Method Article

Индуцирование сайта Конкретная репликации засорение E. палочки Использование системы Люминесцентные репрессора оператора

DOI:

10.3791/54434

⸱

August 21st, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем здесь систему, использующую сайт-специфичный, обратимый белковый блок in vivo для остановки и коллапса репликационных вилок у Escherichia coli. Создание репликационного блока оценивается с помощью флуоресцентной микроскопии, а для визуализации репликационных промежуточных продуктов используется нейтрально-нейтральный 2-мерный электрофорез в агарозном геле.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Препятствия, присутствующие на ДНК, в том числе плотно связанных белков и различных повреждений, может серьезно тормозят прогрессирование аппарата репликации клетки. Глохнет из replisome может привести к его диссоциации из хромосомы, либо частично или полностью, что приводит к коллапсу репликативной вилки. Восстановление после этого краха является необходимостью для клетки точно полное дублирование хромосомные и впоследствии разделить. Поэтому, когда происходит коллапс, клетка эволюционировала различные механизмы, которые имеют место, чтобы восстановить вилы ДНК и позволяют репликации должна быть завершена с высокой точностью. Ранее эти ремонтные репликации путей у бактерий были изучены с использованием УФ-повреждения, который имеет тот недостаток, что не локализованы в известном месте. Эта рукопись описывает систему с использованием системы флуоресценция репрессора оператора (FROS), чтобы создать сайт-специфический блок белка, который может вызвать пробуксовки и коллапс репликации FoRKS в кишечной палочки. Протоколы подробно рассматривается, как состояние репликации могут быть визуализированы в одиночных живых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии и репликации ДНК промежуточных соединений могут быть проанализированы с помощью 2-мерного электрофореза в агарозном геле. Чувствительные к температуре мутанты replisome компонентов (например , DnaBts) могут быть включены в систему , чтобы вызвать синхронное коллапс вилок репликации. Кроме того, роль рекомбинации белков и геликаз, которые участвуют в этих процессах могут быть изучены с использованием генетических нокаутов в рамках этой системы.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Во время репликации ДНК, то replisome сталкивается с препятствиями на ДНК, которые нарушают ее прогрессирование. Повреждение ДНК , включая поражений и пробелов, а также аномальным структуры могут помешать replisome от 1 продолжить. В последнее время было обнаружено , что белки , которые связываются с ДНК , являются наиболее распространенным источником препятствий для репликации вилки прогрессии 2. Знание событий после столкновение с replisome с нуклеопротеидной блока ранее было ограничено неспособностью вызвать такой блок в хромосоме живой клетки в известном месте. В пробирке анализ углубили наше понимание кинетического поведения активного replisome , когда он встречает нуклеопротеидную засорение 3, а также механистические детали самого 4,5 replisome. Современное понимание ремонта репликации , как правило , проводится с УФ в качестве повреждающего агента и исследовали с использованием плазмидной ДНК в естественных условиях 6-8 . В то время как белки , которые могут быть вовлечены в восстановление ДНК после того, как он встречает нуклеопротеидную блок в естественных условиях , как правило , понятны из этих исследований, есть ли различия в молекулярных событий в пределах ремонтных путей вследствие отчетливой причины в блоке репликации до сих пор еще быть определенным.

Здесь мы описываем систему, которая позволяет нуклеопротеид блок, который будет создан в определенном месте хромосомы с использованием системы Fluorescent репрессора оператора (FROS). Мы используем штамм E. палочка, которая была массив 240 сайтов Teto включенных в хромосоме 9. Каждый сайт Teto в массиве имеет 10 п.н. случайную последовательность фланкирующей это повышение устойчивости массива путем предотвращения RecA-опосредованной рекомбинации в пределах массива. Этот массив, и вариации этого, первоначально использовались , чтобы понять , E. динамика 10,11 палочки хромосом , но затем были адаптированы к Превент в естественных условиях репликации 12. Массив было установлено, стабильно поддерживаться и блокировать близка к 100% вилок репликации при связывании тетр 10,12. Использование подобного массива Laco в пробирке нашел всего лишь 22 сайта было достаточно , чтобы блокировать 90% репликации, хотя этот короткий массив был менее эффективен в естественных условиях 13. Для того, чтобы адаптировать массив для создания нуклеопротеидную засорение, белок репрессор должен быть сильно избыточном в оптимальных условиях, где она затем связывается с массива для создания контрольно-пропускной пункт. Формирование закупорки, и его последующее высвобождение, можно контролировать путем использования флуоресцентной микроскопии, если флуоресцентно меченый вариант репрессора Tet используется. Статус репликации в каждой ячейке указывается числом очагов видно, где один координационный центр означает только одна копия массива присутствует в клетке и множественные фокусы свидетельствуют о активной репликации. Это активное повторноепликация включается, когда нуклеопротеид закупорка восстанавливается добавлением безвозмездное индуктора, что уменьшает сродство связывания тетр для сайта оператора достаточно для replisome пройти через массив. Белок-репрессор по-прежнему способен связываться с ДНК с достаточно высоким сродством, которые могут быть визуализированы в настоящее множественные копии массива.

