Методическая статья

Простой подход к Манипулирование растворенным кислородом для Поведение животных Наблюдения

9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54430

⸱

28 июня 2016 г.

 , 
1Department of Biology, Juniata College

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье описывается простой и воспроизводимый протокол манипулировать растворенные условия кислорода в лабораторных условиях для исследования поведения животных. Этот протокол может быть использован в обоих учебных и научно-исследовательской лаборатории условиях для оценки реакции организменном макробеспозвоночных, рыб, земноводных или к изменениям в концентрации растворенного кислорода.

Аннотация

Способность манипулировать растворенного кислорода (DO) в лабораторных условиях имеет значительное применение для исследования ряда экологических и организменном вопросов поведения. Протокол, описанный здесь, обеспечивает простой, воспроизводимый, и контролируемый способ манипулировать DO изучать поведенческую реакцию в водных организмов, являющихся результатом гипоксических и бескислородных условиях. При выполнении дегазацию воды с азотом обычно используется в лабораторных условиях, не явный метод экологического (водной) применения не существует в литературе, и этот протокол является первым, чтобы описать протокол дегазировать воду, чтобы наблюдать реакцию организменном. Этот метод и протокол были разработаны для непосредственного применения для водных беспозвоночных; Тем не менее, мелкая рыба, амфибии и другие водные позвоночные могут быть легко заменены. Это позволяет легко манипулировать уровнями DO в диапазоне от 2 мг / л до 11 мг / л, стабильность в течение периода до животного наблюдения 5 мин.За период 5 мин наблюдения температуры воды начал подниматься, и в 10 мин DO уровни стали слишком нестабильными для поддержания. Протокол является масштабируемым для исследуемого организма, воспроизводимым и надежным, позволяя для быстрого внедрения в вводных учебных лабораторий и исследовательских приложений высокого уровня. Ожидаемые результаты этого метода следует отнести изменения растворенного кислорода в поведенческих реакциях организмов.

Введение

Растворенный кислород (DO) является одним из ключевых параметров физико-химическая важную роль в опосредовании ряда биологических и экологических процессов в пределах водных экосистем. Воздействия острой и хронической сублетального гипоксии снижения темпов роста в некоторых водных насекомых и уменьшить выживание насекомых при 1. Этот протокол был разработан, чтобы обеспечить контролируемый способ манипулировать уровнями DO в потоке воды, чтобы наблюдать воздействие на поведение животных. Поскольку выживание всех аэробных водных организмов "зависит от концентрации кислорода для того, чтобы жить и размножаться, изменения в концентрации DO часто отражаются в поведенческих изменениях организмов. Более мобильные водные беспозвоночные и рыбы наблюдались реагировать на низких концентраций кислорода (гипоксии) путем поиска локалей с более высоким DO 2,3. Для менее подвижных водных организмов, поведенческие адаптации увеличить потребление DO может быть единственным жизнеспособным вариантом. Водной макробеспозвоночных порядок ПлекOPTera (веснянок) было отмечено для выполнения "Push-Up" движения , чтобы увеличить поток воды, и поглощение кислорода, через их внешние жабры 4 - 6. Эти адаптивные модели поведения наблюдаются в естественных условиях и в лабораторных экспериментах.

Лабораторные манипуляции DO в воде открывает значительные возможности для исследований поведения животных, но существенные пробелы в методологическом развертывании существуют. Например, в одном исследовании были использованы большие аквариумы для оценки физиологического времени отклика окуня (Micropterus salmoides) в гипоксических условиях следующей барботировании азотом, но скудный подробно дается на методологии 7. Другое исследование , проведенное на Зебра рыбы (Danio rerio) описывается с использованием газообразного азота и пористый камень , чтобы поставлять газ в воду и уменьшить DO воды 8. Для применения химии на основе методов дегазацию растворителей используют специализированныеУстройство 9 - 11 для удаления кислорода из растворителей, но не подходит для изучения поведения животных. В то время как эти исследования используют методы для удаления кислорода из воды, не описательный метод не может быть определено, что позволило бы для оценки поведения животных в ответ на изменения DO.

Этот метод описан далее попытка полностью описать протокол для манипулирования DO воды с использованием газообразного азота. Кроме того, этот метод был разработан в направлении наблюдения взаимосвязи между поведением Stonefly (отжимания) и DO, который был использован в биологии лаборатории первокурсник уровня. Одним из основных преимуществ этого метода является то, что она легко может быть выполнена в лаборатории с общей стеклянной посуды и материалов, доступных для большинства средних и высших учебных заведений. Протокол также легко адаптируется, что позволяет людям масштабировать процедуру для достижения целей, изложенных в научных или учебных приложений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Этот эксперимент не использовали позвоночных животных и поэтому не требуют одобрения института Juniata колледжа по уходу и использованию животных комитета. Однако для людей, адаптирующихся этот метод для использования с позвоночных, утверждение IACUC следует искать.

