В этих исследованиях, мы предлагаем методологию новых, неонатальных, мышиные сердца подмостей для использования в регенеративных исследований.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Новорожденных сердца Каркасы: Новые Матрицы для регенеративных исследований
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Единственным окончательным методом лечения терминальной стадии сердечной недостаточности является ортотопическая трансплантация сердца. По оценкам, каждый год вСоединенных Штатах требуется более 100 000 донорских сердец для процедур трансплантации сердца. Из-за ограниченного числа доноров в США ежегодно проводится только около 2400 трансплантаций2. Многочисленные подходы, от исследований клеточной терапии до имплантации механических вспомогательных устройств, были предприняты, по отдельности или в комбинации, в попытке заставить сердце восстановиться или датьотдых отказавшему сердцу. Несмотря на эти усилия, желудочковые вспомогательные устройства по-прежнему широко используются с целью перехода к трансплантации, а полезность клеточной терапии, хотя она и имеет некоторые лечебные перспективы, все еще ограничена клиническими испытаниями. Кроме того, была предпринята попытка прямой ксенотрансплантации, но успех был ограничен из-за иммунного отторжения. Очевидно, что для производства дополнительных органов для трансплантации требуется другая стратегия, и в идеале эти органы должны быть аутологичными, чтобы избежать осложнений, связанных с отторжением и пожизненной иммуносупрессией. Децеллюляризация — это процесс удаления резидентных клеток из тканей для обнажения нативного внеклеточного матрикса (ВКМ) или каркаса. Перфузионная децеллюляризация обеспечивает полное сохранение трехмерной структуры ткани, при этом основная часть механических свойств ткани остается нетронутой4. Эти каркасы могут быть использованы для повторного заселения здоровыми клетками для создания исследовательских моделей и, возможно, столь необходимых органов для трансплантации. Мы подвергли скаффолды неонатальных мышей (P3), которые, как известно, сохраняют замечательные регенеративные способности сердца,5-8 к децеллюляризации, опосредованной детергентом, и мы повторно заселили эти скаффолды мышиными сердечными клетками. Эти исследования подтверждают возможность создания неонатальной конструкции сердца. Кроме того, они позволяют провести исследование того, может ли ВКМ раннего постнатального сердца содержать сигналы, которые приведут к улучшению стратегий рецеллюляризации.
Введение
Сердечная недостаточность является общим и смертельно опасны. Это прогрессирующее заболевание, которое приводит к снижению сократительной способности сердца, что ухудшает приток крови к органам и оставляет метаболические потребности неудовлетворенных тела. По оценкам, 5,7 миллиона американцев страдают сердечной недостаточностью , и это является основной причиной госпитализации в Соединенных Штатах 9. Коллективный стоимость лечения пациентов при сердечной недостаточности в Соединенных Штатах превышает 300 миллиардов долларов в год 9-10. Только радикальная терапия для конечной стадии сердечной недостаточности ортотопическая пересадка сердца. Каждый год, по оценкам, более 100000 сердца доноров необходимы для сердечных процедур трансплантации в США 1-2. Из - за ограниченного числа доноров, лишь около 2400 трансплантаций ежегодно проводится в США 2. Очевидно, что этот дефицит орган необходимо решать, как другие стратегии необходимы для создания дополнительных органов для transplantaции и, в идеале, эти органы были бы аутологичной таким образом, чтобы избежать осложнений, связанных с отторжением и времени жизни иммуносупрессии.
Млекопитающие взрослые кардиомиоциты демонстрируют ограниченную регенеративную способность после травмы , но последние данные свидетельствуют о том , что у млекопитающих неонатальные сердца поддерживать замечательную регенеративную способность после повреждения 5-8. В частности, после частичной хирургической резекции, регенеративный окно было обнаружено между рождением и постнатальный день 7. Этот восстановительный период характеризуется отсутствием фиброзного рубца, формирование неоваскуляризации, высвобождение ангиогенных факторов из эпикарда и кардиомиоцитов пролиферации 5-8 , 11. Это регенеративная окно времени обеспечивает потенциал для использования сердца новорожденной как новый источник материала для развития биоискусственных сердца.
