Method Article

Мимической опухолевого микроокружения: Простой метод для генерации обогащается мобильных групп населения и исследование межклеточной коммуникации

DOI:

10.3791/54429

⸱

September 20th, 2016

 ,  , 
1Department of Radiology, New Jersey Medical School, Rutgers University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы адаптировали проницаемую микропористую мембранную вставку, чтобы имитировать микроокружение опухоли (TME). Модель состоит из смешанной клеточной культуры, позволяет упростить генерацию высокообогащенных отдельных клеточных популяций без использования флуоресцентного мечения или сортировки клеток, а также позволяет изучать межклеточную коммуникацию внутри TME в нормальных или стрессовых условиях.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Понимание ранних гетеротипические взаимодействий между раковыми клетками и окружающим нераковая стромы играет важную роль в выяснении событий, приведших к активации стромы и создания микросреды опухоли (TME). Несколько в пробирке и в естественных условиях модели в TME были разработаны; Тем не менее, в целом, эти модели не позволяют легко изоляции отдельных популяций клеток, при невозмущающие условиях, для дальнейшего изучения. Чтобы обойти эту трудность, мы использовали модель TME ин витро с использованием субстрата роста клеток , состоящую из проницаемого микропористой мембраны вкладышем , который обеспечивает простое формирование популяций высоко обогащенных клеток , выращенного тесно, все же по отдельности, по обе стороны мембраны Вкладыше в течение длительного сотрудничества -Культура раз. Благодаря использованию этой модели, мы способны генерировать значительно обогатили рак, связанный фибробласты (CAF) популяции из нормальных диплоидных фибробластов человека следующиесовместное культивирование (120 ч) с высокой метастатической активностью клеток карциномы молочной железы человека, без использования флуоресцентного мечения и / или сортировки клеток. Кроме того, путем модуляции размер пор вставки, мы можем контролировать в режиме межклеточной коммуникации (например, разрыв спая связи, секретируемые факторы) между двумя популяциями гетеротипичной клеток, что позволяет исследовать механизмы , лежащие в основе развития , закрепленных в TME, в том числе роль проницаемости щелевого соединения. Эта модель служит ценным инструментом в деле укрепления нашего понимания исходных событий, приводящих к раку-стромы инициации, ранней эволюции TME и модулирующего влияния стромы на ответах раковых клеток в терапевтических агентов.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроокружение опухоли (TME) представляет собой весьма сложную систему, состоит из клеток карциномы, которые сосуществуют и развиваются вместе с принимающей стромы. Этот компонент , как правило , состоит стромальных фибробластов, миофибробластов, эндотелиальных клеток, различных иммунных компонентов, а также внеклеточного матрикса 1. Существенным компонентом, часто большинство этой стромы, активизируются фибробласты, часто упоминается как рак , связанный фибробластов или карциномы ассоциированных с фибробластами (CAF) 2,3. В отличие от обычных, не активированные фибробласты, CAFS способствуют инициации опухоли, прогрессии, ангиогенез, инвазию, метастазирование и рецидив 4-11 в самых разнообразных карцином, включая рак молочной железы, простаты, легких, поджелудочной железы, кожи, толстой кишки, пищевода, и яичник 5,6,12-17. Тем не менее, точный характер вклада CAFS по всему патогенеза рака остается плохо определена. Кроме того, клинические данные продемонстрировали прогностическое значение CAFS, Соотнося свое присутствие в высокосортных злокачественных новообразований, неполадкам терапии, а также в целом неблагоприятным прогнозом 10,18,19.

Очевидно, что повышение наше понимание инициирующих событий в развитии CAF, а также межклеточных коммуникаций, опосредующих их роль в TME, может обеспечить захватывающие новые терапевтические цели и улучшенные стратегии, которые могли бы улучшить результаты лечения пациентов. На пути к этой цели, несколько в естественных условиях и в пробирке моделей были разработаны. В то время как подходы в естественных условиях в большей степени отражают TME пациентов, они обладают ограничениями, в том числе огромную сложность и неоднородность как внутри , так и между опухолями. Кроме того, образцы опухолей от человека предметов часто представляют собой высокоразвитые TME и не позволяют понимание инициирующих событий TME. Экспериментальные исследования на животных предлагают некоторые преимущества, однако обобщение данных животных к людям следует делать с осторожностью из-за различий в physiгия между людьми и животными , такими как грызуны (например, тиол химии 20, скорость обмена веществ 21, толерантностью к стресс 22 и т.д.). Кроме того, в отличие от человеческого населения, что генетически гетерогенным по природе, лабораторных животных, как правило, разводят до однородности. Кроме того, часто бывает трудно исследовать переходные физиологические колебания и изменения клеточного фенотипа, а также для управления для конкретных экспериментальных параметров с использованием животных, таких как грызуны. Таким образом, в пробирке 2- и 3-мерные (2D и 3D) моделей для культуры ткани часто используются для продвижения основного понимания развития TME. Несмотря на отсутствие точного отображения сложности систем в естественных условиях, эти модели предлагают преимущества , которые значительно облегчают механистические исследования. В пробирке модели позволяют более упрощенной, ориентированной и экономически эффективного анализа TME, в результате чего статистически значимое данные могут быть получены вклетки свободных системных изменений, которые возникают у животных.

