Мимической опухолевого микроокружения: Простой метод для генерации обогащается мобильных групп населения и исследование межклеточной коммуникации

Summary

Мы адаптировали проницаемую микропористую мембранную вставку, чтобы имитировать микроокружение опухоли (TME). Модель состоит из смешанной клеточной культуры, позволяет упростить генерацию высокообогащенных отдельных клеточных популяций без использования флуоресцентного мечения или сортировки клеток, а также позволяет изучать межклеточную коммуникацию внутри TME в нормальных или стрессовых условиях.

Abstract

Понимание ранних гетеротипические взаимодействий между раковыми клетками и окружающим нераковая стромы играет важную роль в выяснении событий, приведших к активации стромы и создания микросреды опухоли (TME). Несколько в пробирке и в естественных условиях модели в TME были разработаны; Тем не менее, в целом, эти модели не позволяют легко изоляции отдельных популяций клеток, при невозмущающие условиях, для дальнейшего изучения. Чтобы обойти эту трудность, мы использовали модель TME ин витро с использованием субстрата роста клеток , состоящую из проницаемого микропористой мембраны вкладышем , который обеспечивает простое формирование популяций высоко обогащенных клеток , выращенного тесно, все же по отдельности, по обе стороны мембраны Вкладыше в течение длительного сотрудничества -Культура раз. Благодаря использованию этой модели, мы способны генерировать значительно обогатили рак, связанный фибробласты (CAF) популяции из нормальных диплоидных фибробластов человека следующиесовместное культивирование (120 ч) с высокой метастатической активностью клеток карциномы молочной железы человека, без использования флуоресцентного мечения и / или сортировки клеток. Кроме того, путем модуляции размер пор вставки, мы можем контролировать в режиме межклеточной коммуникации (например, разрыв спая связи, секретируемые факторы) между двумя популяциями гетеротипичной клеток, что позволяет исследовать механизмы , лежащие в основе развития , закрепленных в TME, в том числе роль проницаемости щелевого соединения. Эта модель служит ценным инструментом в деле укрепления нашего понимания исходных событий, приводящих к раку-стромы инициации, ранней эволюции TME и модулирующего влияния стромы на ответах раковых клеток в терапевтических агентов.

Introduction

Микроокружение опухоли (TME) представляет собой весьма сложную систему, состоит из клеток карциномы, которые сосуществуют и развиваются вместе с принимающей стромы. Этот компонент , как правило , состоит стромальных фибробластов, миофибробластов, эндотелиальных клеток, различных иммунных компонентов, а также внеклеточного матрикса ^1. Существенным компонентом, часто большинство этой стромы, активизируются фибробласты, часто упоминается как рак , связанный фибробластов или карциномы ассоциированных с фибробластами (CAF) ^2,3. В отличие от обычных, не активированные фибробласты, CAFS способствуют инициации опухоли, прогрессии, ангиогенез, инвазию, м....

Protocol

1. Подготовка культуральной среды и клеток

1. Приготовьте 500 мл минимально необходимой среды Игла, дополненной 12,5% (об / об) инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-аланил-L-глутамина, и 100 единиц пенициллина и 100 мкг стрептомицина на мл.
   Примечание: Среда для выращивания и дополнения (ы) могут быть легко обменены на требования роста других клеточных штаммов или линий клеток.
2. Готовят 70 мкл клеточной культуральной среды для каждой вставки (6-луночный формат вставки): минимальная поддерживающая среда Игла, дополненной 50% (об / об) инактивированной нагреванием FBS, 2 мМ L-аланил-L-глутамина, и 100 единиц пени....

Results

Здесь мы адаптировали проницаемой микропористой мембраны вставки для разработки гетеротипичной системы клеток совместного культивирования в пробирке , который имитирует микроокружение опухоли в естественных условиях (рисунок 1). Эта система позволяет в течение двух различных популяций клеток выращивать на обе стороны пористой мембраной Вкладыше в течение длительных периодов времени (до 120 часов, в нашем использовании). Важно, что система способна подде.......

