Мы описываем здесь систему, использующую сайт-специфичный, обратимый белковый блок in vivo для остановки и коллапса репликационных вилок у Escherichia coli. Создание репликационного блока оценивается с помощью флуоресцентной микроскопии, а для визуализации репликационных промежуточных продуктов используется нейтрально-нейтральный 2-мерный электрофорез в агарозном геле.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Индуцирование сайта Конкретная репликации засорение
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Препятствия, присутствующие на ДНК, в том числе плотно связанных белков и различных повреждений, может серьезно тормозят прогрессирование аппарата репликации клетки. Глохнет из replisome может привести к его диссоциации из хромосомы, либо частично или полностью, что приводит к коллапсу репликативной вилки. Восстановление после этого краха является необходимостью для клетки точно полное дублирование хромосомные и впоследствии разделить. Поэтому, когда происходит коллапс, клетка эволюционировала различные механизмы, которые имеют место, чтобы восстановить вилы ДНК и позволяют репликации должна быть завершена с высокой точностью. Ранее эти ремонтные репликации путей у бактерий были изучены с использованием УФ-повреждения, который имеет тот недостаток, что не локализованы в известном месте. Эта рукопись описывает систему с использованием системы флуоресценция репрессора оператора (FROS), чтобы создать сайт-специфический блок белка, который может вызвать пробуксовки и коллапс репликации FoRKS в кишечной палочки. Протоколы подробно рассматривается, как состояние репликации могут быть визуализированы в одиночных живых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии и репликации ДНК промежуточных соединений могут быть проанализированы с помощью 2-мерного электрофореза в агарозном геле. Чувствительные к температуре мутанты replisome компонентов (например , DnaBts) могут быть включены в систему , чтобы вызвать синхронное коллапс вилок репликации. Кроме того, роль рекомбинации белков и геликаз, которые участвуют в этих процессах могут быть изучены с использованием генетических нокаутов в рамках этой системы.
Введение
Во время репликации ДНК, то replisome сталкивается с препятствиями на ДНК, которые нарушают ее прогрессирование. Повреждение ДНК , включая поражений и пробелов, а также аномальным структуры могут помешать replisome от 1 продолжить. В последнее время было обнаружено , что белки , которые связываются с ДНК , являются наиболее распространенным источником препятствий для репликации вилки прогрессии 2. Знание событий после столкновение с replisome с нуклеопротеидной блока ранее было ограничено неспособностью вызвать такой блок в хромосоме живой клетки в известном месте. В пробирке анализ углубили наше понимание кинетического поведения активн....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Блокирование репликации с FROS
- Индуцируя репликации закупорки
- Разведите свежий ночной культуры в Е. штамм E.coli , несущий массив Teto и pKM1 от 18 до OD 600 нм = 0,01 в разбавленном комплексной среде (0,1% триптона, 0,05% дрожжевого экстракта, 0,1% NaCl, 0,17 М KH 2 PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4) с антибиотиками в соответствии с требованиями для выбора.
Примечание: Не добавляйте тетрациклин для выбора, как он не совместим с этой системой. Сделать объем культуры, эквивалентной 10 мл на образце требуется. Например, объем культуры для эксперимента на
- Разведите свежий ночной культуры в Е. штамм E.coli , несущий массив Teto и pKM1 от 18 до OD 600 нм = 0,01 в разбавленном комплексной среде (0,1% триптона, 0,05% дрожжевого экстракта, 0,1% NaCl, 0,17 М KH 2 PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4) с антибиотиками в соответствии с требованиями для выбора.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
FROS является индуцибельной, сайт-специфический нуклеопротеид блок , который позволяет промежуточные продукты репликации для визуализации в живых клетках 12,18. Общий план эксперимента для отбора клеток показана на рисунке 1. Сроки отбора проб и вариаций генетического фона делают это универсальная система для изучения ремонта такого блока. Схематически показано , как чувствительных к температуре мутанты, такие как dnaB TS и dnaC TS , которые .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Во время дупликации хромосом механизм репликации сталкивается с различными препятствиями, препятствующими его прохождению. Чтобы обеспечить репликацию всей хромосомы одного происхождения, бактерии имеют многочисленные пути репарации ДНК, которые затем позволяют перезагрузить репликосому20,21. Поражения, одноцепочечные разрывы, двухцепочечные разрывы и белки, тесно связанные с ДНК, могут быть устранены с помощью специального пути, хотя, вероятно, в этих путях будет значительное перекрытие. Наиболее распростране.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана Австралийским исследовательским советом [DP11010246].