Есть несколько разновидностей систем в лабораторных условиях . Два наиболее часто используемых TME модели в пробирке состоят из смешанного монослоя или сфероида клеточных культур. Оба метода культуры выгодны для основных исследований межклеточных взаимодействий (например, нормальные клетки с опухолевыми клетками) , а также для анализа различных TME специфических изменений клеточного фенотипа (например, появление раковых ассоциированных фибробластов от нормальных фибробластов). Кроме того, сфероиды способны создать более отражающей ткани-подобную структуру TME, и может быть представителем опухоли неоднородностью 23. Однако сфероиды часто производят широко различные градиенты напряжения кислорода через слои, которые могут осложнить экспериментальные выводы 24. К сожалению, обе модели крайне ограничены в своей способности изолировать чистых клеточных популяций для дальнейшей характеризации и изучения следующего со-культура. Для этого потребуется, по меньшей мере, один тип клеток, чтобы быть флуоресцентно-меченый или маркированный с идентификационным мейкера, а затем подвергая смешанное совместное культивирование обширному обработки и сортировки клеток, чтобы отделить клеточные популяции. В то время как клеточный сортер способна изолировать достаточно чистой популяции клеток, нужно быть осведомленным клеточного стресса и потенциального микробного загрязнения риски 25.

Для облегчения понимания межклеточной коммуникации, большие усилия были посвящены в направлении разработки и оптимизации в пробирке систем , которые тесно имитируют среду в естественных условиях, при этом возможность упрощенного подхода. Одним из таких инструментов является проницаемой микропористой вкладыш, подложка мембрана , которая была впервые разработана в 1953 году 26 , а затем адаптирована для различных областей применения и исследований (например, клеточной полярности 27, 28, эндоцитоза транспорта наркотиков 29, моделирование ткани 30, Фертilization 31, эффект свидетеля 32,33 и т.д.). Эта система позволяет рост клеток с анатомическими в естественных условиях -как и функциональной дифференциации, а также экспрессии многих в естественных условиях маркеров 34,35, которые не наблюдаются при культивировании на непроницаемом из пластмассы. Кроме того, чрезвычайно тонкая пористая мембрана (толщиной 10 мкм) позволяет быструю диффузию молекул и времени установления равновесия, моделирующей среды в естественных условиях и допускает независимое функционирование сотовой связи в обоих апикальных и базолатеральных доменов клеток. Дополнительным преимуществом утилиты Вкладыше в качестве системы TME является его физическое разделение двух популяций клеток, выращенных гетеротипические по обе стороны мембраны, в одних и тех же условиях окружающей среды, сохраняя при этом различные режимы межклеточной коммуникации через поры мембраны. Хотя физически разделены, две клеточные популяции метаболически соединены посредством секретируемых элементов и, как дездесь описано, а также через щелевые-узловой каналов. Кроме того, за счет поддержания вставок при растяжении в естественных условиях частичного кислорода (PO 2), модель уменьшает осложнения , кислорода и химических градиентов , наблюдаемых в других системах. Скорее всего, это увеличивает понимание природных механизмов, контролирующих ТМЕ. Следует отметить, что две клеточные популяции могут быть легко изолированы с высокой степенью чистоты, без флуоресцентного мечения и / или сортировки клеток после длительных периодов совместной культуры.

Здесь мы опишем протокол TME в пробирке , состоящей из клеток карциномы молочной железы человека и фибробластов человека , выращенных соответственно, по обе стороны от проницаемой микропористых мембран вставки, но все же в непрерывной двусторонней связи через поры мембраны. Показано , что при использовании мембран с различными размерами пор, вклад конкретного типа межклеточной коммуникации (например, секретируемые факторы в сравнении щелевых контактов) для развитияиз TME можно исследовать.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка культуральной среды и клеток

  1. Приготовьте 500 мл минимально необходимой среды Игла, дополненной 12,5% (об / об) инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-аланил-L-глутамина, и 100 единиц пенициллина и 100 мкг стрептомицина на мл.
    Примечание: Среда для выращивания и дополнения (ы) могут быть легко обменены на требования роста других клеточных штаммов или линий клеток.
  2. Готовят 70 мкл клеточной культуральной среды для каждой вставки (6-луночный формат вставки): минимальная поддерживающая среда Игла, дополненной 50% (об / об) инактивированной нагреванием FBS, 2 мМ L-аланил-L-глутамина, и 100 единиц пенициллина и 100 мкг стрептомицина на мл.
    Примечание: Среда , дополненной 50% FBS , чтобы облегчить прикрепление клеток к нижней стороне (т.е. нижней) вставки. Среда для выращивания и дополнения (ы) могут быть легко обменены на требования роста других клеточных штаммов или линий клеток.
  3. Приготовьте суспензию клеток из клеток, предназначенных для высевать на нижней стороне вставки.
    Примечание: Здесь результаты были получены с использованием AG1522 нормальных человеческих фибробластов , выращенных в 75 см 2 колбы для культивирования клеток, и , следовательно , эти клетки будут находиться в центре внимания описанию препарата клеточной суспензии в.
  4. Для того, чтобы собрать клетки, удалить среду для роста и моют Клеточный монослой 2x с помощью 5 мл 1x фосфатным буферным физиологическим раствором (PBS).
  5. Удалите PBS и распространение 1 мл 0,25% (об / об) трипсином с 2,21 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), предварительно подогревают до комнатной температуры (RT) над клетками в течение 2 мин при комнатной температуре (при комнатной температуре).
  6. Гасят активности трипсина с 9 мл полной среды роста (полученного на стадии 1.1) и собирают клетки осторожно пипеткой клеточной суспензии по поверхности колбы 10х.
  7. Определить концентрацию клеток с помощью гемоцитометра или электронного счетчика и пипеткой объем клеточной суспензии, которая будет Providе 250000 клеток на вставку в стерильный 15 мл центрифужную пробирку.
  8. Гранул суспензии клеток путем центрифугирования (800 XG, 2 мин). Приостановить осадок клеток со средой роста (полученного на стадии 1.2), чтобы создать концентрацию 250000 клеток на 70 мкл.
    Примечание: В качестве культуры клеток в проницаемых микропористая мембрана вставок основана на 2D субстратах, посева клеток выполняется аналогичным образом, за исключением того, что клетки должны быть сначала суспендировали в среде, содержащей 50% (об / об) FBS для облегчения присоединения.

