Method Article

Визуальный колориметрический Обнаружение Multi-нуклеотидных полиморфизмов на Manipulation платформы Пневматический дроплета

DOI:

10.3791/54424

⸱

September 27th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, National Taiwan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа представляет собой простой и визуальный метод обнаружения нескольких нуклеотидных полиморфизмов на пневматической манипуляции капелька платформой. С помощью предложенного метода, всего эксперимента, в том числе манипулирования капельным и обнаружение нескольких нуклеотидных полиморфизмов, может быть выполнено около 23 ° С, без помощи передовых инструментов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Простой и визуальный метод обнаружения мульти-нуклеотидный полиморфизм (MNP) проводили на пневматической манипулирования капелька платформы на открытой поверхности. Такой подход к обнаружению колориметрического ДНК на основе роста гибридизация опосредованного наночастиц золота зондов (AuNP зондам). Размер роста и конфигурация AuNP преобладают количества образцов ДНК гибридизации с зондами. На основании конкретных формы и размера молекул зависят оптические свойства наночастиц, число несовпадений в фрагменте ДНК-образец для зондов способен дискриминировать. Испытания проводились с помощью капель, содержащих реагенты и образцы ДНК, соответственно, и были перевезены и замешанный на пневматической платформе с регулируемым пневматическим отсосом гибкой ПДМС основе супергидрофобной мембраны. Капельки могут быть доставлены одновременно и точно на открытой поверхности, на предлагаемой пневматической платформы, которая обладает высокой биосовместимостью без побочных эфECT образцов ДНК внутри капель. Объединение двух предложенных методов, мульти-нуклеотидного полиморфизма могут быть обнаружены при виде на пневматическом манипулирования капелька платформы; никакого дополнительного инструмента не требуется. Процедура установки от капель на платформе до конечного результата занимает менее 5 минут, гораздо меньше, чем с существующими методами. Более того, этот комбинированный подход обнаружения МНП требует объема образца только 10 мкл в каждой операции, что значительно меньше, чем у макро-системы.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Однонуклеотидных полиморфизма (SNP), который представляет собой единый разница пар оснований в ДНК-последовательности, является одним из наиболее распространенных генетических изменений. Текущие исследования сообщают , что ОНП связаны с риском заболевания, эффективности препарата и побочные эффекты лиц, воздействуя функции гена. 1,2 Недавние исследования также показали , что двух- или многоточечные мутации (мульти-нуклеотид полиморфизм) вызывают специфические заболевания и индивидуальные различия в эффектах заболевания. 3,4 обнаружение нуклеотидных полиморфизма поэтому крайне важно в предварительный скрининг болезни. Простые и эффективные методы быстрого обнаружения олигонуклеотидами последовательностей специфических были высоко развиты в последние два десятилетия. 1,5 Современные подходы к выявлению мутации ДНК , как правило , включают процедуры , в том числе зонда иммобилизации, флуоресцентной маркировки, гель - электрофореза и т.д., 6,7 но эти методы, как правило требуют длительного аналитического процесса, expenSIVE оборудование, хорошо обученные техники, и значительное потребление образцов и реагентов.

Наночастица с большим отношением площади поверхности к объему и уникальных физико-химических свойств является идеальным материалом в качестве высокочувствительного и дешевой платформы обнаружения для конкретных биомаркеров. Наночастицы золота (AuNP) широко используются для обнаружения ДНК из - за их большой способности быть изменены с помощью олигонуклеотидных зондов. 8-10 методики обнаружения SNP были также разработаны с использованием AuNP. 11-13 В этой работе мы приняли новый колориметрический подход для обнаружения мульти-нуклеотидного полиморфизма (МНП) через ДНК роста гибридизации опосредованного AuNP зондов. 14 Этот простой и быстрый метод зондирования основан на теории , что различные длины одноцепочечной ДНК (оцДНК) или двухцепочечной ДНК (дцДНК) , конъюгированного с AuNP влияют на размер роста и форму AuNP (см рисунок 1). 15 Этот метод обнаружения ДНКимеет небольшой расход реагентов, небольшой продолжительности анализа (несколько минут), а также простую процедуру без теплового контроля, которое перспективно применяется для клинической диагностики и внутреннего медицинского обследования.

