Методическая статья

Конструкция и использование низкой стоимости, Автоматизированная Morbidostat для адаптивной эволюции бактерий в Антибиотик Выбор лекарственных средств

9.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54426

⸱

27 сентября 2016 г.

 ,  ,  , 
1Electrical Engineering, National Tsing Hua University

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем недорогой, конфигурируемый морбидостат, который позволяет характеризовать устойчивость к антибиотикам путем динамической регулировки концентрации препарата. Устройство может быть интегрировано с мультиплексированной микрофлюидной платформой. Этот подход может быть расширен для лабораторных исследований лекарственной устойчивости к антибиотикам.

Аннотация

Мы описываем низкой стоимости, конфигурируемый morbidostat для характеристики эволюционный путь устойчивости к антибиотикам. Morbidostat представляет собой бактериальную культуру устройства, который непрерывно контролирует рост бактерий и динамически регулирует концентрацию лекарственного средства, чтобы постоянно вызов бактерии, как они эволюционируют приобретать устойчивость к лекарству. Устройство имеет рабочий объем ~ 10 мл и полностью автоматизирована и оснащена измерения оптической плотности и микро-насосы для средних и доставки лекарственных средств. Для проверки платформы, мы измерили ступенчатое приобретение устойчивости к триметоприму в кишечной палочки MG 1655, и интегрировать устройство с мультиплексной микрожидком платформой для изучения морфологии клеток и чувствительности к антибиотикам. Такой подход может быть до-масштабируется для лабораторных исследований лекарственной устойчивости к антибиотикам, и продолжимо к адаптивной эволюции для улучшения деформаций в метаболической инженерии и других экспериментов бактериальной культуры.

Введение

С момента введения первого антибиотика пенициллина наркотиков, бактериальная резистентность к антибиотикам превратилась в глобальную проблему здравоохранения 1. Хотя приобретение устойчивости к антибиотикам могут быть ретроспективно изучены в естественных условиях, условия этих экспериментов часто не контролируются на протяжении всей эволюции 2. В качестве альтернативы, эволюция адаптивной лаборатория может выявить молекулярную эволюцию видов микроорганизмов под экологическим стрессам или давлением отбора из препарата антибиотика 3. В последнее время многие хорошо контролируемых эволюционные эксперименты к антибиотикам лекарственной устойчивости прояснили появление антибактериальной резистентности к лекарственным средствам. Например, группа Остин продемонстрировал быстрое появление в правильной инженерии микрожидком секционный среды 4. Недавно разработанный morbidostat вызывает систематические мутации под давлением 5,6 выбора лекарственного средства. Morbidostat, микробный Селецции устройство , которое непрерывно регулирует концентрацию антибиотика поддерживать почти постоянное население, является важным шагом вперед от теста флуктуации , используемого в микробиологии 7,8. В тесте флуктуационном, препаратом антибиотиком вводят при высокой концентрации, и выжившие мутанты подвергают скринингу и подсчитывали. Вместо этого, микробы в morbidostat постоянно ставится под сомнение и приобретают множественные мутации.

Morbidostat работает аналогично хемостате, устройство культуры , изобретенной Новика и Szliard в 1950 году , который поддерживает постоянное население путем непрерывной подачи питательных веществ , в то время как разбавление микробной популяции 9. С момента своего появления, хемостатическую было переработано и улучшено. В настоящее время микрофлюидальные Хемостаты достигли nanoliter и одноклеточные потенциала. Однако эти устройства не подходят для адаптивных экспериментов эволюции, которые требуют большой популяции клеток с большим количеством мутаций событий 10,11. В последнее время, мини-Хемостаты с рабочими объемами ~ 10 мл также были разработаны , чтобы заполнить разрыв между литровых биореакторы и микрожидком хемостатной 12,13.