2. Подготовка вкладышей

Примечание: Для обеспечения стерильных условий, работы в кабинете биологической безопасности ламинарного потока, посвященный культуре клеток.

  1. Выбор вставки с размером пор мембраны 0,4 мкм, 1 мкм или 3 мкм (определяется экспериментальным интересом (ами), так как размер пор может быть использован, чтобы исследовать роль различных режимов межклеточной коммуникации).
    ПРИМЕЧАНИЕ: пор 0,4 мкм СмальДостаточно л, чтобы ограничить образование функциональных щелевых контактов между клетками по обе стороны вставки мембраны и может быть использован для изучения межклеточной коммуникации по секретируемых факторов. Принимая во внимание, поры 1 мкм и 3 мкм достаточно велики, чтобы позволить образование функциональных щелевых контактов и может быть использован для изучения межклеточной коммуникации обеими щелевых контактов и секретируемых факторов.
  2. Удалите отдельные вставки из упаковки и поместить в столь же размера блюдо многоскважинных.
    Примечание: Вставки доступны с различных областях поверхности мембраны , чтобы соответствовать специфическим потребностям применения (например, 6-а, 12-а и 24-а вкладыши.). Здесь результаты были получены с использованием вставки 6-луночного, и, следовательно, будет в центре внимания описания модели.
  3. Накройте блюдо, содержащее вставки с крышкой блюдо. Держа блюдо многоскважинных обеими руками, аккуратно переверните блюдо такое , что вставка днища (то есть, нижняя сторона ) теперь смотрят вверх.
  4. Удалить тысе дно тарелки многоскважинных, обнажая нижнюю сторону пластин. Работа с одной вставкой в ​​то время, использовать стерильную пару щипцов и аккуратно удерживать вставку на месте. С свободной рукой, использовать пипетку с наконечником широким горлом, чтобы привлечь 70 мкл клеточной суспензии (полученной на этапах 1,3-1,8), содержащие 250000 клеток.
  5. Для высевания клетки, поместить кончик пипетки осторожно по центру мембраны Вкладыше, и медленно пипетки 70 мкл клеточной суспензии, медленно перемещая пипетку вокруг поверхности мембраны. Будьте осторожны, чтобы не продлить кончик пипетки и клеточной суспензии до края вставки.
    Примечание: При касании край вставки может привести к потере капиллярного натяжения клеточной суспензии, ведущей к клеткам высыхание во время прикрепления.
  6. Повторите эти действия для остальных вставок, с осторожностью в настоящее время осуществляется не работать непосредственно над открытыми вставками, чтобы избежать возможного загрязнения микробного.
  7. Осторожно верните многоскважинныхблюдо снизу для покрытия вставок. Сохраняя блюдо со вставками перевернутое, инкубировать в увлажненной атмосфере воздуха 5% (об / об) CO 2 при температуре 37 ° С в течение 30-45 мин.
    Примечание: Если суспензию клеток на вставку контактов в нижней части скважины, осторожно поднимите блюдо дно и поставить ее на краю верхней блюдо, так что она образует небольшой угол и создает большее разделение между поверхностью тарелки и нижняя сторона вставки (где клетки высевают). Это позволит предотвратить клетки от прикрепления к поверхности лунок, вместо вставки.
  8. После 30-45 мин времени инкубации, аккуратно удалите блюдо, содержащее вставки и поместить его в шкафу биологической безопасности ламинарного потока.
  9. С двумя руками и держать крышку тарелки плотно, осторожно повторно инвертировать блюдо таким образом, что нижняя сторона вставок, содержащих присоединенные клетки теперь смотрит вниз.
  10. Медленно и осторожно добавляют 2 мл (1 мл в течение 3 мкм пор вставляет, чтобы избежать migratiна клетки через поры вставка) подогретого полной среде (этап 1.1) в каждую лунку, так что нижняя часть вкладыша погружена.
  11. После добавления среды для выращивания во всех лунках, содержащих вставки, поместите блюдо обратно в увлажненном инкубаторе.
  12. Разрешить вставки, чтобы оставаться в покое в инкубаторе в течение 48 часов. Через 48 ч питания клеток отсасыванием в 2 мл среды из нижней части скважины и добавлением 2 мл свежей среды для роста.
  13. После добавления свежей среды в нижней части скважины, начальное число 1 мл второй суспензией клеточной популяции (~ 250000 клеток / мл) на верхней стороне режущей пластины, которая уже имеет первую популяцию клеток растущей на нижней стороне (для них эксперименты, AG1522 (контрольные клетки) или рака (экспериментально) клетки высевают на верхней части вставки, которые уже есть клетки AG1522, предназначением стать CAFS, растущие на нижней стороне вставок). Поместите блюдо обратно в увлажненном инкубаторе.
    Примечание: Если работаING с клетками, которые не очень хорошо прилипают к нижней части вставки, эти клетки могут быть в качестве альтернативы выращены на верхней стороне режущей пластины.
  14. Изменение носителя на 24, 72 и 96 часов после посева второй популяции клеток на верхней стороне режущей пластины аспирацией среды из верхней части вставки и нижней части скважины. Осторожно добавьте 1 мл свежей среды к верхней стороне режущей пластины и 2 мл раствора на забой скважины. Разрешить две клеточные популяции, чтобы оставаться в совместной культуре по обе стороны проницаемого микропористой мембраны вставки в течение 120 ч.

