Method Article

Разработка Антиген-ведомой колита моделью для изучения Презентация антигенами путем антигенпрезентирующих клеток, Т-клеткам

DOI:

10.3791/54421

⸱

September 18th, 2016

 ,  ,  , 
1APC Microbiome Institute, University College Cork, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital Basel, 3Institute of Microbiology and Biotechnology, University of Ulm

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой модели колита, вызванного антигеном, CD4+ Т-клетки OT-II, экспрессирующие красный флуоресцентный белок, были адоптивно перенесены мышам RAG-/-, которые экспрессируют зеленый флуоресцентный белок в мононуклеарных фагоцитах (МП). Хозяев подвергали воздействию Escherichia coli (E.coli), экспрессирующей белок овальбумин (OVA), слитый с голубым флуоресцентным белком (CFP).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) - это хроническое воспаление, которое поражает желудочно-кишечный тракт (ЖКТ). Одним из лучших способов изучения иммунологических механизмов, задействованных во время заболевания, является модель переноса Т-клеток колита. В этой модели иммунодефицитные мыши (реципиенты RAG-/-) восстанавливаются наивными CD4+ Т-клетками от здоровых хозяев дикого типа.

Эта модель позволяет исследовать самые ранние иммунологические события, приводящие к заболеванию и хроническому воспалению, когда воспаление кишечника сохраняется, но не зависит от определенного антигена. Для изучения потенциальной роли антигенпрезентирующих клеток (АПК) в процессе заболевания полезно иметь антиген-обусловленную модель заболевания, в которой определенный комменсальный антиген приводит к колиту. В связи с этим была разработана модель антиген-обусловленного колита. В этой модели CD4+ Т-клетки OT-II, которые могут распознавать только специфические эпитопы в белке OVA, переносятся в RAG-/- хозяев, пораженных CFP-OVA-экспрессирующей E. coli. Эта модель позволяет исследовать взаимодействия между APC и Т-клетками в собственной пластинке.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кишечника является крупнейшим поверхности тела, которая подвергается воздействию внешней среды. Обширные массивы резидентных микробов колонизировать кишечник человека с образованием кишечной микробиоты (или микрофлору). Это, по оценкам, состоит до 100 триллионов клеток микроорганизмов и является одним из самых густонаселенных бактериальных сред обитания известных в биологии 1-3. В GIT бактерии заселяют кишечную нишу , где они выживают и размножаются 4. В свою очередь, микрофлора жертвует хозяина с дополнительными функциональными особенностями не закодированы на своем геноме 1. Например, микрофлора стимулирует пролиферацию эпителиальны....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мыши были выведены и держали под конкретного патогена (SPF) условиях в виварии из университета Ульма (Ульм, Германия). Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами местного использования животных и комитетом по уходу и права национального благосостояния животных.