Внеклеточный матрикс, как известно, обеспечивают важные сигналы для содействия cardiomyocytе пролиферации и роста. Четкие различия в доступности молекул в неонатальных и взрослых матриц 12 и их способности содействовать регенерации, были исследованы 13. Decellularized взрослых матрицы были использованы в ряде исследований, чтобы обеспечить ECM эшафот для сотовых репопуляции и генерацию биоискусственных сердца. В то время как эти исследования, и новые открытия в области стволовых клеточных технологий, быстро развиваются, несколько препятствий, которые еще должны быть выполнены. Например, ограничения в сохранении нативной структуры матрицы, клеточной интеграции в матрицу стены, а также способность поддерживать пролиферацию и рост всех предела успех этого подхода. В то время как превосходные регенеративные атрибуты были приписаны сердца новорожденной, практические аспекты использования такой ткани ограничили его исследование.
На основе продемонстрированной регенеративной способности сердца новорожденной, мы разработали новые матрицы посредством разработкиТехника decellularization для сердца P3 мыши. Сердце Р3 была выбрана для этих исследований , как он находится в пределах окна регенерации сердца , как ранее определено 6 , а сердце является достаточно большим , чтобы урожай, decellularize и recellularize. Целью данного исследования является демонстрация возможности создания матрицы из сердца новорожденной мыши. Наши исследования дают доказательства осуществимости decellularizing минуту, неонатальный сердце при сохранении структурной и белковую целостность ECM. Мы также продемонстрировать способность recellularize этот сердечный ECM с mCherry, выражающих кардиомиоцитов и мы исследовали эти кардиомиоциты для экспрессии различных кардиомаркеров следующих recellularization. Эта технология позволит для тестирования превосходства новорожденных матрицы для развития биоискусственных сердца.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты мыши были выполнены в соответствии с Законом США охране животных и были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional животного происхождения в Университете штата Миннесота.
1. Метод для мышей сердца изоляции
- Эвтаназии неонатальную мышь обезглавливание с одним лезвием использования.
- Тампон грудную клетку с 70% этанола.
- Рассеките кожу от груди, сокращая его подальше от стенки грудной клетки со стандартными ножницами, потянув кожи по бокам с парой # 5 щипцов.
- Проколите живот просто уступающий грудины с ножницами резанием через брюшную стенку. Схватив мечевидного отростка с # 5 щипцов, втягивания грудины ростральным от тела во время резки, хотя ребра с обеих сторон грудной клетки с ножницами. Грудная клетка отражается главно с щипцами, чтобы раскрыть сердце.
- Попросту рассекают два главных долей тимуса, потянув в боковом направлении с # 5 щипцов, обнажаядуга аорты, а также кавальной и легочных вен.
- Трансекте основные артерии от дуги аорты, а сама аорта, с пружинными ножницами 10 см. Сохраните аорту между основанием сердца и брахиоцефальных артерий. Возьмитесь за концы отрезанных судов с № 5 пинцет, чтобы отразить сердце вперед, отделяя его от трахеи и пищевода.
- Трансекте легочную сосудистую и другие крупные вены, путем разрезания между легкими и сердцем по обе стороны от сердца с помощью пружинных ножниц 10 см. Жилы остаются открытыми для обеспечения дренажа.
- Удалите сердце из средостения с # 5 пинцетом, захватывая отрезанные концы магистральных сосудов. Поместите сердце в чашку для культивирования 60 мм, содержащую стерильный фосфатно-солевой буфер (PBS) для катетеризацией.