3. Сбор клеток от вставки трипсинизацией

Примечание: В дополнение к легкости получения обогащенных популяций клеток, модель ТМЕ вставка позволяет также аналогичных экспериментальных обработок (например, инкубация с химическими веществами, воздействием условий кислорода, которые выше или ниже окружающей атмосферы, ионизирующим лучевой терапии и т.д.), другой в пробирке TME модели совместного культивирования. Кроме того, проницаемый субстрат вставки совместно культуры могут быть проанализированы с помощью процедур, которые уже разработаны для стандартных моделей 2D для культур тканей. Например, клетки могут быть собраны с любой стороны вставки мембраны , чтобы получить высоко обогащенных популяций, которые затем могут быть использованы для анализа конечных точек (например, на месте иммуно-обнаружения, Вестерн - блоттинга в) или по сети для последующих экспериментов 36.

  1. Для того, чтобы собрать клетки, удалить вставку из ростовой среды и поместить его в 35 мм для культивирования клеток в чашке, содержащей 1 мл PBS. Промыть нижнюю и верхнюю сторону пластины 1х с 1 мл PBS.
  2. Удалите PBS и добавляют 200 мкл 0,25% (об / об) трипсином с 2,21 мМ ЭДТА, предварительно нагревают до комнатной температуры.
    1. Если сбор клеток, выросших на нижней стороне вставки, поместите раствор трипсина в 35 мм чашку и осторожно поместить на дно вставки в раствор трипсина в течение 2 мин при комнатной температуре.
    2. Если собирать клеткиS, выращенных на верхней стороне вставки, поместите вставку в 35 мм чашку и добавляют раствор трипсина в верхней части вставки и инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре.
  3. Гасят активности трипсина путем добавления 800 мкл полной среды роста.
    1. Если сбор клеток, выросших на нижней части вставки, добавьте ростовую среду в мм чашку 35 и собирают клетки осторожно пипеткой 1 мл суспензии клеток по поверхности вставки 10x, чтобы вкладыш проходит под небольшим угол, таким образом, что клеточная суспензия собирает в чашку.
    2. Если сбор клеток с верхней стороны вставки, добавьте ростовой среды к верхней стороне, и осторожно пипеткой 1 мл суспензии клеток по поверхности вставки 10-кратным.

4. Определение характеристик клеточной чистоты с помощью проточной цитометрии

Примечание: Для того, чтобы охарактеризовать способность проницаемые микропористых мембран, вставок для поддержания чистоты тон две популяции клеток (то есть, верхний и нижний) в течение до 120 ч, секции 1-3 были выполнены с зеленого флуоресцентного белка (GFP) -tagged клетки MDA-MB-231 посевом на верхней стороне вставки, и не-GFP-меченый AG1522 клетки посевом на нижней стороне 0,4 μm-, 1 μm- или 3 мкм поры вставок.

  1. После того, как клетки с нижней стороны пластины были собраны (процедура описана в разделе 3), Шарик суспензии клеток путем центрифугирования (500 г, 30 сек).
  2. Удалить супернатант и приостановить осадок клеток в 400 мкл Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS) с добавлением 1% (об / об) FBS.
  3. Провести анализ цитометрии на проточном цитометре , снабженный 488 нм лазера для возбуждения GFP и полосовой фильтр 530/30 для обнаружения GFP эмиссии 37 фотонов.
  4. В целях идентификации клеток, использование популяции клеток с AG1522 для регулировки вперед и бокового рассеяния напряжений на проточном цитометре. регулироватьнапряжение GFP канала для установки сотовой значение автофлюоресценции в качестве нижнего порога обнаружения для сигнала GFP.
  5. Определение стробирования порога с использованием контрольных клеток. Оценка чистоты каждой клеточной популяции на основе наличия GFP-положительных клеток в сравнении с контролем.
    Примечание: Чистое население будет отражать не GPF-положительных клеток, обнаруженных.

