Rapid Субтрактивный структурирование живых слоев клеток с микрожидком Probe

Краткое содержание

Мы представляем протокол для выполнения субтрактивного структурирования монослоев живых клеток на поверхности. Это достигается путем локального и селективного лизиса адгезивных клеток с помощью микрофлюидного зонда (МФУ). Лизат клеток, полученный из локальных областей, может быть использован для последующего анализа, что позволяет проводить исследования молекулярного профилирования.

Аннотация

Микрожидкостных зонд (МФУ) облегчает выполнение местной химии на биологических субстратов путем ограничения объемов nanoliter жидкостей. Использование одной конкретной реализации MFP, иерархического удержания гидродинамического потока (hHFC), различные жидкости одновременно приводят в контакт с подложкой. Местное химическое воздействие и жидкости формование с использованием hHFC, эксплуатируется для создания шаблонов ячеек локально лизировать и удаления клеток. Используя сканирующий способность MFP, определенные пользователем модели клеточных монослоев созданы. Этот протокол позволяет быстро, в режиме реального времени и пространственно-контролируемую клеток кучность, которые могут позволить исследования взаимодействия селективный межклеточных и клетка-матрица.

Введение

В своей родной среде, клетки в биологических тканях воспринимают ряд биохимических и физических репликами направляя их роста, организацию и развитие. Понимание этих реплик требует выборочное исследование межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействий. Это требует разработки методов формирования рисунка монослоев клеток. Методы геометрически отдельные различные типы клеток в культуре (структурирование) позволяют широкие исследования физико-химические сигналы в клеточной биологии. Большинство современных подходов к структурирование клеточных слоев ^{1 - 4} зависит от осаждения клеточной адгезии белков на поверхности или с использованием микроизготовленном трафареты для селективного выращивания на подложках. В противоположность этому , здесь мы представляем метод быстро монослоев образец клеток на месте, т.е. клетки в культуре, путем удаления клеток в отдельных регионах монослоя. Методы , которые выполняют такую ​​отнимающий структурирование ^{5 - 9} USUALLY требует специальных подложек, обработка поверхности, сложная операция, физический контакт или абляции с помощью лазера, непреднамеренно влияя на живые клетки. Мы здесь используем микрожидком зонд (MFP) ^10,11, бесконтактное сканирование микрожидкостных технологии, гидродинамически ограничиваю- жидкости на подложке. Одним из важных компонентов МФП является микроизготовленном головка , содержащая микроканалов (рисунок 1). Соответствующая платформа состоит из шприцевых насосов для жидкости управления, этапы для сканирования и управления инвертированный микроскоп для визуализации и обратной связи (рисунок 2). В базовой конфигурации, головка MFP состоит из двух микроканалов с отверстиями на вершине, один для впрыска жидкости для обработки , а другой для аспирационных впрыскивается обработки жидкости вместе с некоторой иммерсионной жидкостью (рис 3А). Во время работы устройства MFP апекс находится на фиксированном расстоянии от подложки. Когда скорость потока аспирации (Qa) является sufficiently выше , чем скорость впрыска потока (Q _I), т.е. Q: с Q _​​я ≥ 2,5, жидкая обработка ограничивается на подложке. Это приводит к камере гидродинамического потока (HFC). Область, в которой обработка жидкость находится в непосредственном контакте с подложкой, называется след. Для типичных условий эксплуатации, поток технологической жидкости в HFC характеризуется низким числом Рейнольдса (Re ≈ 10 ^-2) , а также ряд высоких Пекле (Пе ≈ 10 ^2). Это означает, потоки жидкости в ламинарном режиме с конвекцией является основным способом массового переноса химических соединений. Численные и аналитические модели для удержания потока описаны в другом месте ^{12 - 14.}