2. Способ по Decellularization Лангендорфа перфузии
- Подготовьте узел катетера заранее. Нарисуйте раздел 4 смиз ПЭ 50 труб в небольшом пламени спирта, чтобы создать меньше, тоньше катетер. Обрежьте концы с лезвием , чтобы иметь размеры (прибл. 300 мкм внешний диаметр OD с фланцем прибл. OD 500 мкм) , показанного на фиг.1. Это обеспечит две симметричные катетеров с каждой стороны тяги.
- Точка обрезанный конец трубки в пламя на короткое время, чтобы расплавить фланец на отверстие в тонком конце.
- Наполните 12 мл шприц с PBS и собирают катетер путем размещения 3-ходовой кран на шприц. Добавьте 22 г х 1 иглу к запорным краном и водить иглу через перегородку. Вставьте нарисованный PE трубки катетера на иглу (рис. 1).
- Промывать собранные детали с PBS, гарантируя, что все пузырьки воздуха были удалены.
- Вставьте катетер, полученный, как описано выше, в аорту изолированного сердца, не распространяющие мимо аортального клапана и лигируют с одним галстуком 7-0 швом. Отдыхайте фланец тон катетера проксимально против галстука, что делает герметичное уплотнение и предотвращая сердце от отрываясь катетера.
- Обратите внимание на катетеризацию при увеличении, в то время как мягко перфузии сердца, используя шприц, содержащий PBS. Убедитесь в том, что нет никаких утечек в системе и ткань однородно бледнеет, как скрытую кровь удаляется.
- Поместите перегородку в горловину переходника впускного и запечатать его путем складывания сторон над стеклом.
- Приложить резервуар , заполненный 60 мл 1% додецилсульфата натрия (SDS) в дистиллированной воде (дН 2 O) через линию достаточной длины для получения колонки , который генерирует 20 мм рт.ст. , как показано на рис. 1. Вычислить давление от высоты столба жидкости на основе соотношения 1 мм ртутного столба равна 1.3595 см H 2 O.
Внимание: SDS является очень рыхлый порошок с раздражающими свойствами. Следует избегать попадания. Ручка порошка, используя соответствующую защитную одежду. - Заливать сердца с 1% SDS в течение 14 ч. Сердце будет полупрозрачные по внешнему виду без видимых оставшейся ткани.
- Промыть систему до запорного крана оставшегося раствора SDS и заменить его 10 мл дН 2 O. Заливать сердца с помощью 10 мл 1% Тритон Х-100 (разведенный в дистиллированной воде), а затем 10 мл дН 2 O, затем 60 мл PBS , содержащим 1x пенициллин стрептомицин (Pen-Strep).
- Храните сердце в PBS с 1x Pen-Strep при 4 ° С. Если предполагаемое применение пост decellularization требует перфузию затем катетер в аорту должен быть сохранен, в противном случае сократить шовного галстук и удалить катетер.
Определение 3. ДНК
- Приготовьте дайджестом decellularized ECM или контроля сердца с использованием 200 мкг / мл протеиназы К в 50 мМ KCl, 2,5 мМ MgCl 2, 0,45% твин - 20 в 10 мМ Трис (рН 8,3).
- Инкубируйте ткани при температуре 55 ° С при перемешивании, пока ткань не растворится,как правило, 4-5 ч.
- Количественно оценить содержание ДНК в гомогенате с ДНК , анализа связывания 4,11.
4. Закрепление и секционирования ткани
- Fix decellularized, recellularized или контроль P3 сердца в 4% параформальдегид в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Мытье ткани в PBS в 3 раза.
- Поместите ткань в растворе 7,5% сахарозы в 0,1 М фосфатном буфере при температуре 4 ° С, пока он не тонет.
- Изменение раствора до 15% сахарозы в 0,1 М фосфатном буфере при температуре 4 ° С, снова, пока она не тонет.