Несколько микрофлюидальные систем обнаружения ДНК - последовательности были разработаны; 16 эти микрожидкостных систем, эволюционировали от традиционных экспериментальных протоколов, требуется меньшее количество единиц крупногабаритного оборудования и упрощена экспериментальные протоколы , с тем, чтобы улучшить чувствительность, предел обнаружения и специфичности ДНК биосенсора. Методы обнаружения ДНК в Микрожидкостных системах все еще требуют, однако, инструменты последующего процесса , такого как ПЦР (полимеразной цепной реакции) машины для усиления сигнала и флюоресцентный детектор для одного считывания для идентификации гетерогенную SNP. 17,18 Разработка простого платформа без последующей обработки непосредственно зачитывает результаты нескольких нуклеотидных полиморфизмаявляется весьма желательным. По сравнению с хорошо использовать, обычные, закрытые микрожидкостных системы, открытой поверхностью микрофлюидальные устройства многообещающе имеют ряд преимуществ, таких как четкий оптический путь, легкий способ получить доступ к примеру, прямой экологической доступности и не легко образуется кавитация или на границе раздела фаз препятствий в канал. 19 Наша предыдущая работа представила простой пневматическую платформу для открытой поверхности манипулирования капельным (смотри рисунок 2). 20 на этой платформе, капли могут быть одновременно транспортировать и манипулировать без помех со стороны движущей энергии с помощью всасывающей силы, которая имеет большой потенциал в биологических и химических применений. Эта пневматическая платформа была, таким образом, используется для выполнения манипуляций с образцами ДНК для обнаружения МНП в сочетании с колориметрическим подход с использованием концепции ДНК роста гибридизация опосредованного AuNP зондов.

Протокол, представленные в настоящем документе описываетсяПростой визуальный обнаружение нескольких нуклеотидных полиморфизмов на пневматическом манипулирования капелька платформы на открытой поверхности. Эта работа подтверждает, что мульти-нуклеотидного полиморфизма можно обнаружить невооруженным глазом; предлагаемая пневматическая платформа пригодна для биологических и химических применений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Способ для обнаружения MNP

Примечание: В данном разделе описывается процедура выявления MNP на основе роста гибридизация опосредованной наночастиц золота.

  1. Готовят ДНК-зонд (5'-тиол-GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 ') растворе при концентрации 100 мкМ.
  2. Подготовьте ДНК - зонд-модифицированный AuNP (AuNP зонд) частиц. 21
    Примечание: Объем, используемый здесь, зависит от требований зонда ДНК-модифицированного AuNP (AuNP зонда) частиц. Это, следовательно, зависит от числа экспериментов, которые будут проводиться. Как правило, мы подготовить избыток частиц AuNP зонда в качестве запасных частей. Объем, используемый в этих шагов является регулируемым и гибким.
    1. Добавить ДНК-зонд (100 мкМ, приготовленным на стадии 1.1) к раствору наночастиц золота (13 нм, 17 нм), при концентрации 1 ОД / мл.
    2. Доведите конечные концентрации додецилсульфата натрия (NAC 12 Н 25 SO 4, SDS) и фосфатный буфер (PBS) , до 0,01% и 0,01 М, respectivelу.
    3. Через 20 мин, довести концентрацию хлорида натрия (NaCl) до 0,05 М раствором NaCl (2 М) и PBS (0,01 М), поддержива ДСН при 0,01% и инкубируют в течение 20 мин.
    4. Увеличение концентрации NaCl с шагом 0,1 М до конечной концентрации 1 М в течение 20-минутными интервалами.
    5. Выдержите в течение ночи при встряхивании на вихревом смесителе при температуре 23 ° C. Встряхивая скорость не влияет на эксперимент до тех пор, как образцы ДНК и AuNP зонды становятся гибридизированных.
    6. Центрифуга наночастицы золота при 7000 мкг в течение 30 сек и удалить супернатант.
  3. Добавить зондовые частицы AuNP в деионизированную воду (ДИ воды) при концентрации 25 нМ (раствор зонда AuNP).
  4. Подготовка образцов ДНК - мишени (полностью комплементарными: 5'-CTTGCCTACGCCACCAGCTC-3 '; три пар оснований несовпадающими: 5'-CTTGCCTAC ТТТ ACCAGCTC-3', шесть пар оснований несовпадающими: 5'-CTTGCCT TTTTTT CCAGCTC-3 ') , в концентрациях ,0,06, 0,11, 0,17, 0,20, 0,30, 0,50 мкМ, соответственно.
  5. Добавить раствор зонда AuNP (6 мкл, 25 нМ) в образцах ДНК (350 мкл) с NaCl (14 мкМ).
  6. Взболтать смесь образцов ДНК и AuNP зондов с вихревом смесителе при температуре 23 ° С в течение 5 мин для ДНК-гибридизации.
  7. Для роста AuNP, добавляют NH 2 OH (6 мкл, 400 мМ) и HAuCl 4 (6 мкл, 25,4 мМ) к раствору (смесь образцов ДНК и AuNP зондов). Рост AuNP занимает примерно 30 секунд для завершения. Постепенное изменение окраски поддерживает более чем на 1 час.
    ВНИМАНИЕ: При попадании на кожу с HAuCl 4 может привести к серьезным токсическим действием. Пожалуйста, обратитесь к Паспорта безопасности (MSDS) перед использованием. Пожалуйста , носите перчатки и использовать вытяжной шкаф при использовании HAuCl 4.