Более сложные детали событий на нуклеопротеидной закупорки могут быть обнаружены с помощью нейтрально-нейтрального двумерную электрофореза в агарозном геле и гибридизацию 14-16. Эти методы позволяют анализировать структуры ДНК по всей популяции. Промежуточные репликации, которые образуются в ходе мероприятия, и потенциально остаются неотремонтированный, могут быть визуализированы. Изменяя фермента рестрикции и зонд разведения, промежуточные продукты могут быть визуализированы не только в области массива , но и выше по потоку от массива , когда вилка репликации регрессирует 17,18.регрессия происходит вслед за replisome диссоциации; ведущие и отстающие зарождающиеся нити отдельно от нитей шаблонов и отжигу друг с другом в виде нитей шаблона по совместительству повторной отжигу, что приводит к структуре ДНК четырех направлениях (а Holliday соединения).

С помощью этой системы было показано , что вилка репликации не является стабильным , когда он сталкивается с этим блок 18. Кроме того, чувствительные к температуре производные компонентов replisome могут быть использованы для предотвращения перегрузки репликативной вилки, как только она разрушилась. После того, как блок устанавливается, штамм может быть перенесен на непермиссивной температуры, чтобы обеспечить синхронное дезактивацию replisome и контролируемую предотвращение перезарядки. Эта температура индуцированной деактивация обеспечивает все вилами в популяции рухнули в данный момент времени и позволяет оценить то, что происходит, когда replisome рушится, как обрабатывается ДНК, и что требуется повторноначать процесс репликации ДНК.

Преимущество системы, описанной здесь, является то, что блок нуклеопротеид полностью обратимо; Таким образом, способность клеток восстанавливать из блока нуклеопротеидной способен следовать. Добавление anhydrotetracycline к клеткам разгрузит прочное связывание репрессора, что позволяет развилка репликации и пройти через клетку, чтобы восстановить жизнеспособность. Рельеф закупорки может быть визуализированы с помощью нейтрально-нейтрального двумерного электрофореза в агарозном геле после 5 мин, и с помощью микроскопии в течение 10 мин. Кроме того, анализ жизнеспособности может выявить способность штамма восстановиться после закупорки репликации и продолжают размножаться.

Путем изменения генетического фона штаммов, используемых в экспериментальной методике, описанной здесь, ремонт пути для этого типа закупорки может быть выяснена.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Блокирование репликации с FROS

  1. Индуцируя репликации закупорки
    1. Разведите свежий ночной культуры в Е. штамм E.coli , несущий массив Teto и pKM1 от 18 до OD 600 нм = 0,01 в разбавленном комплексной среде (0,1% триптона, 0,05% дрожжевого экстракта, 0,1% NaCl, 0,17 М KH 2 PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4) с антибиотиками в соответствии с требованиями для выбора.
      Примечание: Не добавляйте тетрациклин для выбора, как он не совместим с этой системой. Сделать объем культуры, эквивалентной 10 мл на образце требуется. Например, объем культуры для эксперимента на рисунке 1, 60 мл.
    2. Grow при температуре 30 ° C при встряхивании до OD 600 нм = 0,05-0,1. Удалить образец 10 мл, чтобы служить в качестве неиндуцированном управления, и добавьте 0,1% арабинозы к оставшейся культуре, чтобы индуцировать образование TetR-YFP от pKM1. Продолжайте расти как неиндуцированном и индуцированныекультуры. Через 1 ч проверяют наличие единого координационного центра в каждой клетке индуцированной культуры с помощью флуоресцентной микроскопии (см раздел 2).
    3. Если индуцированные клетки подтвердятся заблокированы (более 70% клеток имеют один фокус), запись OD 600нм и взять 7,5 мл образца для анализа с помощью 2-D гелей (смотри раздел 3). Возьмем эквивалентную выборку из неиндуцированном контрольной культуры.
  2. Высвобождение репликации закупорки
    1. Чтобы освободить блок репликации, добавьте 100 нг мл -1 безвозмездным индуктором anhydrotetracycline (AT) к 10 мл образца блокированных клеток. Продолжать расти при 30 ° С в течение 10 мин и берут образцы для плотности клеток (1 мл), микроскопический анализ (10 мкл) и нейтрально-нейтральных 2-мерных гелей агарозы (7,5 мл).
  3. Наводить Крах Replisome
    1. Если клетки содержат чувствительный к температуре аллель , такие как dnaB TS или dnaC TS , которая требует deactivaции, перемещать колбу, содержащую блокированные клетки до 42 ° С. Отбирают образцы для анализа в моменты времени , необходимых (например, 1 час после инкубации). После того , как клетки инкубировали при 42 ° С в течение 1 ч, смещения клеток до 30 ° С в течение 10 мин (см рисунок 1).
      Примечание: Клетки могут быть сдвинуты на 30 ° C для анализа повторного запуска.