- Нагреть ткани до 37 ° С, заменить половину объема желатином раствора в 15% -ной сахарозы и 0,1 М фосфатного буфера и уравновешиваться в течение ночи. Концентрации желатина ступенчато увеличивается до 1%, 2,5%, 5% и, наконец, 7,5% в два раза.
- Поместите образцы в cryomolds с использованием свежей 7,5% желатина. Для того, чтобы восстановить форму decellularized образцов, жидкий желатин может быть перфузию в камеры при t-он сердца отлиты. Замораживание плавающими в cryomolds на жидком азоте. Хранить при температуре -80 ° С.
- Вырезать (толщиной 10 мкм) участки с криостата. Принесите слайд близко к поверхности раздела и наблюдать секция отъехать от ножа на поверхность из-за заряда на электростатическим обработанных горками. Высушить слайды в течение ночи и хранят при -80 ° С для последующего анализа.
- Удалить слайды из морозильной камеры, уравновешиваться до комнатной температуры, а затем поместить в банку, содержащую Коплин PBS в течение 20 мин при 37 ° С, чтобы растворить желатин.
- Пятно секции, вырезанные из шага 4.7 с гематоксилином и эозином. Место слайдов в банке Коплин. Expose слайды гидратированных на шаге 4.8 гематоксилин в течение 45 сек, водопроводной воды в течение 1,5 мин, буфер в течение 3 мин, водопроводной воды в течение 1 мин, подсинивания агента в течение 1,5 мин, 80% этанола в течение 1 мин, алкогольная эозин Y в течение 8 сек, 80% этанола в течение 1 мин, 100% этанолом в течение 1 мин 2x, осветлитель (ксилол заменяющего) в течение 1 мин 3 раза, покровное смолойна основе монтажа среднего. Осмотрите слайды микроскопически.
- Для того, чтобы подтвердить сохранение ECM белка реактивности сердца ECM, морилку для ECM структурных белков, таких как коллаген IV, помещая гидратированных слайды в увлажненной камере и обрабатывают 10% нормальной ослиной сыворотки (NDS) в фосфатном буферном солевом растворе с 0,1% тритона -X100 (PBST) в течение 1 ч при комнатной температуре (RT). Используйте достаточный объем, чтобы покрыть срезы ткани.
- Заменить раствор с первичным антителом выбора при эмпирически установленного разбавления в 5% НСР / PBST. Например, антитело Коллаген IV разводили в соотношении 1: 150. Инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С.
- Промыть слайды с PBST 3x и применяют вторичное антитело выбора, конъюгированных с флуоресцентным красителем. Развести антитела эмпирически установленного количества. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре. Мытье с PBS 3 раза.
- Пятно слайды с переплетом красителя ДНК, таких как DAPI проверить отсутствие клеточных ядер с помощью DAPI, содержащего mountiнг среды, когда крышка скольжения слайдов.
- Проверьте слайды с флуоресцентным микроскопом при температуре от 50 до 400X.
5. P1 неонатальной Мышиные желудочков кардиомиоциты для Recellularization
- Спрей каждого детеныша с 70% этанолом и обезглавить с одним лезвием использования.
- Удерживайте каждую детеныша между большим и указательным пальцами в то время как грудная клетка делится на средней линии с маленькими стерильными ножницами, чтобы разоблачить грудной полости. Надавите, чтобы позволить сердце свободно выступать из груди, когда она отрезается магистральных сосудов и предсердия оставив только желудочков ткани.
- Поместите каждое сердце непосредственно в 50 мл пробирку, содержащую 20 мл ледяной кальция, забуференный солевой раствор раствором гидрокарбоната свободного Хэнка с 20 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (CBFHH), пока все сердца не будут собраны.
- Аспирируйте CBFHH и добавьте 10-15 мл свежего CBFHH (ледяная) к трубке. Вымойте ткани путем закрученного ткани в тон несколько раз трубку.
- Декантируют раствор, содержащий сердца в 60 мм пластиковой чашке Петри.