Discussion

Протокол , описанный здесь , представляет собой простой, адаптируемой в пробирке процедуры (рисунок 1) , которая использует проницаемой микропористой мембраны вставки для создания высоко обогащенные отдельных клеточных популяций из со-культуры гетеротипичной клеток. Важно отметить, что модель подходит для исследования различных режимов межклеточной коммуникации. Критические шаги включают в выборе соответствующего вставку размером пор для конкретных экспериментальных интерес (ов), высева первую .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Cell Culture
AG01522 (i., AG1522) диплоидный фибробласт человека	Coriell	107661	Passage 8-13
MDA-MB-231-luc-D3H1 клеточная линия аденокарциномы молочной железы	PerkinElmer	119261	Родительская линия: ATCC (#HTB-26)
MDA-MB-231/GFP клеточная линия аденокарциномы молочной железы	Cell Biolabs	AKR-201
Eagle's minimal essential medium (MEM)	Corning Cellgro	15-010-CV
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS), сертифицированная	Sigma	F6178-500mL
Corning Glutagro (200 мМ L-аланил-L-глутамин)	Corning Cellgro	25-015-Cl
раствор пенициллина стрептомицина, 100x	Corning Cellgro	30-002-Cl
Вставка Transwell (т.е., вставка из проницаемой микропористой мембраны) (0,4 μ m pore)	Costar	3450
Transwell Insert (e., проницаемая микропористая мембранная вставка) (1 μ m pore)	Greiner bio-one	657610
Transwell Insert (т.е., проницаемая микропористая мембранная вставка) (3 μ m pore)	Costar	3452
6-луночный культуральный планшет	Greiner Bio-One Cellstar	657160-01
75 см2 колба для клеточных культур	CellStar	658 170
Фосфат-буферный физиологический раствор (PBS), 1x	Corning Cellgro	21-040-CV	без кальция и магния
0,25% (об/об.) Трипсин, 2,21 мМ ЭДТА, 1x	Corning Cellgro	25-053-Cl
15 мл Центрифужная пробирка	CellTreat	229411
35 мм x 10 мм Чашка для клеточных культур	Greiner bio-one	627 160
Название	Company	Номер в каталоге	Комментарии
>Для иммунофлуоресцентной микроскопии
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	In situ Иммунофлуоресценция - 1:5,000
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Вторичное антитело, конъюгат Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-11029	In situ Иммунофлуоресценция - 1:2,000
Бычий сывороточный альбумин - фракция V	Rockland	BSA-50	Иммуноглобулин и протеаза без
16% (масс./об.) Раствор формальдегида	ThermoFisher Scientific	28908	Разбавить до 4% с 1x PBS
Premium Cover Glass (22 мм x 22 мм No1)	Fisher	12548B
Triton X-100	Sigma	T8787-50ML
SlowFade Gold реагент против выцветания с DAPI	Invitrogen	S36938
Name<	strong>Company<	strong>Номер в каталоге	Comments
Для проточного цитометрического анализа
Calcein, Молекулярные зонды аддитивного производства		C3100MP
сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS)	Gibco	14025-076
Name<	strong>Company	Номер в каталоге	Комментарии
Для анализа вестерн-блот
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	Western Blot - 1:1,000
Tween-20	BioRad	170-6531
Нитроцеллюлозная мембрана (0,2 μ m)	BioRad	162-0112
Western Lightning Plus-ECL	PerkinElmer	NEL104001EA
BioRad DC Protein Assay	BioRad	500-0116
Додецилсульфат натрия (SDS)	BioRad	161-0302
Моногидрат дезоксихолата натрия (DOC)	Sigma	D5670
IGEPAL CA-630 (NP40)	Sigma	I8896
30% раствор акриламида/биса, 37,5:1	BioRad	161-0158