figure-protocol-1
Рисунок 1:. Обзор FROS репликации Блок и выпуска экспериментальной процедуры Е. палочки штаммов , несущих массив Teto выращивают при 30 ° С. Когда клетки достигают OD 600 нм из выше 0,05, производство TetR-YFP индуцируют арабинозы (АРА; 0,1%). Продолжать расти субпопуляции клеток неиндуцированных действовать в качестве контрольных при 30 ° C. Образец индуцированных клеток анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии через 1 - 2 ч (см 2.1). Если репликацияподтвердил быть заблокированы, отбирают образцы для анализа 2-D гель, обозначенном пробирках (см 3.1) и жизнеспособность испытаний (по желанию). Закупорка репликации можно удалить с помощью anhydrotetracycline (AT; 0,1 мкг / мл) и клетки анализировали через 10 мин. Если клетки несут чувствительный к температуре аллель (например , dnaB Т.С.), это может быть инактивирован путем сдвига блокированных клеток до 42 ° C для соответствующего анализа. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

2. флуоресцентной микроскопией

  1. Подготовить агарозном площадку с помощью пипетки 500 мкл расплавленной агарозы (1% в воде) на предметное стекло микроскопа; наложение покровное непосредственно перед агарозном затвердевает. Храните слайд (ы) во влажных тканях при 4 ° С до тех пор, пока это необходимо.
  2. Когда агароза затвердеет, удалить покровное из агарозного площадки и пипеткой 10 мкл бактериальнойкультуры на центр площадки для предотвращения перемещения клеток во время визуализации. После того, как образец сушат (примерно 5 мин), замените покровное. Поместите каплю иммерсионного масла на покровным и поместите слайд под оптикой.
  3. Визуализация клеток с использованием фазовой микроскопии при 100х.
    1. В диалоговом окне Приобретать в программном обеспечении формирования изображения, установить время экспозиции до 100 мс. Захват изображения, выбрав Acquire. Не перемещайте стадию. В диалоговом окне Acquire, выберите YFP ​​в качестве подсветки для внешнего затвора Связанный с камерой. Установите время exporsure до 1000 мс. Выключите свет этапа. Захват флуоресценции изображение путем выбора Acquire.
      Примечание: Время может варьироваться в зависимости от источника света, микроскопа и фотокамеры.
    2. Наложение фазы и флуоресцентные изображения, выберите цвет зерноуборочный из меню Display. В диалоговом окне Color зерноуборочный, выберите изображение YFP ​​в качестве зеленого компонента и фазы изображения в качестве блуе компонент. Нажмите на цвет комбайна. Определить, является ли население было репликации успешно блокирована путем установления того, большинство клеток имеют один фокус на клетку.
      Примечание: Сравнение с образцом от контроля без добавления арабинозы полезно визуально определить разницу в производстве EYFP.