1. Строительство PCFP-OVA плазмиды

  1. Amplify полный ген размер OVA с использованием праймеров Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') и Ova_ClaI_rev (3'- GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') 37 с использованием плазмиды пКи-OVA (устойчивых к ампициллину) 42 в качестве м....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для того, чтобы установить антиген управляемой колиты моделирующие E. штамм был построен , который содержит плазмиду , в которой ген для CFP слита с последовательностью , кодирующей белок куриного овальбумина и слитой конструкции экспрессируется под контролем сильного конститутивного промотора P гипер (фиг.1А). Флуоресцентная микроскопия показывает , что рекомбинантный E. PCFP палочка-OVA, но не родительская Е.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как и с любой другой моделью, антиген управляемой модели колита описано выше, может представлять несколько вопросов, которые следователь, выполняющий технику должны быть в курсе. При инъекции OT-II / красный + CD4 + T CD62L + клетки в хостах, исследователь должен быть очень нежным и осторожным , чтобы вставить иглу в брюшную полость. Несоблюдение этого правила может привести к разрыву кишечника мыши, которая может привести к смерти или подкожного введения клеток, которые не вызывают каки.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JHN поддерживается Швейцарским национальным фондом (SNSF 310030_146290).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)Difco244620
Rotary ShakeReiss Laborbedarf e. K.Модель 3020 GFL
Зазор 2 мм куветы Peqlab Biotechnologie GmbH71-2020
ГлицеринSigma-AldrichG5516-100ML
Ген Пульсер Система Xcell BioRad Laboratories GmbH1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Difco244510
AmpicillinSigma-AldrichA9393-5G
SOC MediumSigma-AldrichS1797-100ML
Набор для выделения плазмид высокой чистотыRoche11754777001
AgaroseCarl Roth GmbH & Co3810.1
EDTASigma-AldrichE9884-100G
Tris-HClSigma-AldrichT5941
Ледяная уксусная кислотаSigma-Aldrich537020 
Гелевая камера PEQLAB Biotechnology GmbH40-0708
Загрузочный красительThermo FisherR0611
GeneRuler 1 кб Лестница для ДНК Thermo FisherSM0312
Раствор бромида этидииCarl Roth GmbH & Co. KG2218.3
Система фотодокументирования Decon Science Tech GmbHDeVision G 
Секвенирование ДНК MWG-Biotech GmbH
Фосфатный буферный раствор (PBS)Biochrom L182-50
 ZeissHBO 100
Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad Laboratories GmbH1658005
PageRuler Prestained Protein Ladder Fermentas, St. Leon-Rot, Германия
IstanBlue SolutionExpedeon, Кембриджшир, Великобритания
Нитроцеллюлозная мембрана Macherey-Nagel GmbH & Co. KG741280
Электроблоттер Biometra GmbH846-015-600
Сывороточные альбумины крупного рогатого скота (БСА)Sigma-AldrichA6003-25G
Антитела к овальбуминам Abcamab181688
Анти-кролик IgG  HRPSigma-AldrichA0545 
Pierce ECL Plus Western Blotting SubstratePierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc32132
ForeneAbbott2594.00.00
FBSInvitrogen10500-064
Falcon Cell SitherFischer Scientific 08-771-2
Хлорид аммонияSigma-Aldrich254134-5G
Tris BaseSigma-Aldrich10708976001
CD4+ CD62 L+ T изоляционный комплект Милтеньи Биотек130-093-227 
MACS LS Колонны Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MS Колонны Miltenyi Biotec130-042-201
MidiMACS СепараторMiltenyi Biotec130-042-302
MiniMACS СепараторMiltenyi Biotec130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Подающая игла 20GSouthPointe Surgical Supply, IncFN-7903
Раствор формалина, нейтральный буферный, 10%Сигма-ОлдричHT501128
ПарафинСигма-Олдрич1496904
ГематоксилинСигма-ОлдричH9627
Эозин ИСигма-Олдрич230251 
ДитиотреитолСигма-ОлдричD9779 
Коллагеназа типа VIIISigma-AldrichC-2139
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) средаAppliChemA2044, 9050
Азид натрияSigma-Aldrich438456
мышиный BD Fc BlockBD Pharmingen553141
FITC-конъюгированное связывание mAb Vß 5.1, 5.2 BD Pharmingen553189
APC-конъюгированное связывание mAb CD4 GK1.5 eBioscience17-0041-83
FACS Calibur Программное обеспечение BD Biosciences
FCS Express V3 СканирующийDeNovo
Meta ZeissLSM 710 
Рабочая станция ZeissZeissLSM 7
Zeiss ZEM программное обеспечение Zeissv4.2.0.121
Иммунопланшеты Maxisorp NUNC, Roskilde442404
стрептавидин конъюгированная щелочная фосфатазаJackson Immuno Research016-050-084
Щелочной фосфатазный субстрат 4-нитрофенилфосфат динатриевая соль гексагидратSigma-Aldrich71768-5G
mAb R4-6A2BD Biosciences551216
mAb XMG1.2 BD Biosciences554410
TECAN микропланшет-ИФА считывательTecan
EasyWin программное обеспечениеTecan
DNаза I рекомбинантная4536282001
Флуоресцентный микроскоп конфокальный микроскоп

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
  2. Cario, E., Podolsky, D. K. Intestinal epithelial TOLLerance versus inTOLLerance of commensals. Mol Immunol. 42, 887-893 (200....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Antigen Driven Colitis ModelT Cell Transfer ModelColonic Lamina PropriaAntigen Presenting CellsOT II CD4 T CellsCFP OVA Expressing E coliFlow Cytometry AnalysisConfocal Microscopy ImagingCell Isolation ProtocolTissue Digestion Method

Related Articles