5. Характеристика клеток посредством In Situ иммунофлуоресценции

  1. После трипсинизации клеток из вставки (смотри раздел 3), собирают клетки, пластины 5 х 10 4 клеток в 250 мкл среды для роста (этап 1.1) на стерильные покровные стекла, а также позволяют прикрепляться в течение 1 часа в увлажненной атмосфере воздуха 5% (об / об) , СО 2 при 37 ° С инкубатор.
  2. В конце инкубации, осторожно удалите чашку, содержащую покровное и поместить его в шкаф биологической безопасности с ламинарным потоком воздуха.
  3. Осторожно добавьте 2 мл подогретого полной среде (см шаг1.1) в каждую чашку, так что покровное погружена.
  4. После добавления среды для выращивания на всех блюд , содержащих покровные, возвращают посуду в увлажненной атмосфере воздуха 5% (об / об) CO 2 при 37 ° С в термостате в течение 48 часов.
  5. После 48 часов инкубации, отмывки образца 3 раза ПБС, а затем зафиксировать с помощью 4% (вес / объем) формальдегида в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
  6. Промыть 5x с забуференным трис физиологическим раствором (TBS: 50 мМ Трис-Cl, рН 7,5, 150 мМ NaCl) и затем проницаемыми с 0,25% (об / об) Тритона X-100, 0,1% (вес / объем) сапонин в течение 5 мин при RT.
  7. Блок неспецифические сайты связывания с 2% (об / об) нормальной козьей сыворотки (NGS), 1% (вес / объем) бычьим сывороточным альбумином (БСА), 0,1% (об / об) Тритон Х-100 в TBS (блокирование раствор) в течение 1 ч при комнатной температуре.
  8. Инкубируйте с первичным антителом (анти-Кавеолин 1 (CAV1), 1: 1000) в блокирующем растворе при 4 ° С в течение ночи.
  9. Отмойтесь несвязавшихся первичных антител (3x, 5 мин / промывку) с добавлением 0,2% NGS (об / об), 1% (вес / объем) БСА, 0,1% (VOл / т) Тритон Х-100 в TBS (моющий раствор).
  10. Инкубируйте с вторичными антителами при комнатной температуре в течение 1 ч в блокирующем растворе (см раздел 5.4).
  11. Смыть несвязанного вторичное антитело (3x, 5 мин / стирки) с раствором для промывки (см шаг 5.6).
  12. Гора покровные на слайде с монтажной средой анти-выцветанию, содержащей 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI), и печать с лаком для ногтей.
  13. Отметим, клетки с использованием объектива масла увеличения 63X на инвертированный микроскоп оснащен внешним источником света для возбуждения флуоресценции, и захвата изображений с помощью прикрепленного цифровую камеру для последующего анализа.

6. Характеристика клеток с помощью Вестерн-блот

Примечание: Вестерн - блот процедура описана в другом месте 38. Ниже приводится краткое описание описано здесь:

  1. После отсоединение клеток из вставки с помощью обработки трипсином (смотри раздел 3), Шарик суспензии клеток путем центрифугирования (500 г, 30 сек).
  2. Удалить супернатант и приостановить Клеточный осадок 2X с применением 100 мкл PBS.
  3. Удалить супернатант и Лизируйте клеток в 50 мкл модифицированного анализа радиоиммуноосажден (РИПА) буфера (Трис рН 7,5 50 мМ, NaCl 150 мМ, NP40 1% (об / об), моногидрат дезоксихолат натрия (DOC) 0,5% (об / об), додецилсульфата натрия (ДСН) 0,1% (об / об)), содержащий протеазы и ингибитор фосфатазы коктейль.
  4. Инкубировать в течение 20 мин на льду и центрифуге при 19000 г в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
  5. Определить концентрацию белка в надосадочной жидкости с использованием анализа оптической плотности белка, совместимого с моющими средствами в буфере RIPA.
  6. Отдельные белки с помощью электрофореза с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) и electroblot на 0,2 мкм нитроцеллюлозный мембрану.
  7. Инкубируйте мембраны в TBS, содержащем 0,1% (об / об) Tween-20 (TBST) и 4% (вес / объем) обезжиренного молока (блокирующий раствор) в течение 60 мин и вступают в реакцию с первичным антителом при 4 ° С в течение ночи (анти-CAV1, 1: 1000).
  8. Вымойте мембраны 3 раза с TBST при комнатной температуре (5 мин / стирки).
  9. Инкубируйте мембран в течение 30 мин в блокирующем растворе, содержащих анти-мышь вторичного антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) (1: 5000).
  10. Вымойте мембраны 3 раза с TBST при комнатной температуре (5 мин / стирки).
  11. Визуализируйте продукты реакции хемилюминесценции с использованием западной системы обнаружения блоттинга.

7. Характеристика межклеточной коммуникации с помощью проточной цитометрии

Примечание: Для характеристики адаптивности проницаемой микропористой мембраны вставки исследовать различные режимы межклеточной коммуникации (например, секретируемых факторов, ЩС). Разделы 1-2.12 были выполнены с нефлуоресцентном AG1522 клетки посевом на нижней стороне 0,4 μm-, 1 μm-, или 3 мкм порами вставки.