3. ДНК-экстракции / агарозы Заглушки

  1. Добавить азид натрия (конечная концентрация 0,1%) в 7,5 мл Образцы культур из этапов 1.1.3 и 1.2.1. Инкубируют на льду в течение не менее 5 мин.
    Примечание: азид натрия является чрезвычайно токсичным. Обратитесь к паспорту безопасности перед началом работ и не справиться с этим, пока все меры безопасности не были прочитаны и поняты.
  2. Центрифуга ячеек 5000 мкг в течение 10 мин для осаждения клеток. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют таблетку в 200 мкл Петт IV (PIV) буфере (10 мМ Трис HCl (рН 8,0), 1 М NaCl). Микроцентрифуга (13, 000 мкг в течение 2 мин), чтобы осадить клетки. диSCard супернатант. На этом этапе процесса гранулы далее или хранить при температуре -20 ° C.
  3. Ресуспендируют клеток с низкой плотностью клеток в 50 мкл PIV и место при 50 ° С. Для всех остальных образцов, регулировать объемы PIV поэтому конечная плотность клеток одинакова в каждой трубке (например , образец 1 (OD 600нм = 0,128) ресуспендировали в 50 мкл; Образец 2 (OD 600нм = 0,138) ресуспендировали в 54 мкл).
    1. Добавить равный объем свежеприготовленного 0,8% -ного раствора агарозы в PIV (конечная концентрация 0,4%;. , Например , образец 1 50 мкл, образца 2 54 мкл). Убедитесь, что образцы, агарозы и PIV выше 50 ° C, чтобы предотвратить затвердевание.
  4. Рассматривать стекло микроскопа с 40 мкл соответствующего стекла водоотталкивающий или силиконовым раствором. Натрите слайд с тканью, пока она не высохнет.
    Примечание: Это может быть сделано заблаговременно, и обработанные слайды хранили длительный срок при комнатной температуре.
  5. Поместите 20 мкл капли тон сота / агарозы суспензию на слайде для производства пробки, которые являются полусферической.
    Примечание: Первый образец (ресуспендировали в 50 мкл PIV) будет производить 5 пробки на одном слайде.
  6. Когда пробки были затвердевает, скользят их осторожно в микроцентрифуге пробирку и добавляют 1 мл буфера для лизиса клеток (10 мМ Трис-HCl [pH 8], 1 М NaCl, 100 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 0,2% дезоксихолат натрия, 0,5% N-лауройлсарконине натриевая соль (саркозила), 100 мкг мл - 1 лизоцима, 50 мкг мл - 1 РНКазы А). Инкубируют при 37 ° С в течение 2 часов.
  7. Удалить буфер для лизиса клеток и добавить саркозил / протеиназы K (ESP) раствор 1 мл ЭДТА / (0,5 М ЭДТА, 1% N-лауройлсарконине натриевая соль (саркозила), 1 мг мл - 1 протеиназы K). Инкубировать при 50 ° С в течение ночи или до пробки являются прозрачными. Если требуется второй инкубации в течение ночи, замените раствор ESP с помощью свежего буфера после приблизительно 18 часов.
  8. УдалитьESP буфер и промыть Заглушки 5 раз с помощью 12 мл Трис-ЭДТА (ТЕ) буфера (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0), что позволяет 30 мин уравновешивания с каждой промывке. Хранить при температуре 4 ° С в 1 мл ТЕ-буфера.