В данной работе мы используем подход одновременно удерживающих нескольких жидкостей для обработки, которая называется иерархическая HFC (hHFC) ^14. Для реализации hHFC с MFP, два additionaл отверстия необходимы для обеспечения дополнительного источника инъекции и аспирации. Это позволяет ограничивать одну жидкость внутри второй жидкости. Внутренние (обработка) жидкие выгоды от экранированы от постороннего мусора на подложке с помощью внешней (экранирования) жидкости. Кроме того, hHFC позволяет работать в двух режимах: (I) вложенная режим, в котором обработка жидкость во внутренних контактов HFC поверхности (фигура 3В), и (II) пережатых режим, в котором внутренняя жидкость теряет контакт и только внешняя жидкость находится в контакте с подложкой (рис 3C). Переключение между двумя режимами позволяет пользователям осуществлять или прекратить обработку подложки и достигается путем регулирования зазора головы до поверхности или путем изменения соотношения между потоками впрыска (Q _i2 / Q _i1). Для заданной геометрии канала, след технологической жидкости на подложке можно регулировать путем модуляции условий потока (рис 3D). гидр натрияОксид (NaOH), используется в качестве внутренней жидкости для обработки, чтобы лизировать клетки, и лизат непрерывно отсасывают с поверхности. Поскольку химические эффекты технологической жидкости локализуются на внутренней HFC след, соседние клетки остаются невозмущенной, что позволяет пространственно-временные исследования межклеточных взаимодействий. Функциональные возможности сканирования МФУ позволяет создавать определяемые пользователем геометрии образцов клеток (рисунок 4). Кроме того, выбор NaOH в качестве технологической жидкости вмещает вниз по течению анализ ДНК (рисунок 7).

Протокол

1. МФУ Голова и платформа для очистки и подготовки

Примечание: Этот протокол использует вертикально ориентированный кремний-стекло гибрид МФУ возглавляет ^15,16. Компонент кремния головки содержит микроканалы, которые вытравлены на глубину 100 мкм. Протравленная кремния связан со стеклом с помощью анодной сварки. Конструкция канала содержит рисунок , состоящий из шести каналов, два каждый для инъекций и аспирации, а также два для инжекции иммерсионной жидкости (рисунок 1). Каналы, используемые для инъекций иммерсионной жидкости пополнения среды, окружающей биологического образца, что позволит избежать потерь в результате аспирации и испарения. Внутренние каналы и внешние каналы, используемые в текущей работе 100 × 100 мкм и 200 × 100 мкм соответственно. Сообщение изготовление и обработка, МФУ головки с четкими каналами и полированных верхушек получаются.