- Проанализируйте любую скрытую предсердной ткани из сердца при увеличении на льду, урезая его подальше от сердца с пружинными ножницами. Фарш до желудочки в текущем гомогенного размера мелкие кусочки. Удалите отделенный без желудочковой ткани из тарелки с # 5 щипцов.
- Пипеткой столько раствора CBFHH как требуется для передачи фрагментов тканей в небольшую стерильную пробирку, которая содержит стерильную микро мешалку.
- Дайте ткани осесть на дно флакона и удаления раствора CBFHH.
- Составляют 50 мл ферментного раствора 1,75 мг / мл трипсина, 20 мкг / мл ДНКазы II в CBFHH. Пипеткой 5 мл этого раствора фермента и добавить его в пробирку, содержащую измельченный желудочковой ткани и место на магнитной мешалкой. Перемешивают при постоянной скорости (340 оборотов в минуту) при комнатной температуре в течение 8 мин.
Примечание: Действие перемешивание должно быть нежным и вместе с тем позволяютдля суспензии шлама. - Извлеките пробирку из мешалке и позволяют Шлам осаждаться в течение 3 мин. Пипеткой и отбросить первоначальный переваривать супернатанта, так как она в основном содержит клетки крови и тканей мусора.
- Пипетируйте второй 5 мл аликвоту раствора фермента и добавить его к переваривания желудочка. Смесь перемешивают в течение 8 мин и дайте ему осесть в течение еще 3 мин. До начала дайджестов, приготовить две 50 мл пробирки (помеченный 1 и 2) каждый из которых содержит 12 мл охлажденного на льду фетальной бычьей сыворотки (ФБС). Поместите сетчатый фильтр ячейки 40 мкм поверх каждой трубки. Пипеткой этот супернатант через фильтр на трубе 1.
- Повторите процесс пищеварения еще 8 раз, чередуя размещение супернатанта дайджеста между двумя трубками, содержащими FBS. Разделить последнюю супернатант поровну между трубами 1 и 2, чтобы обеспечить равные объемы в каждой пробирке.
Примечание: Каждая коллекция трубка теперь будет содержать 32,5 мл общий объем клеточной суспензии. - Центрифуга трубки содержатИнг Поверхностный слой 150 мкг в течение 6 мин при температуре 4 ° С.
- В то время как сбор переваривании аликвот, подготовить пять 100 мм тканевых культуральных планшетах с 6 мл среды (Дульбекко Modified Eagle с носителями (DMEM) с добавлением 10% FBS, 1x Pen-Strep, 1x L-глутамина) на одну пластину. Выдержите эти аликвоты при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение 30 мин для уравновешивания носителя.
- Аспирируйте ферментную смесь CBFHH и ресуспендирования клеток в 30 мл культуральной среды, полученного выше, комбинируя клетки из обоих приборке.
- Возврат 6 мл суспензии клеток в каждой из пластин 100 мм и инкубировали в течение 45 мин при 37 ° С.
- В конце инкубации, передавать, не прилипшие клетки до 5 новых блюд и повторно инкубировать в течение 45 мин (фракция фибробласты будет начинают прилипать к посуде и можно выращивать отдельно, при желании).
- В конце второго раунда предварительного покрытия, собирать средства массовой информации и не-адгезивные клетки из блюд и спина СМИ при 150XG в течение 6 мин.
- Откачать лишние носители , чтобы привести клетки к приближенному желаемой концентрации (4,0 × 10 5 клеток на конструкцию в 100 мкл перфузату). Удалить аликвоту для подсчета и жизнеспособности или тестирования 14.
6. Биореактор Recellularization Р3 сердца Матрица
- Обрабатывайте обособленное матрицу сердца с культуральной среды (этап 5.15) в течение ночи перед добавлением клеток.