4. Нейтральный нейтральный 2-Dimensional гель электрофорез

  1. Передача агарозы вилку из шага 3.8 в свежую пробирку и микроцентрифуге добавляют 150 мкл рестриктазы буфера (1x концентрации). Добавить 25-100 единиц фермента рестрикции (например, 60 единиц EcoRV (смотри рисунок 3A)). Дайджест при 37 ° С в течение 6-8 ч.
  2. При температуре 4 ° С, заливают 0,4% агарозном геле (300 мл) в 1X Трис / борат / ЭДТА (КЭ) в гель лоток примерно 25 х 25 см. Вставьте расческу, чтобы сделать лунки приблизительно такой же ширины, как и диаметр плунжера. Когда гель установлен, удалите гребень и переместить гель до комнатной температуры.
  3. Вставьте один из переваренной агарозных пробок в скважину, позиционирование плоский слайд штекера против стороны скважины, где тон ДНК будет проникать в гель. Вставить одну пробку таким же образом, в каждый второй скважины.
  4. Пипетировать расплавленной 0,4% агарозы в лунки для уплотнения пробки в заданном положении.
  5. Нагрузка 1 кб ДНК лестницы в пустой колодец, снова оставляя зазор между лестницей и образцов, и запустить гель в течение ночи (16 ч, 55 V) в 1x КЭ при комнатной температуре.
  6. Пятно гель в водяной бане , содержащей бромид этидия (0,3 мкг мл - 1) в течение 20 мин.
    Примечание: этидий бромид считается мощным мутагенным и токсин. Обратитесь к паспорту безопасности перед началом работ и не справиться с этим, пока все меры безопасности не были прочитаны и поняты.
  7. Визуализируйте ДНК, с помощью УФ-просвечивания длинноволновой и вырезать каждый фрагмент полосы движения с прямой, даже вырезать, сводя к минимуму включение избыточного агарозы по обе стороны от полосы.
    Примечание: Например, если фрагмент интереса 5,5 т.п.н., вырезать фрагмент длиной 7,5 см, чтобы включать ДНК-фрагментов от 5 кб в approximatEly 12 кб (смотри рисунок 3А).
  8. Поместите вырезанную полосу геля в лотке геля под углом 90 ° по отношению к направлению миграции ДНК.
    Примечание: Два ряда 3 фрагментов геля может поместиться в лотке геля 25 х 25 см 2. Первый ряд гелевых полос находится в верхней части лотка, второй ряд на 12,5 см.
  9. Подготовьте 300 мл агарозы для второго измерения геля (0,9% в 1x КЭ с 0,3 мкг мл -1 этидий бромид). Когда агарозы охлаждают до 50 ° С, пипеткой расплавленной агарозы вокруг ломтиков геля, чтобы укрепить свою позицию. Налить оставшиеся агарозы в лоток на глубину, которая по меньшей мере на одном уровне с кусочками геля.
  10. После того , как гель затвердевает, electrophorese при 4 ° С в 1X TBE , содержащего 0,3 мкг мл -1 этидийбромид при 220 В до тех пор , пока ДНК мигрировал приблизительно 10 см.
    Примечание: 4 ч достаточно для фрагмента 5,5 кб, но меньший фрагмент потребуется меньше времени.
  11. Иссечь блоки, где геномная ДНК присутствует Uпеть край металлической линейки, в том числе гель над ним , чтобы включать ДНК, которая не видна (рис 3C).