1. Подготовка насосной станции и жидкости обработкиустройство
   1. Используйте капилляры с 1/16 '' (1,59 мм) и наружным диаметром 0,02 '' (0,51 мм), внутренний диаметр для всех тюбингов, соединенных со шприцами. Варах размер капилляров, основанный на применении и получить соответствующие разъемы и фитинги для сопряжения головки MFP с шприцами. С помощью сверхчистой воды везде, где разведений необходимы.
   2. Чистые шприцы (250 - 500 объем мкл) и шприц плунжеры с помощью ультразвуковой обработки в 0,5% растворе хлорной извести в воде высокой степени предварительного около- и пост- экспериментов живых клеток. Тщательно промойте их водой. Заполните их водой, погрузив их кончики полностью на водяной бане и аспирацией с помощью плунжера. Чистки жидкость в то время как в водяной бане со шприцем вала, контактирующей уплотнение на выходе из шприца. Повторите аспирата и продувки, пока без пузырьков воздуха наблюдаются в колонках шприцев.
   3. Подключите заполненные шприцы к шприцевые насосы с использованием Луера соединителей. С помощью переключателя клапан, установленный нанасосы , чтобы направить жидкость из шприца к одному из двух капилляров , ведущих либо к головке MFP или жидкостных резервуаров (рисунок 6). (Если переключатель клапан не доступен смотри раздел 1.4.4). не Purge оба капилляры с водой из шприца со скоростью потока около 10 - 50 мкл / мин, в зависимости от размера шприца до примерно 10 мкл воды остается в шприцах.
   4. Предварительно вставьте Продутый капилляры в соответствующий разъем микрожидком / адаптер , который взаимодействует с межслойных каналов в головке (например, разъем M1 - см материалы).
2. Подготовка МФП головки
   1. Почистите головку многофункционального устройства с помощью ультразвука, используя стеклянную посуду моющее средство для стандартной очистки или 0,5% хлорной извести для строгой очистки, в течение 5 мин. Чистки каналы с водой, погрузив апекс в воде и создания вакуума с переходными отверстиями.
   2. Проверьте каналы под стереомикроскопа для потенциальных препятствий (засорения) и повторноторфа предыдущий шаг, если это необходимо.
   3. Установите чистую головку на держателе головки и привинтить разъем с предварительно вставленной и продувают трубы на голову. Прикрутите держатель головки к Z-стадии, который используется для контроля расстояния зазор между головкой болта и монослой клеток.
3. Калибровка этапы сканирования платформы MFP
   1. Выполнение конечной точки калибровки X, Y и Z-стадии до подключения головки к платформе, в соответствии с протоколом производителя с соответствующим программным интерфейсом. Калиброванные этапы обеспечить точность позиционирования головки MFP.
   2. Получают сырой нулевой зазор расстояния (обнуление) путем приведения головки многофункционального устройства над камерой слайде без клеток и медленно спускаться с шагом 5 мкм. После зонда контакт с подложкой, следует соблюдать кольца Ньютона. Это грубая оценка. Точное положение должно быть получено после корректировки Некомпланарность зонда верхушки к substratе.
   3. Для обеспечения Некомпланарность зонда вершины, отрегулируйте наклон головы с помощью гониометра (на границе головы и стадии Z). Когда формируется убедитесь , что кольца Ньютона симметричны (рис 1). Перемещение MFP головки 20 мкм от подложки и регулировки угла наклона с помощью гониометра. Повторите спуск, обнуление и регулировка наклона до колец Ньютона симметричны при контакте. С помощью наклона регулируется, установите положение г, который производит симметричные кольца Ньютона как ноль.
      Примечание: Z-ступень управляет расстоянием головы до подложки, в то время как стадия XY управляет сканированием подложки (рисунок 2). Подробное объяснение можно найти в нашей более ранней работе ^14.
4. Химические препараты для локального удаления клеточных слоев
   Внимание: В случае необходимости использования оборудования для обеспечения безопасности (например, нитриловые перчатки, защитные очки) для химических веществ , в стадии подготовки. Использование дымов ого-гоd, если это необходимо для приготовления растворов. Подготовьте все химические вещества и буферы с сверхчистой воды в качестве разбавителя.
   1. Готовят 50 мМ раствора NaOH , в качестве технологической жидкости для внутреннего канала инжекции (I 2 с потоком Q _I2 на фигуре 1).
   2. Подготовка буфера для экстракции раствора , необходимое для внешней инжекции (I1 с потоком Q _I1 на фиг.1), состоящий из 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 0,5% Tween 20, и 10 мкМ родамина В в аминметан в 50 мМ трис (гидроксиметил) рН 8. Для продувки, используйте воду в аспирационных шприцы.
   3. Фильтр всех растворов с помощью шприца 0,2 мкм фильтр. Дега все отфильтрованные растворы с использованием эксикаторе до тех пор, растворенный воздух остановки не прорывается к поверхности.
   4. Использование сливного трубопровода, соединенный с шприцевые насосы, продуть остатка воды и отсасывание дегазированной растворов в шприцы для инъекций при 40 мкл / мин до тех пор, шприцы не заполнятся (250 или 500 мкл).Это гарантирует, без пузырьков заполнение шприцев, соединителей и капилляров. Клапан-два-капиллярная система шприц-переключатель позволяет заполнение шприцов середине эксперимента. При отсутствии такого выключателя клапана, отсоедините капилляры от головы и заполняют капилляры и шприц аспирационных Дегазированную решения перед повторным подключением их к голове.
   5. Аспирационных обработки и защиты жидкостей через капилляры позволяет использовать малых объемов во время работы. Если химические вещества могут быть получены в больших объемах, заполнить шприцы с требуемыми растворы непосредственно. Например, стремление шприцы, которые содержат воду, могут быть заполнены с использованием этого подхода.
   6. Чистки капилляры к головке MFP с жидкостями, выделенных для каждого канала, как определено в версии 1.4.1 и 1.4.2.
      Примечание: Буферный раствор экстракции экранирует NaOH во внутренней камере, и компонент родамина в буфере облегчает визуализацию ВЭС-е hHFC во время работы.
   7. Если клетки чрезмерно сплошности, с клеточные агрегаты появляются на культивируемой поверхности, дополняют буфера для экстракции с 10% протеиназы К. Это дополняет действие NaOH на этих агрегатах путем растворения денатурированные белки в лизат входит стремление каналов. Это предотвращает засорение каналов во время работы.
5. Получение клеточных монослоев на слайдах камеры
   Внимание: Используйте капот культуре клеток для культивирования клеток и обращаться с оборудованием в соответствии с правилами , установленными сотрудником по биологической безопасности в лаборатории. Обратите внимание, специальные требования конкретных клеточных линий и адаптации протокола и оборудования соответственно.
   1. Использование клеточных культур инкубаторы (при 5% СО ₂ и при 37 ° С ) для культуры и расширения клеток быть составлены по образцу. Выполните расширение с использованием стандартных протоколов культивирования клеток ^17,18 в Т - колбах. Использование средств массовой информации культивирование в соответствии с требованиями конкретного челл линия (например, сыворотки и антибиотик , дополненной DMEM для культивирования MCF7 и MDAMB 231).
   2. При достижении клеток слияния в колбах культуры, Trypsinize и собирают клетки и семена 2 × 10 ⁵ клеток / см ² в каждой из 2- х камерные горками для кучность и культуры в течение 48 часов. Использование клеток в одной из камер в качестве контроля для роста клеток и их жизнеспособности.
   3. При достижении клеток сплошности на камеру слайдами, инкубировать клетки в течение 45 мин с помощью 500 мкл раствора красителя клеточного трекеру (например, зеленый - CMFDA или оранжевый - CMRA) при концентрации 10 мкМ , полученного в среде без сыворотки. Это делается для визуализации клеток во время формирования паттерна. Вымойте меченых клеток с PBS, осторожно промывке каждой камеры с помощью пипетки, а затем культивирования клеток в сывороткой средах для экспериментов формирования паттерна.
   4. Получить ссылку изображение клеточного следящей окрашенных поверхности клетки с целью подсчета клеток. Это делается для того,конфлуэнтности слоя клеток. Кроме того, он служит в качестве вспомогательного средства для экспериментов количественного определения, если восстановление образца и анализ ДНК цели.
      Примечание: В случае, когда жизнеспособность клеток должна быть оценена в ходе формирования паттерна, клетки могут быть окрашены с Live / Dead комплект цитотоксичности в соответствии с инструкциями изготовителя.