1. Поле для сбора проб

  1. Определить и оценить потенциальные участки поля для возможности сбора, хранения и транспортировки веснянки быстро, чтобы минимизировать время в пути с максимальной рекомендуется время в пути 1 ч.
  2. Выполните кик-сеть выборки на выбранном участке поля в соответствии со стандартными кик-нетто процедур достаточное количество раз , чтобы собрать по меньшей мере 35 веснянок 12.
  3. Соберите 50 л потока воды и горных пород с максимальным диаметром 2 см от потоков.
  4. Поместите аквариумы в холодильник установлен на температуру участка потока. Распределить пород, собранных на месте потока в аквариумах и залить 4 л потока воды в аквариуме. Поместите 20-30 Собранные веснянки в аквариум и поместить пузырящуюся камень, прикрепленный к аквариума барботер в каждый бак и включите барботерах непрерывно добавлять воздуха в помещении в воду.
  5. Разрешить веснянки, чтобы приспособиться к новым условиям в аквариумах в течение периода 48 ч.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Установка для растворенного кислорода манипуляции. (A) 1) Установка для медной трубы к мужскому шланг бородки 2) Расположение стопора уплотнения для изучения для обеспечения герметизации и флягу. (В) 1) 2 л бокового рычага колба заполнена 1,9 л воды 2) трубки газа и воздуха барботера (синий) для использования в пропускании азота и барботировании воздуха комнатной соответственно 3) резервуар с азотом и калиброванных значений 4) 2 - литровую колбу заполнен 0,4 л воды с вакуумной трубкой под водой 5) Растворенный метр кислорода. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобыпросмотреть большую версию этой фигуры.

2. Экспериментальная установка

  1. На скамейке сверху, подключите стандартный огороженный вакуумную трубку к боковой ручке 2 л боковой рукоятки колбы , как показано (1 на рисунке 1В).
  2. Наполните колбу с 1,9 л воды из потока 3 л пластиковых контейнеров, содержащих собранную струей воды в холодильнике установлен на 12 ° C.
  3. Поместите колбу и трубку на лоток, достаточно большой, чтобы провести ледяную баню вокруг колбы боковой рукоятки, не заслоняя вид внутренней колбы и заполнить лоток со льдом.
  4. Просверлите два отверстия диаметром 3 мм в резиновой пробке , чтобы обеспечить проход 1) медной трубки для доставки газа в сосуд , и 2) зонд метра DO в 2 л противодавлением колбу (1 на рисунке 1В) ,
  5. Делают боковой разрез от края пробки к одному из отверстий, чтобы позволить размещение провода зонда DO в пробке.
  6. Подключите переходник с наружной шлангом 3 ммЗубец к части 2 мм диаметр медной трубы (1 на рис 1А). Убедитесь, что эта труба достаточно долго, чтобы достичь в пределах 10 см от дна колбы при достижении через пробку.
  7. Поместите трубу с соединителем, хотя второе отверстие в пробке до длины от нижней части пробки достаточно, чтобы добраться до пределах 10 см от дна колбы.
  8. Подключение 0,75 м длины, тонкостенная полиэтиленовая газовая труба с диаметром от 3 мм до муфты на трубе.
  9. Вставьте оба зонда DO и медные трубы в колбу и запечатать колбу с пробкой.
  10. Проверка на безопасное уплотнение между пробкой и колбы, а также плотное прилегание между трубой и зондом проволоки в пробке.
  11. Наполните колбу емкостью 1 л с 0,4 л водопроводной воды и место, соседнее с лотком с ледяной бани и вакуумной колбы.
  12. Погрузитесь полиэтиленовой трубки Исходя из большого термоса в воду в колбе объемом 1 л. ЗакрепитеТрубка с лентой таким образом, что она будет оставаться под водой с помощью эксперимента.
  13. Соедините диаметром 3 мм линию газа из вакуумной колбы аквариума помещение воздуха барботер. Начинают пузырь воды в 2-литровую колбу, вставив в аквариуме барботер, который вводит комнатный воздух и кислород в воду.
  14. Мониторинг концентрации DO и температуру воды с измерителем DO в течение 5 минут или пока равновесие DO не установлено внутри камеры таким образом, что небольшое изменение DO происходит.