5. Южная Гибридизация

  1. Приготовление раствора
    1. Подготовьте депуринизации буфер (0,125 М раствора HCl).
      Примечание: Этот буфер может быть использован повторно и стабилен при комнатной температуре в течение до 1 месяца.
    2. Подготовка денатурации буфера (1,5 М NaCl, 0,5 М NaOH).
      Примечание: Денатурация буфер может быть использован повторно один раз и стабилен в течение до 3-х месяцев при комнатной температуре.
    3. Подготовка нейтрализационного буфера (1,5 М NaCl, 0,5 М Трис). Доведения рН до 7,5 с помощью HCl.
      Примечание: Нейтрализация буфер может быть использован повторно один раз и стабилен в течение до 3-х месяцев при комнатной температуре.
    4. Приготовьте 10x Солевой цитрата натрия (SSC) буфере (0,15 М цитрат Tri-натрия, 1,5 М NaCl, рН 7 - 8) для использования на этапах 5.2.4 и 5.2.6. Из этого буфера, сделайте 2 x SSC запас (для использования на этапе 5.2.9).
      Примечание: 10x SSC и 2x SSCповторно стабилен при комнатной температуре в течение 3-х месяцев.
    5. Готовят Modified Church и Gilbert буфера гибридизации 19 (0,5 М фосфатном буфере [рН 7,2], 7% (вес / объем) додецилсульфата натрия (SDS), 10 мМ ЭДТА). Оставьте при температуре 65 ° C, чтобы растворить тщательно перед использованием.
  2. Перевод
    1. Промыть Иссеченную гель блоков в депуринизации растворе в течение 10 мин при комнатной температуре на качалке или орбитальном шейкере. Держите скорость перемешивания низкой, чтобы избежать повреждения агарозном блоков.
    2. Промыть гелевые блоки кратко дистиллированной водой, а затем с буфером денатурации в течение 30 мин. Промыть еще раз на короткое время в дистиллированной воде, а затем инкубировать гель блоков в нейтрализации буфера в течение 30 мин при осторожном перемешивании при комнатной температуре.
    3. Обрежьте нейлоновую мембрану к точному размеру геля (ов). Вырезать ник в правом верхнем углу, чтобы помочь в ориентировании мембрану в будущих шагов.
      Примечание: Два гелевых блоков (6 образцов) могут быть визуализированы на одной мембране.
    4. Налейте достаточно 10x SSC в трау, так что она не будет высыхать на ночь. Создание платформы примерно 5 см над уровнем буфера. Пропитайте 3 листов хроматографической бумаги 3MM с 10х SSC и место на платформе. Обрежьте бумагу для хроматографии таким образом, чтобы она достаточно долго, чтобы быть погружен в буфер на обоих концах, и достаточно широкий, чтобы соответствовать гель мембраны на.
    5. Поместите гель (ы) на верхней части насыщенной бумажной хроматографии. Рама гель с полиэтиленовой пленкой, чтобы предотвратить буфер минуя гель во время передачи данных. Осторожно уложить отрезанный мембрану поверх геля (ов). Удаления пузырьков воздуха между мембраной и гель прокаткой бутылку или серологического пипетку осторожно через мембрану.
    6. Вырезать три листа хроматографической бумаги 3 мм до того же размера, что и мембраны. Насытить хроматографии бумажные листы с 10x SSC и размещать на верхней стороне мембраны. Удалите любые воздушные пузырьки, которые сформировались.
    7. Стек бумажные полотенца не менее 5 см на верхней части промокательной бумаги с последующей твердой подложкой (соответствуюximate вес 1 кг для 23 х 16 см мембрану). Разрешить перенос действовать в течение ночи.
    8. Проэкспонируйте мембраны (ДНК стороной вверх) до 1200 Дж / ​​м 2 , УФ сшивать ДНК на мембране. Не смывать до этого шага.
    9. Промойте мембрану тщательно в 2х SSC, чтобы предотвратить высокий фон на Блот изображений. Используйте блот сразу для гибридизации (см 5.3) или высушить при комнатной температуре, завернуть в полиэтиленовую пленку и хранить при температуре 4 ° С.
  3. гибридизация
    1. Предварительно подогревают гибридизация печь и бутылки до 55 ° С.
    2. Добавить 100 мкг мл -1 бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 10 мкг мл -1 неспецифическую ДНК (например , ДНК спермы лосося) на предварительно нагретый буфере для гибридизации.
    3. Для того, чтобы обеспечить равномерное покрытие буфера гибридизации, когда мембрана свернут, поместите блот на аналогичных размеров квадрат нейлоновой сетки с ДНК-связанной стороне мембраны, обращенной вверх. Ролл-блот вдоль его длинного края. Горкаблот / сетка внутри бутылки гибридизация. Добавьте соответствующее количество буфера предварительно нагретой гибридизации раскатать блот (например , 30 мл для 23 х 16 см 2 мембраны).
    4. Выдержите в предварительно нагретую печь, вращая бутылки, в течение 1 часа.
    5. Подготовка зонда путем смешивания 50 нг очищенного гомологичной ПЦР - продукта в области , представляющей интерес, 150 нг случайных гексамере праймеров, буфер для фрагмента Кленова и H 2 O , чтобы сделать объем 13 мкл. Кипение в течение 3 минут, затем поместить сразу на лед. Добавляют 1 мкл 1 мМ дЦТФ / дГТФ / дТТФ смеси 1 мкл фрагмента Кленова (5U) и 50 мкКи дезоксиаденозина 5'-трифосфата , меченый на альфа - фосфатным (α 32 P-дАТФ).
    6. Инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляют 1 мкл 1 мМ дНТФ смешать и 1 мкл фрагмента Кленова. Инкубировать 20 мин при комнатной температуре.
    7. Кипение в зонд в течение 5 мин и добавляют непосредственно к гибридизации труб. Гибридизуются в течение ночи при 55 ° С, при вращении.
    8. Слейте прОБЕ из мембраны.
      Примечание: Зонд может быть повторно использован один раз.
    9. Промыть мембрану на короткое время в подогретого, низкая жесткость промывочного буфера (2 × SSC, 0,1% (вес / об) ДСН). Добавить свежий низкой жесткости промывочного буфера и инкубируют в течение 5 мин при 55 ° С с вращением. Повторение.
    10. Промыть два раза в средней жесткости промывочного буфера (1x SSC, 0,1% (вес / объем) SDS) в течение 10 мин при 55 ° С с вращением.
    11. Промыть два раза в высокой жесткости буфера для промывки (0.1x SSC, 0,1% (вес / объем) SDS) в течение 5 мин при 55 ° С с вращением.
    12. Удалите мембрану и мазок с тканью для удаления избытка жидкости. Заверните в полиэтиленовую пленку, обеспечивая там не осталось влаги на полиэтиленовую пленку и поместите в экспозиции кассету с предварительно гасится экран хранения люминофора. Закройте кассету и выставить в течение по крайней мере 2 ч перед визуализации с использованием люминофора томографа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FROS является индуцибельной, сайт-специфический нуклеопротеид блок , который позволяет промежуточные продукты репликации для визуализации в живых клетках 12,18. Общий план эксперимента для отбора клеток показана на рисунке 1. Сроки отбора проб и вариаций генетического фона делают это универсальная система для изучения ремонта такого блока. Схематически показано , как чувствительных к температуре мутанты, такие как dnaB TS и dnaC TS , которые ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Во время дупликации хромосом механизм репликации сталкивается с различными препятствиями, препятствующими его прохождению. Чтобы обеспечить репликацию всей хромосомы одного происхождения, бактерии имеют многочисленные пути репарации ДНК, которые затем позволяют перезагрузить репликосому20,21. Поражения, одноцепочечные разрывы, двухцепочечные разрывы и белки, тесно связанные с ДНК, могут быть устранены с помощью специального пути, хотя, вероятно, в этих путях будет значительное перекрытие. Наиболее распростране...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Австралийским исследовательским советом [DP11010246].