Здесь мы представляем дизайн и использование недорогой, автоматизированный morbidostat для исследовании антибактериальной резистентности к лекарственным средствам. Предлагаемый модуль может быть использован в шейкере инкубаторе в микробиологической лаборатории с минимальным требованием аппаратных средств. Встроенное программное обеспечение с открытым исходным кодом также легко адаптированы к конкретным областям применения адаптивной эволюции, такие как метаболической инженерии 3. И, наконец, morbidostat интегрирован в мультиплексированный микрожидком платформу для тестирования чувствительности к антибиотикам 14.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Монтаж и Предварительное тестирование из устройства Morbidostat

  1. Сборка Morbidostat
    1. Пуансона 3 отверстия, расположенные на крышке флакона культуры с иглой шприца 18 G. Отрежьте три куска полиэтиленовой трубы ~ 7 см в длину. Вставьте эти три куска полиэтиленовой трубы на крышке.
    2. Используйте ленту, чтобы обернуть край крышки, чтобы служить в качестве гипсе полидиметилсилоксана (ПДМС) смеси. Смешайте 5 г компонента и 0,5 г компонента B из PDMS в пластиковом контейнере емкостью 150 мл при перемешивании вручную с помощью зубочистки. Загрузите смесь в шприц объемом 10 мл.
      1. Вылейте смесь PDMS на крышке с шприца. Запекать всю крышку, чтобы вылечить PDMS в течение 8 часов в печи при 70 ° C.
    3. Припой LED анод с 24 калибра проволоки и LED катода с углеродным резистор с паяльником. Припой 680 Ω углеродный резистор с 24 G провода. Изолировать соединение проволоки с помощью изоленты.
    4. Такlder коллектору фотодетектора с 24 г проволоки и эмиттером фотодетектора с 100 кОм углеродного резистора. Изолировать соединение проволоки с помощью изоленты.
    5. Поместите светоизлучающий диод в держателе флакона культуры. Следуя схеме на дополнительном рисунке 2, подключите светоизлучающий диод и включите его с источником питания 5 В. Убедитесь , что светодиод работает с помощью цифровой камеры , которая может обнаружить ИК (например, камеры мобильного телефона).
    6. Поместите фотодетектор в держатель флакона культуры. Следуя схеме на дополнительном рисунке 2, соедините фотодетектор и власть его с источником питания 5 В. Подключите провод к обеим сторонам фотоприемных резисторов для измерения напряжения на электронной плате управления.
    7. Клей магнит на валу вентилятора, который служит в качестве магнитного блока мешалке. Обратите внимание, что в alignmлор вала вентилятора к ампуле культуры, а также расстояние между ампуле культурой и магнит имеет очень важное значение для правильной работы магнитного блока перемешивания.
    8. Соедините каждый кусок полиэтиленовой трубы флакона культуры в соответствующий кусок силиконовой трубки для микро-насосов, средних бутылки, и бутылка отходов. Включите насос в течение 1 ч и измеряют общий объем перекачиваемой из среды для бутылки к ампуле культуры, чтобы определить скорость насоса. Обратите внимание , что типичная скорость откачки должна быть ~ 4 мл / ч, что соответствует скорости разбавления D = 0,33 ч - 1 на 12 мл рабочего объема флакона культуры.
    9. Поместите всю сборку на среднего размера (34 см х 34 см х 43,5 см) шейкера инкубатора.
  2. Предварительное тестирование на Morbidostat
    1. Установить напряжение питания вентилятора прохладного до 5 В, чтобы начать свой двигатель для проверки магнитной мешалки. Следует отметить, что перемешивание действие можно проверить визуально. Напряжение, которое приводы двигатель вентилятора охлаждения точно регулируется с помощью широтно-импульсной модуляции (ШИМ).
    2. Приготовьте серию дикого типа E. палочки образцы с оптической плотностью при 600 нм обычно в диапазоне от 0,07 до 0,3 для калибровки. Поместите тест E. палочки образца в пробирке культуры и записать напряжение фотоприемника.
      1. Место ~ 100 мкл того же образца в планшет-ридере и записывать оптическую плотность. Используйте напряжение фотодетекторов в сравнении с данными оптической плотности для построения калибровочной кривой. Следует отметить, что, как правило, одно изменение единицы оптической плотности соответствует ~ 7,6 V изменения в фотодетектор со схемой смещения, используемого здесь.