2. Создание Иерархическая гидродинамического потока конфайнмент (hHFC)

1. Перемещение МФП над монослоя клеток к щели на расстоянии 50 мкм от предметное стекло. Этот разрыв расстояния, обеспечивая при этом контакт hHFC также объясняет поверхности монослоя и изменения толщины.
2. Вводят NaOH в 6 или 8 мкл / мин через i2. Оценка других скоростей потока (т.е. Q _I1, Q _A1 и _A2 Q) с использованием правил потока на рисунке 3.
3. Модулировать размер внутреннего HFC путем изменения соотношения Q _I2 / Q _I1 с использованием шприца для инъекций.Например, можно использовать ватную _I1 от 1,3 мкл / мин и 4 мкл / мин, с Q _I2 установлен в 8 мкл / мин, что приводит к NaOH след 150 - 300 ячеек (100 - 200 мкм ² / клетка) ( Рисунок 3D).
4. Вводят полной среды из внешнего пространства, большинство отверстий на головке MFP при скорости потока 20 мкл / мин для учета испарения средств массовой информации и аспирации во время работы hHFC.

3. паттернирования монослоев клеток Использование hHFC

Примечание: Шаблон сканирования определяет участки клеточного монослоя, где извлекаются клетки (субтрактивная структуризации), в результате чего оставшиеся клетки для изучения конкретных биологических вопросов. Эта модель может быть прямыми линиями или массив точек, например. Сложные структуры требуют проектирования подходящей траектории сканирования. Например, клетчатый траектории сканирования представляет собой сетку из областей клеток (показано, например , на рисунке 4A ), что позволило бы изучать влияние различных стимулов на клетки в разных квадратах, находясь в непосредственной близости. Эти модели могут быть созданы с помощью контроля над XY этапов платформы, где управляющее программное обеспечение позволяет сценариев траекторий сканирования для головы MFP через клеточный монослой.

1. Установка программного обеспечения для сканирования этапа головку зонда над монослоя клеток в определенных пользователем шаблонов (путем установки X, Y и координаты Z) со скоростью сканирования 10 мкм / с при зазоре расстоянии 50 мкм.
2. С помощью вложенной hHFC в эксплуатации и при контакте с монослоем, сканируют MFP с траекторией желаемого рисунка для осуществления узорной удаления клеток.
3. Для совместного культивирования после первого удаления типа клеток, семян другую клеточную линию, чтобы заполнить пробелы, используя методы, описанные в разделе 1.5. Перемещение между вложенными и ущипнул режимами (за счет увеличения зазора расстояния, например), чтобы контролировать удаление клеток.
   Примечание: Скорость сканирования может иметь быть investiворотами для других клеточных линий. Скорость сканирования, который используется в этой демонстрации эффектов удаления полная клеток над сканированных областей для используемых клеточных линий.