2. Изготовление манипуляция платформы Пневматический дроплета

Примечание: PDMS на основе манипулирования капелька платформа состоит из двух компонентов: PDMS мембрана (100 мкм) с супер-гидрофобной поверхностью и слоем с воздушным каналом (5 мм). Без процесса на основе МЭМС, были использованы общие процессы механической обработке, чтобы изготовить это устройство, которое включает в себя компьютерно-числовым программным управлением (ЧПУ) микрообработки для изготовления литейной формы, литье PDMS и репликации для быстрого прототипирования Микрожидкостных компонентов и лазерной микрообработки для изготовления супер-гидрофобная поверхность (смотри рисунок 3).

  1. Используйте станок с ЧПУ , оснащенный сверлом (0,5 мм) для производства основных форм ПММА основе (смотри рисунок 3) с микроструктурой. Используйте скорость подачи бурового долота 7 мм / с и скорость вращения 26000 оборотов в минуту. Используйте нагнетатель воздуха и DI воды для удаления ПММА лома и очистить поверхность основных форм.
  2. Приготовить смесь из основания PDMS и отвердителем в соотношении 10: 1. Дегазировать смесь внутри эксикаторе в течение 30 мин, или пока все пузырьки воздуха не будут удалены.
  3. Налить PDMS в текущем гое мастер формы и выпекать PDMS в течение 3 ч при 60 ° С в печи для получения обратных микроструктур воздушных камер (PDMS мембраны) и воздушные каналы (PDMS слой).
  4. Удалите слой PDMS из мастер-формы (вручную). Перфорационных отверстий на слое PDMS для воздушно-всасывающих отверстиях.
  5. Поместите мембрану PDMS, PDMS на слой и стеклянную подложку в камеру системы обработки кислородом плазмы. После обработки кислородом плазмы, скрепляет мембрану PDMS, в PDMS слой и стеклянной подложки вместе на плитке (90 ° C) в течение 10 мин.
  6. Поместите композитный чип в лазерной резки (PDMS сторона мембраны вверх). Импорт .dwg файл для определения сверхгидрофобные область (15 мм × 12 мм). Смотрите рисунок 3. Непосредственно выгравировать мембрану PDMS с -лазера машины CO 2 для создания сверхгидрофобные область на PDMS мембране (мощность 12 Вт, скорость сканирования 106,68 мм / сек).
  7. Очистите поверхность сверхгидрофобные с дистиллированной водой для мытьякоротают углеродистые остатки на поверхности.
  8. Подключите входное отверстие для всасывания воздуха и вакуумный насос через электромагнитный клапан (смотри рисунок 4). Подключите электромагнитный клапан к компьютеру и управления с цифровым модулем USB ввода / вывода.

3. Операция для обнаружения MNP на пневматическом платформы

Примечание: В этом разделе описываются операции по выявлению колориметрическим и быстро МНП на пневматическом манипулирования капелька платформы (рисунок 5). Все шаги имеют место при 23 ° C (температура окружающей среды) и относительной влажности 85%.