2. Запуск Morbidostat

  1. Подготовка Перед началом ежедневного эксперимента
    1. Подготовьте флакон культуры с тремя ультра-химической стойкости тюбингов TYGON с внутренним диаметром 1/32 дюйма и наружным диаметром 3/32 дюйма для испарителей, чтобы сформировать устройство, как и в разделе1.1 и в дополнительном рисунке 1.
    2. Приготовьте минимальной среде М9 (0,2% глюкозы) и триметоприм (TMP) лекарственного средства, содержащего среду. Стерилизовать среда, среда бутылку, среда бутылку наркотиков, бутылку отходов и флакон культуры в автоклаве при температуре 121 ° С.
      Примечание: ТМП представляет собой маточный раствор , который используется для позже достижения концентрации в таблице 1 , и препарат , содержащий ТМП среда не автоклавируют.
  2. Запуск Morbidostat
    1. В первый день эксперимента, разморозить 1 мл замороженного дикого типа E. Клетки палочки 1655 в течение 5 мин при комнатной температуре и передачи 120 мкл клеток в культуральную пробирку , содержащую ~ 12 мл ростовой среды M9. После того, как в первый день, разморозить 1 мл замороженного E. палочка клетки из предыдущего дня в течение 5 мин и передачи 120 мкл клеток к новой культуре флакон , содержащий ~ 12 мл ростовой среды М9.
    2. Включите шейкер инкубатор и установить Темпе ратура до 30 ° C, без встряхивания.
    3. Начало операции morbidostat поворотом на микро-насос, магнитный блок для перемешивания и измерения оптической плотности.
      Примечание: Во время операции порог обратной связи алгоритм используется для управления инъекции лекарственного средства. Когда измеренная оптическая плотность превышает заданный порог, инъекции препарат насос будет включен, и среда насос будет выключен. В противном случае, насос впрыска наркотиков остается выключенным, а средний насос включен.
    4. Монитор напряжения время от времени, чтобы обеспечить там микробный рост.
      Примечание: Из-за замораживании и оттаивании цикла, E. палочка клетки обнаруживают задержку ~ 4 часа во время роста каждого дня.
    5. После ~ 23 ч, остановите микро-насос, выключив его напряжение питания и вынуть флакон культуры. Добавить 15% глицерина в пузырек с культурой и замораживать образца при -80 ° C для хранения.
    6. Повторите шаги 2.2.1 2.2.5.
ле "> 3. Антибиотик Восприимчивость измерения в 96 формате Well

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните измерение скорости роста в ридере с 96-луночного для определения уровня сопротивления антибиотикам.

  1. Растаяйте суточную замороженную пробу при комнатной температуре в течение 5 мин и переносят по 15 мкл клетки в культуральный флакон, содержащий ~ 15 мл среды М9. Дайте им расти до оптической плотности при 600 нм не достигает ~ 0,1. Разделить 15 мл в 1 мл флаконах и добавить препарат TMP на этом этапе , чтобы получить требуемые концентрации лекарственного средства , как показано в таблице 1.
  2. Возьмите 200 мкл образца из шага 3.1 и место в каждую лунку в ридере и дать им возможность расти в течение 12 часов 5. Оптическая плотность при длине волны 600 нм, записывается автоматически во время измерения.
    Примечание: Для каждой точки данных, тройные измерения регистрируются и усредняются для обеспечения согласованности данных. Данные по оптической плотности в зависимости от времени можно бе используется для получения скорости роста.
  3. Изобразите данные о скорости роста в зависимости от концентрации лекарственного средства для получения IC 50. Обратите внимание , что ИК 50 определяют как концентрацию лекарственного средства , при которой скорость роста составляет пятьдесят процентов от максимальной скорости роста 5.