3. Проверка устойчивости Экспериментальная установка

  1. Проверьте каждую установку для стабильности сделать перед добавлением веснянки.
  2. Добавьте три или четыре скалы в 2-литровую колбу так, что веснянки имеют подложку, благоприятную для отжимания.
  3. Начните пробный манипуляции DO, отсоединив газовую трубу из барботера и присоединение его к линии газообразного азота.
  4. Начните пропускании азота со скоростью 20 кубических футов в час (CFH) в течение приблизительно 40сек до 1 мин.
  5. После того, как DO упала с точностью до 0,5 мг / л целевой концентрации, уменьшить поток до 15 CFH и позволяют уменьшить концентрацию до цели.
  6. Прекратить подачу азота сразу после того, как целевая концентрация достигается.
  7. Используйте аквариум комнате воздуха барботер, чтобы вернуть концентрацию до целевой концентрации, если DO уменьшается ниже цели.
  8. Если DO неустойчив во время тестирования подстроено затем проверьте объем воды по-прежнему на уровне 1,9 л и вода не ыми вне, температура воды стабильна и не меняется, и уплотнения на всех фитингов, как представляется, плотно и запечатывают.
  9. После того, как три испытания были проведены и экспериментатор имеет уверенность в способности контролировать DO, присоединить газопровод к барботер и пузырь снова равновесие.
  10. Пузырь к равновесию, прилагая диаметром 3 мм газовую линию в аквариум барботер и началом добавления комнатного воздуха в воде до концентрациикислорода в воде не приводит к увеличению или изменения в течение 3 мин.
  11. После того, как в состоянии равновесия, остановить бурлит и распечатывания колбу.

4. Stonefly Push-эксперимент

  1. Следует разделить общее количество веснянок по количеству наблюдателей, чтобы определить количество испытаний, чтобы выполнить.
  2. Определить различные уровни DO между 2 и 10 мг / л, чтобы оценить поведенческие реакции веснянки (количество отжимания).
  3. Установить одну колбу в испытание и добавить равное количество веснянки, поскольку есть наблюдатели в колбу (4 веснянки в этой конструкции), поместите зонд и трубку обратно в колбу, затем запечатайте колбу с резиновой пробкой.
    Примечание: начальная DO концентрации 10 мг / л был выбран в качестве первой точки наблюдения, так как она была концентрация DO потока, откуда были семплируется веснянками.
  4. После того, как вода в количестве 10 мг / л путем барботирования следующие шаги 2.10-2.11, регистрируют температуру исходного воды и даютвеснянки прикрепить к каменной подложке в колбе.
  5. Назначают только один наблюдатель, чтобы наблюдать одну Stonefly для обеспечения точного подсчета пуш-ап поведения, который является вверх и вниз, движение тела выставлены на веснянок.
  6. Граф и записывать количество отжиманий, наблюдаемых в течение периода наблюдения 3 мин.
  7. Манипулирование DO к следующему экспериментальном уровне DO и повторить 3 мин период наблюдения для дополнительных экспериментальных уровней.
    Примечание: В рамках этого эксперимента, три различных уровня DO были оценены.

5. Статистический анализ

  1. Для того, чтобы выполнить статистический анализ использования среднее число отжиманий через четыре веснянки через группу для данного DO суда.
  2. Используйте свободное R статистическое программное обеспечение вычислительной 12 для выполнения анализа отклонений (ANOVA) от количества отжиманий и концентрации DO , используя порядок каждого экспериментального исследования (DO уровень) и температуры , как соуariates. Исследуемый DO как дискретные уровни одного фактора.
  3. Используйте тест нормальности Андерсона-Дарлинга на невязок для проверки на нормальность 13.
  4. Выполните линейной регрессии по данным, откладывая среднее число отжиманий от концентрации DO.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Шесть испытания описанной установки были выполнены 24 первокурсников студентов в учебно лабораторных условиях для количественного определения количества отжиманий веснянки выполнение в ответ на различные концентрации DO в воде. Среднее количество отжиманий осуществляется в пределах уровня DO и в каждом испытании объединяли для построения отжимания от уровня DO на рисунке 2. ANOVA проводили сначала с использованием концентрации DO, последовательный порядок испытаний...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Критические шаги
Эта процедура обеспечивает простой и эффективный способ управления DO в лабораторных условиях для выполнения поведенческих исследований на водные организмы. Мы нашли там быть несколько критических шагов / пунктов, чтобы быть в курсе при выполнении этого эксперимента, который непосредственно связаны с результатами. В рамках судебного процесса, он имеет решающее значение для поддержания давления в камере, чтобы избежать изменений в парциального давления газов над водой, и последующее DO колебания. ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы прежде всего хотели бы выразить признательность всем студентам из лаборатории первого курса "Биология 121- Экология" в колледже Джуниата за их помощь в сборе данных, использованных в этом исследовании. Мы также хотели бы поблагодарить доктора Рэнди Беннетта, Криса Уоллса, Шерри Айзенберг и Тейлора Кокса за их помощь в приобретении материалов, необходимых для разработки этой методологии. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить доктора Норриса Мута и доктора Джона Унгера за их советы по разработке методологии, а также доктора Джилл Кини и биологический факультет за их поддержку в этом начинании. И последнее, но не менее важное: я хотел бы поблагодарить Хадсона Гранта за его помощь в создании первоначальной коллекции каменных мух для использования в разработке этой техники