  1. Поместите образец капельку ДНК-мишень (10 мкл, 0,5 мкМ) на супергидрофобной области пневматического манипулирования капелька платформы.
  2. Поместите зонд капельку AuNP (10 мкл, 25 нМ) на супергидрофобной области пневматического манипулирования капелька платформы.
  3. Контроль всасывания воздуха, чтобы вызвать отклонение мембраны PDMS с электромагнитным клапаном и сиПрограмма mple (например, Labview). Обеспечить отсос воздуха в каждой воздушной камере вдоль пути миграции капель (содержащих ДНК-мишени и AuNP зондов соответственно) на мембране PDMS таким образом, что капли сталкиваются друг с другом и сливаться. Используйте рабочее давление вакуумного насоса -80 кПа (избыточное давление).
    1. В качестве альтернативы, управление всасывания воздуха вручную до тех пор, как капелька полностью перемешивают. Вручную, подключить или отключить вакуумный насос и заходами воздушной камеры с трубами на ранних стадиях тестирования.
  4. Контроль всасывания воздуха катать коалесцированного капельку вперед и назад для повышения эффективности перемешивания в течение 3 мин с помощью системы управления, электромагнитного клапана. ДНК-мишень и AuNP зонды становятся хорошо перемешана и гибридизовали в течение 3 мин. Используйте движущую частоту и рабочее давление 5 Гц и -80 кПа (манометрическое давление), соответственно.
  5. Поместите капельку , содержащую NH 2 OH (2 мкл, 400 мМ) и HAuCl4 (2 мкл, 25,4 мМ) на супергидрофобной области пневматического манипулирования капелька платформы.
  6. Контроль всасывания воздуха (-80 кПа, манометрическое давление), чтобы позволить капли сталкиваются друг с другом и сливаются. Затем контроль всасывания воздуха (5 Гц и -80 кПа избыточного давления), чтобы позволить коалесцированного капелька рулон вперед и назад для повышения эффективности перемешивания в течение 1 мин.
  7. Измерьте и запишите цвет слившихся капли с невооруженным глазом.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой работе, три образца ДНК были протестированы с использованием простой и новый способ обнаружения посредством роста гибридизация опосредованную ДНК зондов AuNP. Последовательности ДНК зонда и образцов ДНК трех видов, в частности, кДНК (полностью комплементарной ДНК-зонд), TMDNA (три пар оснований несовпадающими ДНК) и SixMDNA (шесть пар оснований несовпадающими ДНК), перечислены в Протоколе шаге 1. невязок на зонд образцов ДНК тестируемых здесь как в средних сегментах образцов ДНК. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе простой колориметрический метод обнаружения МНП может быть реализован при концентрациях в пределах от 0.11-0.50 мкМ в микроцентрифужных пробирках. Кроме того, предлагаемый метод обнаружения МНП проводится на платформе манипуляции пневматической капельным, которая имеет высокий потенциал для скрининга ДНК и других биомедицинских применений. На практике диапазон детектирования концентрации образца ДНК, зависит от эффективности смешивания операционных платформ. Для того, чтобы гарантировать, что коалесциро...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Министерство науки и технологий Тайваня оказало финансовую поддержку этому исследованию по контрактам MOST-103-2221-E-002 -097 -MY3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PDMSDow CorningSYLGARD 184
настольные граверыRoland DGEGX-400
станок для лазерной резкиUniversal Laser Systems, Inc.VLS 3.50
Система кислородной плазменной обработкиFemto Science Inc. КореяЭлектромагнитный клапан
домашнего производства
DA-30D
13-нм раствор AuNPTAN Bead Inc., ТайваньNG-13
ДНК (с 5'-меченым тиолом)MDBio, Inc., Тайваньский
фосфатный буферный раствор (PBS)UniRegion  Биотехнологии,. ТайваньPBS001-1L
додецилсульфат натрия (SDS)J. T. baker4095-04
Раствор гидроксиламина (NH2OH)Sigma-Aldrich467804
Chloroauric acid (HAuCl4)Sigma-AldrichG4022
chloride (NaCl)
вихревой смесительDigisystem Laboratory Instruments Inc.Центрифуга VM-2000
HermleLabortechnik GmbH.З 216 МК
CUTE-MPR вакуумный насос ULVAC KIKO, Inc. sodium