4. Single Cell Морфология и Антибиотик Восприимчивость Измерение в микрожидком устройств

  1. Выполните изготовление микрожидкостных устройств с помощью многослойной мягкой литографии из PDMS , как описано в другом месте 15.
    1. Используйте фотолитографии, чтобы сделать пресс-форму для фоторезиста слоев управления и потока. Обратите внимание, что для уровня управления, использование негативного фоторезиста (~ высота 15 мкм) и позитивного фоторезиста (~ высота 8 мкм), чтобы получить форму на голой кремниевой пластины.
    2. Подготовка PDMS смесей с перекрестными коэффициентами зацепления 5: 1 и 20: 1 для слоя управления и слоя потока соответственно. Помещенный смеси в эксикаторе под вакуумом, чтобы удалить пузырьки, В течение 1 часа.
    3. Вынести управления слой фоторезиста формы на кремниевой пластине с помощью триметилхлорсилана пар (ТМЦ). Сделать контрольный слой ~ толщиной 6 мм путем литья смеси PDMS (с поперечным соотношением связующей 5: 1) на кремниевой подложке на контрольный слой фоторезиста пресс-форме. Выпекать контрольный слой в течение 40 мин при 80 ° С в течение 1 ч в печи.
    4. Сделать слой потока методом центрифугирования смеси PDMS (с коэффициентом трансформации сшивающего 20: 1, скорости отжима 3000 оборотов в минуту в течение 60 с) на слое фоторезиста потока пресс-формы. Выпекать слой потока в течение 30 мин при 80 ° С в течение 1 ч в печи.
    5. Используйте лезвие, чтобы сократить уровень управления в нужный размер чипа (обычно 3 см х 2 см) и вручную снимите слой управления. Поместите слой управления на верхней части слоя потока и выравнивать их под стереомикроскопа. Отверждение выровненный сборки при 80 ° С в печи в течение ночи. Затем пропитать сборку в 250 мл деионизированной воды в пластиковом контейнере в течение 5 часов, чтобы растворить остаточного ТМС,
    6. Впоследствии пробивать впускные отверстия 20 г игл и скрепить весь эластомер на предметное стекло с покрытием с пустым PDMS слоем (кросс ПДМС соединение соотношение 5: 1, скорость отжима 2000 оборотов в минуту в течение 30 сек) путем плазменной обработки воздуха в течение 40 сек при 1.2 давление воздуха торр.
    7. Провести обширные выпечки в течение 36 ч при 80 ° С, чтобы уменьшить цитотоксические эффекты от PDMS. Обратите внимание, что этот шаг выпечки важно свести к минимуму токсичность по отношению к бактериальным клеткам.
  2. На эксперименте Чип роста
    1. Перед загрузкой в ​​микрожидком устройства, промойте его деионизованной водой в течение 1 ч и среде М9 в течение 1 часа.
    2. Растаяйте суточную замороженную пробу при комнатной температуре в течение 5 мин и прививают новую пробирку со свежей средой М9. Поместите образец в шейкере инкубаторе при температуре 37 ° С в течение ночи.
    3. Развести микробной образец 10-кратно среде М9 и загрузить его в микрожидкостных устройство с опрессовкой микробной контейнер для пробы на 5 фунтов на квадратный дюйм. Затем загрузите препарат TMPсреда в чип с опрессовкой контейнер лекарственного средства среде при 5 фунтов на квадратный дюйм. Выполните смешивание между микробом и лекарственного средства путем приведения в действие микромеханическую клапан между двумя камерами на микрожидком чипа в течение 15 мин.
    4. Поместите микрожидкостных чип в микроскоп инкубатор, установленный на инвертированный микроскоп. В него изображение клеток в ростовой камере каждый час в течение 8 часов с ПЗС-камерой, установленной на инвертированный микроскоп.
    5. Используйте скрипт пользовательскую программу для вычисления числа клеток с помощью порогового алгоритма на данных 18 ячейки изображения. Обратите внимание, что данные числа клеток усредняются, как правило, в течение трех микрожидкостных камер.