  1. Культура не-меченых клеток AG1522 в 35 мм блюдо до 90% сплошности с использованием среды, описанной в разделе 1.1.
  2. рInSe клетки 1x 1 мл HBSS.
  3. Тензодатчики кальцеин AM путем инкубации клеток в HBSS, содержащей 30 мкМ кальцеина AM.
  4. Инкубировать в течение 15 мин в увлажненной атмосфере воздуха 5% (об / об) CO 2 при 37 ° С.
  5. Вымойте клетки 2x с 1 мл HBSS.
  6. Trypsinize клетки путем добавления 200 мкл раствора 0,25% (об / об) с помощью трипсина 2,21 мМ ЭДТА в течение 2 мин при комнатной температуре.
  7. Гасят активности трипсина путем добавления 800 мкл полной среды, содержащей 12,5% (об / об) FBS.
  8. Принесите клетки в суспензии повторным пипетированием.
  9. Определить концентрацию клеток с помощью гемоцитометра или электронного счетчика и пластины 250000 клеток, нагруженных кальцеина AM к верхней стороне вставки, которые уже имеют клетки AG1522 растущие на нижней стороне.
  10. Инкубируйте вставками в увлажненной атмосфере воздуха 5% СО 2 при 37 ° C в течение 6 часов.
  11. Через 6 ч, собирают клетки от нижней стороны вставки, как описанов разделе 3.
  12. Гранул суспензии клеток путем центрифугирования (500 г, 30 сек).
  13. Удалить супернатант и приостановить осадок клеток в 400 мкл HBSS, дополненной 1% (об / об) FBS.
  14. Анализ клеток на цитометра, оснащенного лазером и фильтр, способный возбуждать и обнаруживать излучение кальцеина (496 нм и 516 нм, соответственно), в соответствии с протоколом производителя.
  15. В целях идентификации клеток, использование неокрашенной контрольной популяции клеток AG1522 для регулировки вперед и бокового рассеяния напряжения на проточном цитометре. Отрегулируйте напряжение канала кальцеиновыми установить значение сотовой связи автофлюоресценции в качестве нижнего порога обнаружения для сигнала кальцеиновыми.
  16. Определить верхний предел порогового используя кальцеином нагруженные контрольные клетки. Оценка взаимодействия для каждой вставки ячейки на основе присутствия кальцеина-положительных клеток в сравнении с контролем.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы адаптировали проницаемой микропористой мембраны вставки для разработки гетеротипичной системы клеток совместного культивирования в пробирке , который имитирует микроокружение опухоли в естественных условиях (рисунок 1). Эта система позволяет в течение двух различных популяций клеток выращивать на обе стороны пористой мембраной Вкладыше в течение длительных периодов времени (до 120 часов, в нашем использовании). Важно, что система способна подде...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол , описанный здесь , представляет собой простой, адаптируемой в пробирке процедуры (рисунок 1) , которая использует проницаемой микропористой мембраны вставки для создания высоко обогащенные отдельных клеточных популяций из со-культуры гетеротипичной клеток. Важно отметить, что модель подходит для исследования различных режимов межклеточной коммуникации. Критические шаги включают в выборе соответствующего вставку размером пор для конкретных экспериментальных интерес (ов), высева первую ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих или противоречащих друг другу интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано грантами от Комиссии Нью-Джерси по исследованию рака (Pre-Doctoral Fellowship DFHS13PPCO17), Национальных институтов здравоохранения (CA049062) и Национального управления по аэронавтике и исследованию космического пространства (NNX15AD62G).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
For Cell Culture
AG01522 (i., AG1522) диплоидный фибробласт человекаCoriell107661Passage 8-13
MDA-MB-231-luc-D3H1 клеточная линия аденокарциномы молочной железыPerkinElmer119261Родительская линия: ATCC (#HTB-26)
MDA-MB-231/GFP клеточная линия аденокарциномы молочной железыCell BiolabsAKR-201
Eagle's minimal essential medium (MEM)Corning Cellgro15-010-CV
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS), сертифицированнаяSigmaF6178-500mL
Corning Glutagro (200 мМ L-аланил-L-глутамин)Corning Cellgro25-015-Cl
раствор пенициллина стрептомицина, 100xCorning Cellgro30-002-Cl
Вставка Transwell (т.е., вставка из проницаемой микропористой мембраны) (0,4 μ m pore)Costar3450
Transwell Insert (e., проницаемая микропористая мембранная вставка) (1 μ m pore)Greiner bio-one657610
Transwell Insert (т.е., проницаемая микропористая мембранная вставка) (3 μ m pore)Costar3452
6-луночный культуральный планшетGreiner Bio-One Cellstar657160-01
75 см2 колба для клеточных культурCellStar658 170
Фосфат-буферный физиологический раствор (PBS), 1xCorning Cellgro21-040-CVбез кальция и магния
0,25% (об/об.) Трипсин, 2,21 мМ ЭДТА, 1xCorning Cellgro25-053-Cl
15 мл Центрифужная пробиркаCellTreat229411
35 мм x 10 мм Чашка для клеточных культурGreiner bio-one627 160
НазваниеCompanyНомер в каталогеКомментарии
>Для иммунофлуоресцентной микроскопии
Mouse anti-Caveolin 1BD Transduction Laboratories610406In situ Иммунофлуоресценция - 1:5,000
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Вторичное антитело, конъюгат Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-11029In situ Иммунофлуоресценция - 1:2,000
Бычий сывороточный альбумин - фракция VRocklandBSA-50Иммуноглобулин и протеаза без
16% (масс./об.) Раствор формальдегидаThermoFisher Scientific28908Разбавить до 4% с 1x PBS
Premium Cover Glass (22 мм x 22 мм No1)Fisher12548B
Triton X-100SigmaT8787-50ML
SlowFade Gold реагент против выцветания с DAPIInvitrogenS36938
Name<strong>Company<strong>Номер в каталогеComments
Для проточного цитометрического анализа
Calcein, Молекулярные зонды аддитивного производстваC3100MP
сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS)Gibco14025-076
Name<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
Для анализа вестерн-блот
Mouse anti-Caveolin 1BD Transduction Laboratories610406Western Blot - 1:1,000
Tween-20BioRad170-6531
Нитроцеллюлозная мембрана (0,2 μ m)BioRad162-0112
Western Lightning Plus-ECLPerkinElmerNEL104001EA
BioRad DC Protein AssayBioRad500-0116
Додецилсульфат натрия (SDS)BioRad161-0302
Моногидрат дезоксихолата натрия (DOC)SigmaD5670
IGEPAL CA-630 (NP40)SigmaI8896
30% раствор акриламида/биса, 37,5:1BioRad161-0158
добавка