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фильтрующая колба 2 лPyrex5340
Резиновая пробка размер 6Sigma-AldrichZ164534
Nalgene 180 Прозрачная пластиковая трубкаThermo Scienfitic8001-1216
Whisper 60 воздушный насосTetra
Standard гибкая воздушная трубкаPenn PlaxST25
0,25 дюйма Медная трубкаLowes Home Improvement23050
Мужской шлангБарб Grainger5LWH1
Внутренний соединительGrainger20YZ22
Сверхмощный измеритель растворенного кислородаExtech407510
Газообразный азотMatheson TRIGAS
Radnor AF150-580 РегуляторAirgasRAD64003036

Ссылки

  1. Hoback, W., Stanley, D. Insects in hypoxia. J. Insect Physiol. 47 (6), 533-542 (2001).
  2. Craig, J., Crowder, L. Hypoxia-induced habitat shifts and energetic consequences in Atlantic croaker and brown shrimp on the Gulf of Mexico shelf. Mar Ecol-Prog Ser. 294, 79-94 (2005).
  3. Gaulke, G., Wolfe, J., Bradley, D., Moskus, P., Wahl, D., Suski, C. Behavioral and Physiological Responses of Largemouth Bass to Rain-Induced Reductions in Dissolved Oxygen in an Urban System. T Am Fish Soc. 144 (5), 927-941 (2015).
  4. Genkai-Kato, M., Nozaki, K., Mitsuhashi, H., Kohmatsu, Y., Miyasaka, H., Nakanishi, M. Push-up response of stonefly larvae in low-oxygen conditions. Ecol Res. 15 (2), 175-179 (2000).
  5. McCafferty, W. Aquatic Entomology: The Fishermen's and Ecologists' Illustrated Guide to Insects and Their Relatives. , Jones and Bartlett. (1983).
  6. Chapman, L., Schneider, K., Apodaca, C., Chapman, C. Respiratory ecology of macroinvertebrates in a swamp-river system of east Africa. Biotropica. 36 (4), 572-585 (2004).
  7. Suski, C., Killen, S., Kieffer, J., Tufts, B. The influence of environmental temperature and oxygen concentration on the recovery of largemouth bass from exercise implications for live - release angling tournaments. J Fish Biol. 68, 120-136 (2006).
  8. Abdallah, S., Thomas, B., Jonz, M. Aquatic surface respiration and swimming behaviour in adult and developing zebrafish exposed to hypoxia. J Exp Biol. 218 (11), 1777-1786 (2015).
  9. Ciba Geigy Ag. Method and apparatus for degassing viscous liquids and removing gas bubbles suspended therein. US patent. , 3,853,500 (1974).
  10. Hewlett-Packard Company. Apparatus for degassing liquids. US patent. , 6,258,154 (2001).
  11. Sims, C., Gerner, Y., Hamberg, K. Systec inc.,. Vacuum degassing. US patent. , 6494938 (2002).
  12. Barbour, M., Gerritsen, J., Snyder, B., Stribling, J. Report number EPA 841-B-99-002. Rapid bioassessment protocols for use in streams and wadeable rivers. , USEPA. Washington. (1999).
  13. Anderson, T., Darling, D. A Test of Goodness of Fit. J Am Stat Assoc. 49 (268), 765-769 (1954).
  14. Rounds, S., Wilde, F., Ritz, G. Chapter A6 Field Measurements. Section 6.2 DISSOLVED OXYGEN. National Field Manual for the Collection of Water-Quality Data. , U.S. Geological Survery. Virginia, U.S. (2013).
  15. Hem, J. Study and Interpretation of the Chemical Characteristics of Natural. , U.S. Geological Survery. (1985).
  16. Burggren, W. 34;Air Gulping" Improves Blood Oxygen Transport during Aquatic Hypoxia in the Goldfish Carassius auratus. Physiol Zool. 55 (4), 327-334 (2015).
  17. Frederic, H., Mathieu, J., Garlin, D., Freminet, A. Behavioral, Ventilatory, and Metabolic Responses to Severe Hypoxia and Subsequent Recovery of the Hypogean Niphargus rhenorhodanensis and the Epigean Gammarus fossarum (Crustacea: Amphipoda). Physiol Zool. 68 (2), 223-244 (2015).
  18. Ultsch, G., Duke, J. Gas Exchange and Habitat Selection in the Aquatic Salamanders Necturus maculosus and Cryptobranchus alleganiensis. Oecologia. 83 (2), 250-258 (1990).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи