Induction of bacterial antigen-specific colitis by a simplified human microbiota consortium in gnotobiotic interleukin-10-/- mice. Infect Immun. 82, 2239-2246 (2014).
  26. Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nat Rev Microbiol. 8, 564-577 (2010).
  27. Chinen, T., Rudensky, A. Y. The effects of commensal microbiota on immune cell subsets and inflammatory responses. Immunol Rev. 245, 45-55 (2012).
  28. Dimmitt, R. A., et al. Role of postnatal acquisition of the intestinal microbiome in the early development of immune function. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 51, 262-273 (2010).
  29. Cebra, J. J., Periwal, S. B., Lee, G., Lee, F., Shroff, K. E. Development and maintenance of the gut-associated lymphoid tissue (GALT): the roles of enteric bacteria and viruses. Dev Immunol. 6, 13-18 (1998).
  30. Ohkusa, T., Nomura, T., Sato, N. The role of bacterial infection in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Intern Med. 43, 534-539 (2004).
  31. van Lierop, P. P., Samsom, J. N., Escher, J. C., Nieuwenhuis, E. E. Role of the innate immune system in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 48, 142-151 (2009).
  32. Kaur, N., Chen, C. C., Luther, J., Kao, J. Y. Intestinal dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut Microbes. 2, 211-216 (2011).
  33. Trobonjaca, Z., et al. MHC-II-independent CD4+ T cells induce colitis in immunodeficient RAG-/- hosts. J Immunol. 166, 3804-3812 (2001).
  34. Brimnes, J., Reimann, J., Nissen, M., Claesson, M. Enteric bacterial antigens activate CD4(+) T cells from scid mice with inflammatory bowel disease. Eur J Immunol. 31, 23-31 (2001).
  35. Cong, Y., et al. CD4+ T cells reactive to enteric bacterial antigens in spontaneously colitic C3H/HeJBir mice: increased T helper cell type 1 response and ability to transfer disease. J Exp Med. 187, 855-864 (1998).
  36. Niess, J. H., et al. CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance. Science. 307, 254-258 (2005).
  37. Rossini, V., et al. CX3CR1(+) cells facilitate the activation of CD4 T cells in the colonic lamina propria during antigen-driven colitis. Mucosal Immunol. 7, 533-548 (2014).
  38. Vallon-Eberhard, A., Landsman, L., Yogev, N., Verrier, B., Jung, S. Transepithelial pathogen uptake into the small intestinal lamina propria. J Immunol. 176, 2465-2469 (2006).
  39. Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. J Exp Med. 203, 2841-2852 (2006).
  40. Farache, J., et al. Luminal Bacteria Recruit CD103(+) Dendritic Cells into the Intestinal Epithelium to Sample Bacterial Antigens for Presentation. Immunity. , (2013).
  41. Farache, J., Zigmond, E., Shakhar, G., Jung, S. Contributions of dendritic cells and macrophages to intestinal homeostasis and immune defense. Immunol Cell Biol. 91, 232-239 (2013).
  42. Schirmbeck, R., et al. Translation from cryptic reading frames of DNA vaccines generates an extended repertoire of immunogenic, MHC class I-restricted epitopes. J Immunol. 174, 4647-4656 (2005).
  43. Balestrino, D., et al. Single-cell techniques using chromosomally tagged fluorescent bacteria to study Listeria monocytogenes infection processes. Appl Environ Microbiol. 76, 3625-3636 (2010).
  44. Ortega-Gonzalez, M., et al. Validation of bovine glycomacropeptide as an intestinal anti-inflammatory nutraceutical in the lymphocyte-transfer model of colitis. Br J Nutr. 111, 1202-1212 (2014).
  45. Capitan-Canadas, F., et al. Fructooligosaccharides exert intestinal anti-inflammatory activity in the CD4+ CD62L+ T cell transfer model of colitis in C57BL/6J mice. Eur J Nutr. , (2015).
  46. Salazar-Gonzalez, R. M., et al. CCR6-mediated dendritic cell activation of pathogen-specific T cells in Peyer's patches. Immunity. 24, 623-632 (2006).
  47. Niess, J. H., Leithauser, F., Adler, G., Reimann, J. Commensal gut flora drives the expansion of proinflammatory CD4 T cells in the colonic lamina propria under normal and inflammatory conditions. J Immunol. 180, 559-568 (2008).
  48. Radulovic, K., et al. CD69 regulates type I IFN-induced tolerogenic signals to mucosal CD4 T cells that attenuate their colitogenic potential. J Immunol. 188, 2001-2013 (2012).
  49. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14, 667-685 (2014).
  50. Manta, C., et al. CX(3)CR1(+) macrophages support IL-22 production by innate lymphoid cells during infection with Citrobacter rodentium. Mucosal Immunol. 6 (3), 177-188 (2013).
  51. Feng, T., Wang, L., Schoeb, T. R., Elson, C. O., Cong, Y. Microbiota innate stimulation is a prerequisite for T cell spontaneous proliferation and induction of experimental colitis. J Exp Med. 207, 1321-1332 (2010).
  52. Mazzini, E., Massimiliano, L., Penna, G., Rescigno, M. Oral tolerance can be established via gap junction transfer of fed antigens from CX3CR1(+) macrophages to CD103(+) dendritic cells. Immunity. 40, 248-261 (2014).
  53. Fitzpatrick, L. R. Novel Pharmacological Approaches for Inflammatory Bowel Disease: Targeting Key Intracellular Pathways and the IL-23/IL-17 Axis. Int J Inflam. 2012, 389404(2012).
  54. Danese, S. New therapies for inflammatory bowel disease: from the bench to the bedside. Gut. 61, 918-932 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

OT II CD4E coliCFP OVA
Разработка Антиген-ведомой колита моделью для изучения Презентация антигенами путем антигенпрезентирующих клеток, Т-клеткам
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.