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ТриптонSigma-Aldrich16922Компонент питательной среды
Хлорид натрияVWR27810.364Компонент питательной среды
Экстракт дрожжейSigma-Aldrich92144Компонент питательной среды
Одноосновной фосфат калияSigma-AldrichP9791Компонент питательной среды; Калийный буферный компонент
Двухосновной фосфат калияSigma-AldrichP3786Компонент питательной среды; Калийный буферный компонент
L-арабинозаSigma-AldrichA3256Для индукции производства TetR-YFP
Ангидротетрациклина гидрохлоридSigma-Aldrich37919Высвобождение репликационного блоакиджа
Axioskop 2 Флуоресцентный микроскопZeiss452310Визуализация клеток
фильтра eYFPChroma Technology41028Визуализация YFP
CCD камерыHamamatsuOrca-AGВизуализация клеток
MetaMorph  Программное обеспечение (Молекулярные приборы)SDR Scientific31282Версия 7.8.0.0 использовано при подготовке данной рукописи
AgaroseBiolineBIO-41025Для агарозных пробок и гелевого электрофореза
Original Glass Water Alarmlent (Rain-X)AutobarnDIO1470Для производства агарозных пробок
TRISVWRVWRC103157PTE, буферный компонент
TBEЭтилендиаминтетрауксусная кислотаAjax FinechemAJA1800,5 М раствор динатриевой соли ЭДТА, отрегулированный до pH 8,0 с NaOH.
Азид натрияSigma-AldrichS2002Бактериостатический агент
Соляная кислотаSigma-Aldrich258148TE буферный компонент
Дезоксихолат натрияSigma-AldrichD6750Буферный компонент лизиса клеток
N-Lauroylsarcosine Натриевая соль (Саркозил)Sigma-AldrichL5125Лизис клеток и буферный компонент ESP
Rnase ASigma-AldrichR6513Компонент буфера для лизиса клеток
ЛизоцимAmresco6300Буферный компонент для лизиса клеток
Протеиназа KAmrescoAM0706Компонент буфера ESP
Субклетка Модель 192 CellBioRad1704507Система электрофореза
УФ-трансиллюминатор 2000BioRad1708110Визуализация ДНК
Бромид этидияBioRad1610433Визуализация ДНК
Борная кислотаVWRPROL20185.360TBE компонент
Hybond-XL нейлон MemrbaneAmershamRPN203SZeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) также может быть использован
3MM Whatman хроматографическая бумагаGE Healthcare Life Sciences3030690Southern blotting
HL-2000 HybrilinkerУВП95-0031-01/02Сшивание ДНК и гибридизация
Дезоксирибонуклеиновая кислота из спермы лососяSigma-Aldrich31149Гибридизационный буферный компонент
Гидроксид натрияSigma-AldrichS5881Денатурационный буферный компонент
тринатрия цитрата дигидратVWRPROL27833.363Трансферный буфер
Додецилсульфат натрия (SDS)Amresco227Wash buffer component
Bovine serum albuminSigma-AldrichA7906Гибридизационный буферный компонент
Random Hexamer Primers BiolineBIO-38028
Klenow fragmentNew England BioLabsM0212L
dNTP SetBiolineBIO-39025
Аденозин 5'-трифосфат-< sup>32P-ATPPerkinElmerBLU502A
Хранение Люминофорный экранGE Здравоохранение Медико-биологические наукиGEHE28-9564-76BAS-IP MS 3543 E многоцелевой стандартный экран 35 см x 43 см
Typhoon FLA 7000GE Здравоохранение Медико-биологические науки28-9558-09Визуализация блота
Гибридизационный флаконUVP07-0194-0235 мм x 300 мм

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. Replication fork stalling at natural impediments. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (1), 13-35 (2007).
  2. Gupta, M. K., et al. Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7252-7257 (2013).
  3. McGlynn, P., Guy, C. P. Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro. J Mol Biol. 381 (2), 249-255 (2008).
  4. Tanner, N. A., et al. Single-molecule studies of fork dynamics in Escherichia coli DNA replication. Nat Struct Mol Biol. 15 (2), 170-176 (2008).
  5. Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis. Nature. 457 (7227), 336-339 (2009).
  6. Rudolph, C. J., Upton, A. L., Lloyd, R. G. Replication fork stalling and cell cycle arrest in UV-irradiated Escherichia coli. Genes Dev. 21 (6), 668-681 (2007).
  7. Jeiranian, H. A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. Inefficient replication reduces RecA-mediated repair of UV-damaged plasmids introduced into competent Escherichia coli. Plasmid. 68 (2), 113-124 (2012).
  8. Le Masson, M., Baharoglu, Z., Michel, B. ruvA and ruvB mutants specifically impaired for replication fork reversal. Mol Microbiol. 70 (2), 537-548 (2008).
  9. Wang, X., Liu, X., Possoz, C., Sherratt, D. J. The two Escherichia coli chromosome arms locate to separate cell halves. Genes Dev. 20 (13), 1727-1731 (2006).
  10. Lau, I. F., et al. Spatial and temporal organization of replicating Escherichia coli chromosomes. Mol Microbiol. 49 (3), 731-743 (2003).
  11. Gordon, G. S., et al. Chromosome and low copy plasmid segregation in E. coli: visual evidence for distinct mechanisms. Cell. 90 (6), 1113-1121 (1997).
  12. Possoz, C., Filipe, S. R., Grainge, I., Sherratt, D. J. Tracking of controlled Escherichia coli replication fork stalling and restart at repressor-bound DNA in vivo. EMBO J. 25 (11), 2596-2604 (2006).
  13. Payne, B. T., et al. Replication fork blockage by transcription factor-DNA complexes in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 34 (18), 5194-5202 (2006).
  14. Brewer, B. J., Fangman, W. L. The localization of replication origins on ARS plasmids in S. cerevisiae. Cell. 51 (3), 463-471 (1987).
  15. Jeiranian, H. A., Schalow, B. J., Courcelle, J. Visualization of UV-induced replication intermediates in E. coli using two-dimensional agarose-gel analysis. J Vis Exp. (46), (2010).
  16. Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol. 98 (3), 503-517 (1975).
  17. Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA damage-induced replication fork regression and processing in Escherichia coli. Science. 299 (5609), 1064-1067 (2003).
  18. Mettrick, K. A., Grainge, I. Stability of blocked replication forks in vivo. Nucleic Acids Res. , (2015).
  19. Church, G. M., Gilbert, W. Genomic sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (7), 1991-1995 (1984).
  20. Michel, B., Grompone, G., Flores, M. J., Bidnenko, V. Multiple pathways process stalled replication forks. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12783-12788 (2004).
  21. Michel, B., Boubakri, H., Baharoglu, Z., LeMasson, M., Lestini, R. Recombination proteins and rescue of arrested replication forks. DNA Repair (Amst). 6 (7), 967-980 (2007).
  22. Carl, P. L. Escherichia coli mutants with temperature-sensitive synthesis of DNA. Mol Gen Genet. 109 (2), 107-122 (1970).
  23. Nawotka, K. A., Huberman, J. A. Two-dimensional gel electrophoretic method for mapping DNA replicons. Mol Cell Biol. 8 (4), 1408-1413 (1988).
  24. Cole, R. S., Levitan, D., Sinden, R. R. Removal of psoralen interstrand cross-links from DNA of Escherichia coli: mechanism and genetic control. J Mol Biol. 103 (1), 39-59 (1976).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence Repressor Operator SystemSite Specific Replication BlockageEscherichia coli Replication ForkFluorescence Microscopy VisualizationTwo Dimensional Gel ElectrophoresisTemperature Sensitive MutantsGenetic Knockout AnalysisDNA Replication IntermediatesAgarose Plug PreparationSouthern Hybridization Detection

Related Articles