4. Обработка Вниз по течению для отбора проб и ДНК-амплификации

1. Подготовка станции отбора проб для нисходящего анализа лизата. Для выборки станции, использовать 3D-печатная 8-полосная держатель трубки ПЦР. В качестве альтернативы, выбрать соответствующий держатель трубки, чтобы служить в качестве этого адаптера, который с возможностью установки в пределах диапазона сканирования головки вне подложки. Протрите держатель трубки с 70% этанола или других поверхностных дегазации на основе жесткости, требуемой для применения. Используйте магнитный зажим на держателе трубки, чтобы прикрепить ее на держатель подложки.
2. После подготовки станции отбора проб, установите MFP головки 100 мкм от монослоя. Начало работы с hHFC с 50 мМ раствором NaOH в качестве технологической жидкости для внутреннего канала впрыска с дебитом 1, 6, -7 И -17,5 мкл / мин для Q _{I1, I2} Q, Q _A1 и _A2 Q соответственно.
   1. После того, как удержание потока стабилизируется (примерно 10 сек), спускаемся головку зонда к щели на расстоянии 50 мкм для выполнения на основе NaOH локального лизиса выбранного субпопуляции клеток с hHFC. После того, как лизис субпопуляции завершена (примерно 30 сек на след), направить голову в сторону трубок в станции отбора проб. Выброс собранный лизата в пробирки для ПЦР непосредственно (рисунок 6).
3. Для обработки вниз по течению лизата, сначала нейтрализуют рН раствора путем смешивания лизата с Трис-буфером (1: 1). После нейтрализации, нагревать лизата до 95 ° С в течение 30 мин. Затем непосредственно загрузить лизата в стандартный рабочий процесс КПЦР как установлено поставщиком прибора.

Результаты

Описанный протокол для быстрого субтрактивном паттернировании монослоев клеток демонстрируется с использованием многоступенчатой ​​компонента платформы многофункционального устройства (фиг.1 и 2). Протокол использует иерархическую заключение гидродинамического потока (hHFC; Рисунок 3) для локального лечения и удаления клеток из клеточных монослоев, с использованием NaOH в качестве технологической жидкости. Конфигурация hHFC содержит внутренний ФУВ и внешний ФУВ. Приурочены NaOH во внутреннем hHFC вводит химическое действие и сдвига на клетки в контакте. В пределах этого следа клетки гомогенно подвергаются химическому действию NaOH, вследствие конвекции приводом переноса массы внутри, так и с незначительной диффузии в области вне заключения. Сдвига на клетки, с другой стороны, может быть изменено путем изменения скорости потока раствора NaOH. Для упрощения эксплуатационных параметров, мы решили сделать химическое действие доминирующим механизмом удаления клеток по сравнению с сдвига. коценить усилие сдвига, примененное hHFC на поверхности, модель конечных элементов был построен с использованием COMSOL Multiphysics 5.0. Моделирование проводились с использованием модуля CFD для ламинарных потоков. Два впускных граничные условия для инжекторных отверстий геометрии и двух выходных граничных условий для аспирационных отверстий (рисунок 5) были применены для диапазона скоростей потока и размеров апертуры , используемых в текущей демонстрации. В модели, полученной, правила потока диктовали профиля при сдвиге, в то время как скорость потока определили величину сдвига на поверхности. Практически, комбинация обоих определяет, является ли hHFC контактирует с поверхностью. Имея в виду эти факторы, мы отправляемся, чтобы найти диапазон скоростей потока для работы с целью получения химически доминирующего удаления клеток. Для создания hHFC, мы используем правило потока общей аспирации отношение скорости потока инжекции 3,5. Другие правила потока, используемые были определены, чтобы минимизировать засорение в аспирационных каналах,которое может быть вызвано денатурированных белков, торчащие на поверхности канала. С использованием разработанной модели, мы обнаружили , скорости потока от 5 до 10 мкл / мин перевод до напряжения сдвига между 1 и 3 Н / м ^2. Без химического эффекта NaOH, например , в случае буфера для экстракции, напряжение сдвига будет не быть достаточно высокой , чтобы удалить клетки ^19. В пределах наблюдаемого диапазона, отметим , что работа при более высоких скоростях потока является более практичным из - за возмущений в канале потока при низких скоростях потока аспирации (т.е. Q _I2 <4 мкл / мин) из - за остатков клеток в каналах.

Учитывая изученный профиль сдвига и практические соображения, скорости потока NaOH (Q _I2) 6 и 8 мкл / мин используются для экспериментов кучность и Q _I1, Q _A1 и Q _A2 в соответствии с правилами потока , показанных на рисунке 3. Отношение потоков впрыска (Q _I2 / Q _I1) позволяет Us для дальнейшего модулировать размер hHFC след (рис 3D и фиг.4В), основанную на принципе , разработанном Autebert и др. ^14. Использование жидкостного формовочную способность hHFC в сочетании с высоким разрешением сканирования способность MFP платформы, мы демонстрируем поколение сетки живых клеток в различных масштабах и , кроме того , показать применение данного протокола в развитии сотрудничества культур (рис 4в).

Платформа также позволяет выполнять поиск образца лизата для нисходящего анализа. Чтобы показать качество полученного лизата, мы пробовали локально лизируют клетки от одного до пяти отпечатками в двух независимых экспериментах, показывающий изменение в количестве ДНК , полученных из лизата (рисунок 7). Здесь мы амплифицированной ДНК, содержащаяся в лизате с использованием бета-актина праймеров (вперед: GGATGCAGAAGGAGATCACT и обратное: CGATCCACACGGAGTACTTG ) С использованием 4 мкл нейтрализованного лизата в каждой ПЦР-реакции.

Рисунок 1. Модули платформы MFP и головы. (A) Рабочие модули платформы включают моторизованные шприцы, моторизованные этапы и контроллер. МФУ подключен к моторизованным Z-стадии, чтобы контролировать расстояние зазор между головкой и подложкой, а держатель подложки прикреплен к Х- и Y-моторизованных этапов, составляющих систему сканирования. (B) Головка MFP имеет жидкостных ВЬЯС для подключения насосной станции, монтажные отверстия для установки головки на Z-стадии, а также каналы , которые выходит из полированной апекс. Верхушка устанавливается в одной плоскости с подложкой для культивирования клеток. кольца симметрических Ньютона можно наблюдать, когда вершина и подложка расположены в одной плоскости и в контакте. p_upload / 54447 / 54447fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Платформа MFP. Платформа сканирования с высоким разрешением оснащена механической обработке головы держатель , взаимодействующий с высокоточным моторизованных Z-стадии. Держатель подложки соединена с стадии XY для сканирования цели. Для восстановления лизата для нисходящего анализа, 3D-печатная станция выборки обрезается магнитным к боковой стороне держателя подложки (как показано на врезке). Шприцевые насосы, инвертированный микроскоп, контроллеры и дисплеи расположены вокруг платформы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

3 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54447 / 54447fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Иерархическая заключение гидродинамический поток (hHFC) для пространственного и временного контроля удаления клеток. (А) Схема одного HFC. (В) Вложенные и (С) зажат режим работы hHFC. (D) Изображение отпечатка для двух различных соотношениях потока инъекции / аспирации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. Образцы клеточных монослоев с использованием MFP. (А) поколение Cell-сетка программируемым сканированием MFP на монослое клеток MDA-MB-231. Клетки окрашивали с зеленым клеток-следящей красителя. (Б) Отпечаток для различных коэффициентов инжекции (п) На клеточный монослой MCF7. Схема показывает ожидаемое изменение в форме внутреннего HFC с изменением п. (C) Узорчатое совместно культуры путем вычитательном паттернировании MCF7 монослоя с последующим посевом клеток MDA-MB-231 в вычитают регионах. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5. Напряжение сдвига на поверхности при нанесении hHFC. Касательное напряжение на поверхности увеличивается линейно с внутренней скоростью инжекции потока. Самая высокая точка сдвига находится между двумя внутренними отверстиями (нижняя правая вставка), где стесненных обработка жидкости (линии красного потока, верхний левый вставка). Размеры диафрагмы, используемые в модели конечных элементов являются 200, 100, 100 и 200 мкм для i1, i2, a1и a2 соответственно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6. Рабочие режимы платформы MFP для выполнения удаления клеток и кучность стрельбы . (А) Схема пути потока для субтрактивном кучность по лизису клеток. Для простоты, только одна из каждой инъекции и аспирации потока путей показаны. Шприцы заполнены с помощью дренажного клапана в насосе. i1 и i2 используются для инъекционного буфера для экстракции и NaOH, соответственно. (Б) Схематическое изображение пути потока для восстановления лизата. Этот путь потока активируется после сбора клеточного лизата для анализа с использованием канала потока на стадии (а). Пожалуйста , КлиКK здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7. Downstream анализ ДНК из лизата клеток с использованием КПЦР. (А) Amplification участки ДНК в лизате , извлеченной из 5 следов (5 Fp) и 1 след (1 Fp). Органы управления были извлечены после сбора лизата для обоих случаев. (Б) Melt кривые ДНК , амплифицированного из лизата , показывающий качество экстрагированной ДНК. КПЦР проводили (N = 2, п = 3) для амплификации бета-актина ген. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок S1. Уменьшенная изображение конструкции канала для MFP головки 6-канальногоиспользуемые для формирования паттерна экспериментов. Каналы , осуществляющие hHFC 200, 100, 100, 200 мкм в ширину и 100 мкм в глубину. Два крайних каналов, которые пополняются иммерсионной жидкости 500 мкм в ширину и 100 мкм в глубину. Файл GDS для той же конструкции были предоставлены в качестве дополнительной к этой статье. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Мы представляем универсальный протокол для вычитательном паттернировании монослоев клеток, что позволяет быстрое формирование пространственно определенных моделей клеток. Селективный лизис клеточных монослоев осуществляется с использованием NaOH в качестве жидкости для обработки в hHFC. NaOH, мгновенно денатурации белков, содержащихся в клеточной мембране. Мы рекомендуем использовать 50 мМ концентрации NaOH, чтобы обеспечить дальнейшую обработку лизата. Эта концентрация может быть увеличена для более быстрого удаления клеток, обработка при условии, лизат вниз по течению не является объективным. HHFC гарантирует, что необработанные окружающие участки монослоя клеток остаются неизменными и доступны для расширения либо рисунка или зондированием другие свойства клеток.

Скорость удаления клеток является функцией как химии и сдвига, представленной потоком. Мы выбираем рабочий диапазон скоростей потока, чтобы иметь доминирующую химии удаление клеток. Сканирование скорости 10 - 20 & #181; м / сек с использованием NaOH скорости потока инжекции 6 - 8 мкл / мин используются для облегчения "быстрой" отнимающий кучность стрельбы. Скорость быстрого удаления клеток устраняет некоторые проблемы , с которыми сталкиваются поверхности печати на основе структурирование подходов ^20,21. Эти методы требуют механизма, чтобы ограничить рост клеток в пространственно определенных областях, например, путем селективного осаждения белков клеточной адгезии с помощью микро-контактной печати и последующего высева клеток, чтобы получить образец. Они ограничены низкой пропускной способностью и требует несколько последовательных шагов для получения изображения, а также новый трафарет / штамп для каждого шаблона. Описанный способ не требует селективного роста клеток на определенных областях, и позволяет преодолеть некоторые ограничения, выполняя отнимающий структурирование в отличие от печати, в то время как не требует какой-либо дополнительной обработки субстрата для культивирования клеток.

С протоколом, изложенным в данной статье, пропускную способность структурирование монослоев клетокувеличивается, в то время как получение немедленной визуальной обратной связи узора генерируемой. Это облегчает в режиме реального времени модификации паттернов. Такой контроль может быть решающим в сценариях, в которых жизнеспособность клеток на данной поверхности не является однородным. Еще одним преимуществом способа является то, что та же голова и химия может быть использован для создания нескольких шаблонов, тем самым уменьшая количество шагов, участвующих в формировании узорчатую монослой клеток.

Размеры каналов в головке и геометрии головки можно масштабировать в соответствии с требованиями приложения, что позволяет контролировать разрешения на кучность. Все эксперименты в текущей работе были выполнены с использованием головки MFP с фиксированными размерами апертуры, в частности, с внутренними отверстиями при 100 × 100 мкм и наружных апертур при 200 × 100 мкм. Эта конструкция с большими внешними отверстиями был выбран, чтобы обеспечить непрерывную работу hHFC без засорения отверстий путемшальная остатков клеток. Мы протестировали головки с внутренними размерами апертуры 50 × 50 мкм и 50 мкм, расстояние между ними, с успешными результатами в удалении клеток. Использование меньших отверстий, вплоть до 10 × 10 мкм с шагом 10 мкм, позволило бы масштабирование до меньшего размера следа (~ 30 × 30 мкм), что позволяет более высокое разрешение в кучность стрельбы. Мы наблюдали оперативные вопросы с апертурой размером менее 10 мкм из-за засорения из частиц. Из-за таких эксплуатационных трудностей, 100 мкм является текущий предел разрешения, и, таким образом, ограничение описанного метода. Тем не менее, мы можем решить эту проблему с помощью жидкого формовочную способность hHFC. Мы показали , что разрешение удаления клеток может быть настроен для заданного набора размеров апертур, контролируя Q _I2 / Q _I1 (Фиг.4В) и апекс к подложке разрыв ^10,14. Этапы, используемые в текущей работе имеет минимальный размер шага 100 нм.Сочетание этих контролируемых параметров может улучшить пространственное разрешение удаления клеток с точки зрения размера следа и расстояния сканирования.