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Триптон | Sigma-Aldrich | 16922 | Компонент питательной среды |
| Хлорид натрия | VWR | 27810.364 | Компонент питательной среды |
| Экстракт дрожжей | Sigma-Aldrich | 92144 | Компонент питательной среды |
| Одноосновной фосфат калия | Sigma-Aldrich | P9791 | Компонент питательной среды; Калийный буферный компонент |
| Двухосновной фосфат калия | Sigma-Aldrich | P3786 | Компонент питательной среды; Калийный буферный компонент |
| L-арабиноза | Sigma-Aldrich | A3256 | Для индукции производства TetR-YFP |
| Ангидротетрациклина гидрохлорид | Sigma-Aldrich | 37919 | Высвобождение репликационного блоакиджа |
| Axioskop 2 Флуоресцентный микроскоп | Zeiss | 452310 | Визуализация клеток |
| фильтра eYFP | Chroma Technology | 41028 | Визуализация YFP |
| CCD камеры | Hamamatsu | Orca-AG | Визуализация клеток |
| MetaMorph Программное обеспечение (Молекулярные приборы) | SDR Scientific | 31282 | Версия 7.8.0.0 использовано при подготовке данной рукописи |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | Для агарозных пробок и гелевого электрофореза |
| Original Glass Water Alarmlent (Rain-X) | Autobarn | DIO1470 | Для производства агарозных пробок |
| TRIS | VWR | VWRC103157P | TE, буферный компонент |
| TBEЭтилендиаминтетрауксусная кислота | Ajax Finechem | AJA180 | 0,5 М раствор динатриевой соли ЭДТА, отрегулированный до pH 8,0 с NaOH. |
| Азид натрия | Sigma-Aldrich | S2002 | Бактериостатический агент |
| Соляная кислота | Sigma-Aldrich | 258148 | TE буферный компонент |
| Дезоксихолат натрия | Sigma-Aldrich | D6750 | Буферный компонент лизиса клеток |
| N-Lauroylsarcosine Натриевая соль (Саркозил) | Sigma-Aldrich | L5125 | Лизис клеток и буферный компонент ESP |
| Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | Компонент буфера для лизиса клеток |
| Лизоцим | Amresco | 6300 | Буферный компонент для лизиса клеток |
| Протеиназа K | Amresco | AM0706 | Компонент буфера ESP |
| Субклетка Модель 192 Cell | BioRad | 1704507 | Система электрофореза |
| УФ-трансиллюминатор 2000 | BioRad | 1708110 | Визуализация ДНК |
| Бромид этидия | BioRad | 1610433 | Визуализация ДНК |
| Борная кислота | VWR | PROL20185.360 | TBE компонент |
| Hybond-XL нейлон Memrbane | Amersham | RPN203S | Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) также может быть использован |
| 3MM Whatman хроматографическая бумага | GE Healthcare Life Sciences | 3030690 | Southern blotting |
| HL-2000 Hybrilinker | УВП | 95-0031-01/02 | Сшивание ДНК и гибридизация |
| Дезоксирибонуклеиновая кислота из спермы лосося | Sigma-Aldrich | 31149 | Гибридизационный буферный компонент |
| Гидроксид натрия | Sigma-Aldrich | S5881 | Денатурационный буферный компонент |
| тринатрия цитрата дигидрат | VWR | PROL27833.363 | Трансферный буфер |
| Додецилсульфат натрия (SDS) | Amresco | 227 | Wash buffer component |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Гибридизационный буферный компонент |
| Random Hexamer Primers Bioline | BIO-38028 | ||
| Klenow fragment | New England BioLabs | M0212L | |
| dNTP Set | Bioline | BIO-39025 | |
| Аденозин 5'-трифосфат-< sup>32P-ATP | PerkinElmer | BLU502A | |
| Хранение Люминофорный экран | GE Здравоохранение Медико-биологические науки | GEHE28-9564-76 | BAS-IP MS 3543 E многоцелевой стандартный экран 35 см x 43 см |
| Typhoon FLA 7000 | GE Здравоохранение Медико-биологические науки | 28-9558-09 | Визуализация блота |
| Гибридизационный флакон | UVP | 07-0194-02 | 35 мм x 300 мм |
Ссылки
- Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. Replication fork stalling at natural impediments. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (1), 13-35 (2007).
- Gupta, M. K., et al. Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Больше статей
Система флуоресцентного репрессора-операторарепликационная вилка Escherichia coliвизуализация методом флуоресцентной микроскопиидвумерный гель-электрофорезтемпературно-чувствительные мутантыанализ генетического нокаутаинтермедиаты репликации ДНКприготовление агарозных плаговдетекция методом Саузерн-гибридизации