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Описанный выше morbidostat схематизировано на рисунке 1. Распространенное операции morbidostat, в том числе экспериментальной эволюции, антибиотик тест на чувствительность и проверки морфологии клеток, были подтверждены в E. палочки 1655 культура подвергается воздействию триметоприма (ТМП), обычно используемый антибиотик 5,6. TMP вызывает очень характерный ступенчато увеличивается в лекарственной устойчивости, а также мутации группируются вокруг гена ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Невысокое след morbidostat устройство от недорогих компонентов демонстрируется. Увеличения уровня резистентности к лекарственным средствам , зарегистрированных в устройстве согласуются с данными предыдущих докладов 5. Предназначен для эволюционных исследований лекарственной устойчивости, устройство потенциально применима ко многим другим опытам. Во-первых, обширная база данных мутаций, вызванных препаратами может быть установлена ​​для большого набора клинически значимых антибиотиков. Например, эволюционный п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить профессора Се-Би Сюй и г-жу Чжэньчжэнь за полезные обсуждения и помощь в теоретическом анализе и численном моделировании. Y. T. Y. выражает признательность за финансовую поддержку от Министерства науки и технологий в рамках грантов MOST 103-2220-E-007-026 и MOST 104-2220-E-007-011, а также от Национального университета Цинхуа под номерами грантов 103N2042E1, 104N2042E1 и 105N518CE1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Экологический шейкер ИнкубаторBioSanES-20
Arduino Leonardo платаArduinoLeonardo
680 Ом Углеродный резисторDigikeyРезистор смещения для светодиода
100 кОм Углеродный резисторDigikeyРезистор смещения для фототранзистора
940 нм светоизлучающий диодЯркий светодиод ЭлектронныйБИР-BM13E4G-2Измерение оптической плотности
940 нм фототранзисторKodenshi ST-2L2BИзмерение оптической плотности
Пара Дарлингтона IC ToshibaMouserULN2803APGэтой микросхемы приводов микронасосов и магнитного блока мешалки
5 В постоянного тока бесщеточный вентиляторADDAAD0405LX-G70спецификация: напряжение питания 5 В и 80  мама; в наличии www.jameco.com
Пьезоэлектрический микронасосCurieJetPS15I-FT-5LДавление > 3  кПа; Расход >5 мл/мин
Tygon 3350 ТюнингSaint GobainABW00001ID: 1/32" Наружный диаметр: 3/32" L:50' 
Магнитная мешалкаCOWIEконическая форма размер: 10  мм x 4 мм
Стеклянный сцинтилляционный флакон 20 млDGSСтекло Pyrex 28 мм (диаметр) x 61 мм (высота)
Держательдля культуры изготовлен на заказ из полиформальдегида 
СиликонDow CorningSylgald 184используется для укупорки стеклянного флакона
Medium bottleVWR66022-065
Difco M9 минимальная соль 5xBDMedium
Cadamino AcidBDMedium
glucoseSigma
Agar BateriologicalOxoidдля агаровой пластины
Средний
инвертированный микроскопLuria Bertani Leica MicrosystemsLeica DMI-LEDиспользуется для микрофлюидных измерений Используется объектив 40X NA = 0,55
Микроскоп ИнкубаторLive Cell InstrumentCU-109используется для микрофлюидных измерений
Соленоидальные клапаныPneumadyneS10MM-31-12-3Нормально открытый 1,3 Вт 12 В постоянного тока
USB интерфейсная карта USBHobby EngineeringUSBIO24-R Модуль цифрового ввода-вывода для измерения микрофлюидики
Воздушный компрессорRocker ScientificROCKER 440Источник давления для микрофлюидов; макс. давление 80 фунтов на квадратный дюйм
Фитинги с наружной резьбой люэр-лок до заусенца 1/8"ValuePlastics.comMTLL230-1используется для микрофлюидного контроля
1/8" штуцер до 10-32 резьбового портаValuePlastics.comB-1используется для микрофлюидного контроля
Гнездовые фитинги люэр-лока до 10-32 резьбового портаValuePlastics.comKFTL-1используется для микрофлюидного управления
NPN дарлингтон транзистор 500 мА, 40  В (2Н6427)DigiKey.com2Н6427ГОС-НДдля микрофлюидного управления
10 кОм, углеродный пленочный резистор, 0,25 ВтDigiKey.com P10KBACT-НДдля микрофлюидного управления
танталовый конденсатор, 10  μ F, 25 В, 10%DigiKey.com478-1841-NDиспользуется для микрофлюидного контроля
Andor CCD камераAndorZyla 4.2 Plus SCMOSиспользуется для микрофлюидной визуализации на чипе
ELISA планшетный ридер
двухкомпонентный силиконMomentiveRTV 615для изготовления микрофлюидных чипов
SU-8 фоторезистMicrchemSU8 2015для изготовления микрофлюидных чипов
AZ4620 фоторезистClariantAZ 4620для изготовления микрофлюидных чипов
Плазменный очистительHarrick PlasmaPDC 32Gдля изготовления микрофлюидных чипов
Игла для шприцев 20 калибраBDиспользуется для изготовления микрофлюидных чипов
LabcyclerSensoquestLabcyclerPCR
ДНК-полимеразаToyoboKDO PlusPCR amplification
TrimethoprimSigma
Plate readerBiotekSynergy H1 hybrid Измерение резистента к антибиотикам
флакона

Ссылки

  1. Levy, S. B., Marshall, B. Antibiotic resistance worldwide: causes, challenges, and responses. Nat. Med. 10, s122-s129 (2004).
  2. Wang, M. M., et al. Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococus aureus by whole genome sequencing. Pro. Natl. Acad. Sci. 104, 9451(2007).
  3. Dragosits, M., Mattanovich, D. Adaptive laboratory evolution - principles and applications for biotechnology. Microbial Cell Factory. 12, 64(2013).
  4. Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironment. Science. 333, 1764-1767 (2011).
  5. Toprak, E., Veres, A., Michel, J. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44, 101-106 (2012).
  6. Toprak, E., et al. Building a morbidostast: an automated continuous culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocol. 8, 555-567 (2013).
  7. Rosenthal, A. Z., Elowitz, M. B. Following evolution of bacterial antibiotic resistance in real time. Nature Genetics. 44, 11-13 (2012).
  8. Young, K. In vitro antibacterial resistance selection and quantitation. Curr Protoc Pharmacol. , (2006).
  9. Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
  10. Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
  11. Groisman, A., et al. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
  12. Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262(2013).
  13. Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. , (2015).
  14. Mohan, R., et al. A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Biosens Bioelectrons. 49, 118-125 (2013).
  15. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
  16. Kellogg, R. A., Gomez-Sjoberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. Nat. Protocols. 9, 1713(2014).
  17. Gu, G. Y., Lee, Y. W., Chiang, C. C., Yang, Y. T. A nanoliter microfluidic serial dilution bioreactor. Biomicrofluidics. 9, 044126(2015).
  18. Gonzalez, R. C., Woods, R. E., Eddins, S. L. Digital image using Matlab processing. , Pearson Prentice Hall. Upper Saddle River, New Jersey. (2004).
  19. Heikkila, E., Sundstrom, L., Huovinen, P. Trimethoprim resistance in Escherichia coli isolates from a geriatric unit. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2013-2015 (1990).
  20. Flensburg, J., Skold, O. Massive overproduction of dihydrofolate reductase in bacteria as a response to the use of trimethoprim. Eur. J. Biochem. 162, 473-476 (1987).
  21. Ohmae, E., Sasaki, Y., Gekko, K. Effects of five-tryptophan mutations on structure, stability and function of Escherichia coli dihydrofolate reductase. J. Biochem. 130, 439-447 (2001).
  22. Smith, D. R., Calvo, J. M. Nucleotide sequence of dihydrofolate reductase genes from trimethoprim-resistant mutants of Escherichia coli. Evidence that dihydrofolate reductase interacts with another essential gene product. Mol. Gen. Genet. 187, 72-78 (1982).
  23. Okumus, B., Yildiz, S., Toprak, E. Fluidic and microfluidic tools for quantitative systems biology. Curr Opin Biotech. 25, 30-38 (2014).
  24. Cho, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Sci. Transl. Med. 17, 267(2014).
  25. Hsu, S. B., Waltman, P. E. Analysis of a model of two competitors in a chemostat with an external inhibitor. SIAM J. Applied Math. , 528-540 (1992).
  26. Fu, W., et al. Maximizing biomass productivity and cell density of Chlorella vulgaris by using light-emitting diode-based photobioreactor. J. Biotech. 161, 242-249 (2012).
  27. Peabody, V. G. L., Winkler, J., Kao, K. C. Tools for developing tolerance to toxic chemicals in microbial systems and perspectives on moving the field forward and into the industrial setting. Curr Opin in Chem Eng. 6, 9-17 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Escherichia coli

Похожие статьи