Если узорчатые сокультурах желательны для изучения специфических межклеточных взаимодействий между различными типами клеток, последовательное высева и структурирование может быть выполнена с использованием протокола, описанного. И, наконец, укрупнения ДНК высокого качества может быть получен из лизата, как это видно по особой пика в ДНК расплава кривой (рис 7). Мы оценили количество ДНК около 1,6 нг от одного следа (около 300 клеток) с использованием КПЦР, что близко к теоретическим ожиданием (6-8 пг / клетку). Это указывает на то, количество извлеченного ДНК, пригодной для нескольких последующих процессов при недопущении использование любых методов выделения ДНК. Это открывает возможности для ДНК-анализа на основе локального зондирования культивируемых клеток. Способность hHFC формировать жидкости также могут быть использованы для осаждения живых клеток и белков на переменномповерхности, усиленное акцией, которая в сочетании с вычитательном кучность и последовательным сокультивирования представленного в данном протоколе обеспечивает создание сложных клеточных и клеточно-матричных структур на подложках культуры. Универсальность и контроль обеспечивается hHFC на основе вычитательном паттернировании клеточных монослоев и возможности проведения анализа ДНК на извлеченном клетках, обеспечивает новый мощный набор инструментов для биологов для выполнения с пространственным разрешением исследований с участием клеточных взаимодействий.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Materials
Microfluidic Probe (MFP)			стекла с каналами, выполненными из кремния. Изготовление выполнено на предприятии IBM Research - Zü богатые
предметные стекла Lab Tek II Chamber с 2 камерами	ThermoFisher научные, США	154461	2 камерные предметные стекла для клеточных культур, каждая из которых обеспечивает площадь 4 см2 и способна удерживать до 3 мл среды volume
Химикаты и клеточные линии
Sodium Hydroxide, Tris-Cl, этилендиаминтетрауксусная кислота, ромамин B	SigmaAldrich chemicals, США	S5881, 252859,  E9884, R6626	Химикаты, используемые для обработки и защиты жидкостей
Proteinase K	Qiagen,	Германия 19131	Протеаза для переваривания денатуирующих белков
Deconex 16 Plus	Bohrer Chemie, Швейцария		Универсальное чистящее средство для лабараторных расходных материалов. Используется для нестрогой очистки.
ДНК прочь	ThermoFisher scientific, США	7010	Обеззараживатель поверхности, денатурирующий ДНК и ДНКазы.
DMEM, с высоким содержанием глюкозы, добавка GLUTAMAX	ThermoFisher scientific, США	10566-016	Питательная среда для эпителиальных клеток.
Краситель CellTracker Green CMFDA	ThermoFisher scientific, США	C7025	Мембранный краситель для мечения живых клеток. Краситель активен в течение 72 часов.
Краситель CellTracker Orange CMRA	ThermoFisher scientific, США	C34551
β-актиновые геномные праймеры для qPCR	Integrated DNA technologies, США		Пользовательские олигопласты используются для проверки качества ДНК и количественной ПЦР.
Клетки карциномы молочной железы MCF7	ATCC, США	ATCC HTB-22	Клеточные линии, используемые для производства кокультур.
MDA-MB-231 клетки карциномы молочной железы	ATCC, США	ATCC HTB-26
Оборудование и жидкостные соединения
>Моторизованные высокоточные ступени	Изготовленные на заказ компоненты.  Линейные осевые двигатели от LANG GmBH, Германия	Индивидуальные линейные осевые столики от LT серии	3 & раз; LT для 3 осей. Контроллер LSTEP используется для сопряжения столиков и ПК через порт RS 232.
Шприцы	Hamilton, Швейцария	1700 серии TLLX	Взаимозаменяемы со шприцами других производителей с 250-500 & микро ... l диапазона.
Nemesys шприцевые насосы низкого давления	cetoni GmbH, Германия		Компонент насосной станции.
Круглый M1-коннектор	Dolomite microfluidics, Великобритания	3000051	Интерфейс между переходными отверстиями в головке МФУ и трубкой
Наклон/поворотный столик Гониометр	OptoSigma, США	Гониометр KKD-25C	для регулировки компланарности вершины МФУ
DS Fi2 HD цветная камера (ПЗС)	Nikon, Швейцария		Управляется с помощью контроллера DS-U3 unit
Software
Win - Commander	LANG GmBH, Германия		Программное обеспечение для управления сценой.
Qmix Elements	cetoni GmbH, Германия		Программное обеспечение для управления насосом.
NIS Elements	Nikon, Швейцария		Модуль фундаментальных исследований для получения и анализа изображений.