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
  2. Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
  3. Pandol, S., Edderkaoui, M., Gukovsky, I., Lugea, A., Gukovskaya, A. Desmoplasia of pancreatic ductal adenocarcinoma. Clinical Gastroenterology and Hepatology: the Official Clinical Practice. Journal of the American Gastroenterological Association. 7 (11 Suppl), S44-S47 (2009).
  4. Dabbous, M. K., Haney, L., Carter, L. M., Paul, A. K., Reger, J. Heterogeneity of fibroblast response in host-tumor cell-cell interactions in metastatic tumors. Journal of Cellular Biochemistry. 35 (4), 333-344 (1987).
  5. Olumi, A. F., Grossfeld, G. D., Hayward, S. W., Carroll, P. R., Tlsty, T. D., Cunha, G. R. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Cancer Research. 59 (19), 5002-5011 (1999).
  6. Orimo, A., Gupta, P. B., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121 (3), 335-348 (2005).
  7. Schürch, W., Seemayer, T. A., Lagacé, R., Gabbiani, G. The intermediate filament cytoskeleton of myofibroblasts: an immunofluorescence and ultrastructural study. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 403 (4), 323-336 (1984).
  8. Nakagawa, H., Liyanarachchi, S., et al. Role of cancer-associated stromal fibroblasts in metastatic colon cancer to the liver and their expression profiles. Oncogene. 23 (44), 7366-7377 (2004).
  9. Choi, Y. P., Lee, J. H., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
  10. Ito, M., Ishii, G., Nagai, K., Maeda, R., Nakano, Y., Ochiai, A. Prognostic impact of cancer-associated stromal cells in patients with stage I lung adenocarcinoma. Chest. 142 (1), 151-158 (2012).
  11. Gaggioli, C., Hooper, S., et al. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nature Cell Biology. 9 (12), 1392-1400 (2007).
  12. Navab, R., Strumpf, D., et al. Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7160-7165 (2011).
  13. Hwang, R. F., Moore, T., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).
  14. Sneddon, J. B., Zhen, H. H., et al. Bone morphogenetic protein antagonist gremlin 1 is widely expressed by cancer-associated stromal cells and can promote tumor cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14842-14847 (2006).
  15. De Wever, O., Nguyen, Q. -D., et al. Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 18 (9), 1016-1018 (2004).
  16. Zhang, C., Fu, L., et al. Fibroblast growth factor receptor 2-positive fibroblasts provide a suitable microenvironment for tumor development and progression in esophageal carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (12), 4017-4027 (2009).
  17. Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M. CLIC4 mediates TGF-β1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer. Oncology Reports. , (2009).
  18. Crawford, Y., Kasman, I., et al. PDGF-C mediates the angiogenic and tumorigenic properties of fibroblasts associated with tumors refractory to anti-VEGF treatment. Cancer Cell. 15 (1), 21-34 (2009).
  19. Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Seminars in Cancer Biology. 25, 61-68 (2014).
  20. Messina, J. P., Lawrence, D. A. Effects of 2-mercaptoethanol and buthionine sulfoximine on cystine metabolism by and proliferation of mitogen-stimulated human and mouse lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 14 (7), 1221-1234 (1992).
  21. Ames, B. N. Endogenous oxidative DNA damage, aging, and cancer. Free Radical Research Communications. 7 (3-6), 121-128 (1989).
  22. Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
  23. Upreti, M., Jamshidi-Parsian, A., et al. Tumor-endothelial cell three-dimensional spheroids: new aspects to enhance radiation and drug therapeutics. Translational Oncology. 4 (6), 365-376 (2011).
  24. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
  25. Muraki, Y., Hongo, S., Ohara, Y. Contamination of the cell sorter fluidics system with the water-borne bacterium Burkholderia cepacia. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (2), 105-107 (2012).
  26. Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172 (4384), 869-870 (1953).
  27. Tan, S., Tompkins, L. S., Amieva, M. R. Helicobacter pylori usurps cell polarity to turn the cell surface into a replicative niche. PLoS Pathogens. 5 (5), e1000407(2009).
  28. Hyman, T., Shmuel, M., Altschuler, Y. Actin is required for endocytosis at the apical surface of Madin-Darby canine kidney cells where ARF6 and clathrin regulate the actin cytoskeleton. Molecular Biology of the Cell. 17 (1), 427-437 (2006).