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chorley, B. N., et al. Discovery and verification of functional single nucleotide polymorphisms in regulatory genomic regions: current and developing technologies. Mutat. Res. Rev. Mutat. 659 (1), 147-157 (2008).
  2. Hinds, D. A., et al. Whole-genome patterns of common DNA variation in three human populations. Science. 307 (5712), 1072-1079 (2005).
  3. Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing. Nucleic Acids Res. , 408(2010).
  4. Whelan, S., Goldman, N. Estimating the frequency of events that cause multiple-nucleotide changes. Genetics. 167 (4), 2027-2043 (2004).
  5. Saiki, R. K., Walsh, P. S., Levenson, C. H., Erlich, H. A. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (16), 6230-6234 (1989).
  6. Kim, S., Misra, A. SNP genotyping: technologies and biomedical applications. Annu. Rev. Biomed. Eng. 9, 289-320 (2007).
  7. Kwok, P. Y., Chen, X. Detection of single nucleotide polymorphisms. Curr. Issues Mol. Biol. 5, 43-60 (2003).
  8. Elghanian, R., Storhoff, J. J., Mucic, R. C., Letsinger, R. L., Mirkin, C. A. Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles. Science. 277 (5329), 1078-1081 (1997).
  9. Lee, J. S., Han, M. S., Mirkin, C. A. Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-Functionalized Gold Nanoparticles. Angew. Chem. 119 (22), 4171-4174 (2007).
  10. Storhoff, J. J., et al. Gold nanoparticle-based detection of genomic DNA targets on microarrays using a novel optical detection system. Biosens. Bioelectron. 19 (8), 875-883 (2004).
  11. Bao, Y. P., et al. SNP identification in unamplified human genomic DNA with gold nanoparticle probes. Nucleic Acids Res. 33 (2), 15-15 (2005).
  12. Chen, Y. T., Hsu, C. L., Hou, S. Y. Detection of single-nucleotide polymorphisms using gold nanoparticles and single-strand-specific nucleases. Anal. Biochem. 375 (2), 299-305 (2008).
  13. Li, H., Rothberg, L. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (39), 14036-14039 (2004).
  14. Fang, W. F., Chen, W. J., Yang, J. T. Colorimetric determination of DNA concentration and mismatches using hybridization-mediated growth of gold nanoparticle probes. Sensor. Actuat. B Chem. 192, 77-82 (2014).
  15. Wang, Z., Zhang, J., Ekman, J. M., Kenis, P. J., Lu, Y. DNA-mediated control of metal nanoparticle shape: one-pot synthesis and cellular uptake of highly stable and functional gold nanoflowers. Nano Lett. 10 (5), 1886-1891 (2010).
  16. Chen, L., Manz, A., Day, P. J. Total nucleic acid analysis integrated on microfluidic devices. Lab Chip. 7 (11), 1413-1423 (2007).
  17. Lien, K. Y., Liu, C. J., Lin, Y. C., Kuo, P. L., Lee, G. B. Extraction of genomic DNA and detection of single nucleotide polymorphism genotyping utilizing an integrated magnetic bead-based microfluidic platform. Microfluid. Nanofluid. 6 (4), 539-555 (2009).
  18. Ng, J. K. K., Feng, H. H., Liu, W. T. Rapid discrimination of single-nucleotide mismatches using a microfluidic device with monolayered beads. Anal. Chim. Acta. 582 (2), 295-303 (2007).
  19. Xing, S., Harake, R. S., Pan, T. Droplet-driven transports on superhydrophobic-patterned surface microfluidics. Lab Chip. 11 (21), 3642-3648 (2011).
  20. Huang, C. J., Fang, W. F., Ke, M. S., Chou, H. Y. E., Yang, J. T. A biocompatible open-surface droplet manipulation platform for detection of multi-nucleotide polymorphism. Lab Chip. 14 (12), 2057-2062 (2014).
  21. Mirkin, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C., Storhoff, J. J. A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials. Nature. 382 (6592), 607-609 (1996).
  22. Ichimura, K., Oh, S. K., Nakagawa, M. Light-driven motion of liquids on a photo-responsive surface. Science. 288 (5471), 1624-1626 (2000).
  23. Jones, T. B., Gunji, M., Washizu, M., Feldman, M. J. Dielectrophoretic liquid actuation and nanodroplet formation. J. Appl. Phys. 89 (2), 1441-1448 (2001).
  24. Lee, J., Kim, C. J. C. Surface-tension-driven microactuation based on continuous electrowetting. J. Microelectromech. S. 9 (2), 171-180 (2000).
  25. Daniel, S., Chaudhury, M. K., De Gennes, P. G. Vibration-actuated drop motion on surfaces for batch microfluidic processes. Langmuir. 21 (9), 4240-4248 (2005).
  26. Darhuber, A. A., Valentino, J. P., Davis, J. M., Troian, S. M., Wagner, S. Microfluidic actuation by modulation of surface stresses. Appl. Phys. Lett. 82 (4), 657-659 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multi nucleotide Polymorphism DetectionPneumatic Droplet ManipulationGold Nanoparticle ProbesColorimetric DNA DetectionDNA Hybridization GrowthPDMS based PlatformOpen Surface DropletsNaked Eye DetectionMicroliter Sample VolumeGenetic Mutation Screening

Related Articles