  29. Ghaffarian, R., Muro, S. Models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (80), e50638(2013).
  30. Braian, C., Svensson, M., Brighenti, S., Lerm, M., Parasa, V. R. A 3D human lung tissue model for functional studies on mycobacterium tuberculosis infection. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (104), e53084 (2015).
  31. Bath, M. L. Inhibition of in vitro fertilizing capacity of cryopreserved mouse sperm by factors released by damaged sperm, and stimulation by glutathione. PLoS ONE. 5 (2), e9387(2010).
  32. Zhao, Y., De Toledo, S. M., Hu, G., Hei, T. K., Azzam, E. I. Connexins and cyclooxygenase-2 crosstalk in the expression of radiation-induced bystander effects. British Journal of Cancer. 111 (1), 125-131 (2014).
  33. Buonanno, M., de Toledo, S. M., Azzam, E. I. Increased frequency of spontaneous neoplastic transformation in progeny of bystander cells from cultures exposed to densely ionizing radiation. PLoS ONE. 6 (6), e21540(2011).
  34. Byers, S. W., Hadley, M. A., Djakiew, D., Dym, M. Growth and characterization of polarized monolayers of epididymal epithelial cells and Sertoli cells in dual environment culture chambers. Journal of Andrology. 7 (1), 59-68 (1986).
  35. Pitt, A., Gabriels, J. Epithelial cell culture on microporous membranes. American Biotechnology Laboratory. 4 (5), 38-45 (1986).
  36. Buonanno, M., de Toledo, S. M., Pain, D., Azzam, E. I. Long-term consequences of radiation-induced bystander effects depend on radiation quality and dose and correlate with oxidative stress. Radiation Research. 175 (4), 405-415 (2011).
  37. Ducrest, A. -L., Amacker, M., Lingner, J., Nabholz, M. Detection of promoter activity by flow cytometric analysis of GFP reporter expression. Nucleic Acids Research. 30 (14), e65(2002).
  38. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016).
  39. Mercier, I., Casimiro, M. C., Wang, C. Human breast cancer-associated fibroblasts (CAFs) show caveolin-1 down-regulation and RB tumor suppressor functional inactivation: implications for the response to hormonal therapy. Cancer Biology & Therapy. , (2008).
  40. Martinez-Outschoorn, U. E., Pavlides, S., et al. Tumor cells induce the cancer associated fibroblast phenotype via caveolin-1 degradation: implications for breast cancer and DCIS therapy with autophagy inhibitors. Cell Cycle. 9 (12), 2423-2433 (2010).
  41. Witkiewicz, A. K., Dasgupta, A., et al. Loss of stromal caveolin-1 expression predicts poor clinical outcome in triple negative and basal-like breast cancers. Cancer Biology & Therapy. 10 (2), 135-143 (2014).
  42. Zhao, X., He, Y., et al. Caveolin-1 expression level in cancer associated fibroblasts predicts outcome in gastric cancer. PLoS ONE. 8 (3), e59102(2013).
  43. Shaul, P. W., Anderson, R. G. Role of plasmalemmal caveolae in signal transduction. The American Journal of Physiology. 275 (5 Pt 1), L843-L851 (1998).
  44. Fujimoto, T., Kogo, H., Nomura, R., Une, T. Isoforms of caveolin-1 and caveolar structure. Journal of Cell Science. 113 (Pt 19), 3509-3517 (2000).
  45. Wartiovaara, J., Lehtonen, E., Nordling, S., Saxen, L. Do Membrane Filters prevent Cell Contacts. Nature. 238 (5364), 407-408 (1972).
  46. Tyan, S. -W., Kuo, W. -H., et al. Breast cancer cells induce cancer-associated fibroblasts to secrete hepatocyte growth factor to enhance breast tumorigenesis. PLoS ONE. 6 (1), e15313(2011).
  47. Xu, J., Lu, Y., Qiu, S., Chen, Z. -N., Fan, Z. A novel role of EMMPRIN/CD147 in transformation of quiescent fibroblasts to cancer-associated fibroblasts by breast cancer cells. Cancer Letters. 335 (2), 380-386 (2013).
  48. Hoffman, R. M. Stromal-cell and cancer-cell exosomes leading the metastatic exodus for the promised niche. Breast Cancer Research : BCR. 15 (3), 310(2013).
  49. Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (1), 33-39 (2010).
  50. Kuse, R., Schuster, S., Schübbe, H., Dix, S., Hausmann, K. Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls. Blut. 50 (4), 243-248 (1985).
  51. Vaupel, P., Schlenger, K., Knoop, C., Höckel, M. Oxygenation of human tumors: evaluation of tissue oxygen distribution in breast cancers by computerized O2 tension measurements. Cancer Research. 51 (12), 3316-3322 (1991).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tumor MicroenvironmentCancer Associated FibroblastsIntercellular CommunicationCell Culture InsertsGap Junction PermeabilityCo Culture ModelEnriched Cell PopulationsMicroporous MembranePore Size ModulationFluorescence Microscopy

Related Articles