- Соберите элементы системы Лангендорфа , как показано на рис. 2. Автоклав стеклянные части и окись этилена стерилизовать пластмассовые части для обеспечения стерильности. Различные субъединиц системы могут быть собраны в колпаке с ламинарным потоком перед тем, установленный на подставке. Циркулирующая вода ванны и путь потока воды с подогревом опущено для ясности.
- Заполните Собранная система с 120 мл среды культуры ткани (шаг 5,15).
- Поместите катетеризированы матрицу сердца с шага 2.14 в 60 мм кульратура блюдо под микроскопом и было подключить 1 мл шприц с 22 G х 1 иглы загружается с клеточной суспензии со стадии 5,20 к катетеру. Убедитесь в том, что эта сборка является свободным от пузырьков воздуха, чтобы избежать эмболизации сердце.
- Осторожно заливать 100 мкл суспензии клеток в матрицу сердца через коронарные артерии. После завершения, отсоединить комбинацию шприца / иглы.
Примечание: Медленное перфузия ок. 20 мкл в минуту требуется для предотвращения клетки от вытекающей из вены, пересекал сердце. - С 22g тупой заглушке, прикрепленного к штуцером Люэра на нижней части банки крышки биореактор сердца, вставьте катетер на заглушке.
- Запустите перистальтический насос и наблюдать , что доходы потока , как показано на рисунке 2. Поток переходит из резервуара с помощью насоса через пузырь ловушку в катетер в аорту на шаге 2.5 (красной дорожке на рис. 2). Обратите внимание на поток сердечного кровообращения из веныs и капать с вершины, рециркулирующей в средствах массовой информации резервуара.
Примечание: скорость перфузии потока зависит от индивидуальных факторов, таких как сосудистый сопротивление конструкции, а также от размера сердца, но со скоростью от 50 до 100 мкл / мин является хорошей отправной точкой. В промежуточных точках времени, функциональные оценки могут быть выполнены. Шкала размер неонатальном recellularized сердца ограничивает оценок, которые могут быть выполнены , но мы установили , что системы оптически основанные могут быть использованы для количественного определения избивая поведение так же , как они были использованы в взрослых сердцах крыс. 4 Конструкция может быть перфузию при продолжительном периоды времени (до 23 часов).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Decellularization
В среднем, время decellularization из Р3 сердца, используя этот протокол составляет около 14 ч. учитывая средний вес сердца 23 мг для P3 новорожденному.
Acellularity
3 , а демонстрирует полностью неповрежденным P3 сердца новорожденной (вся гора). Рисунок 3b показывает то же самое сердце следующее decellularization. На рисунках 4а и 4б
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Зависимость этой методики при повторных перфузии сердца делает предотвращение эмболии одним из важнейших компонентов успешного результата. Из начального катетеризацию сердца на этапах 2,2-2,6, к изменениям раствора между стадиями 2.8-2.14, есть манипуляции, которые могут позволить введение воздушных пузырьков, компромиссом поток перфузату в миокарде. Из-за миниатюрного размера сердца новорожденной малейшим пузырьки в сосудистую сеть может привести к технической миокарда, тем самым оказание decellularization неполной. Кр...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы выражают благодарность г-же Синтии ДеКей за подготовку рисунков.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
6. Выделение кардиомиоцитов желудочков новорожденных с помощью предварительного покрытия
антитела антитела к td colspan="4">
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1. Материалы для изоляции сердца мыши | |||
| P1 детенышей мыши (как показано; В6; D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | или эквивалент |
| 60 мм Чашка для культуры | BD Falcon | 353004 | или эквивалент |
| Фосфат буферизованный физиологический раствор pH 7,4 (стерильный) | Hyclone | SH30256.01 | или эквивалент |
| Одноразовое лезвие | Stanley | 28-510 | или эквивалент |
| Стандартные ножницы | Moria Bonn (Fine Science Tools) | 14381-43 | или эквивалентные |
| пружинные ножницы 10 см | Fine Science Tools | 15024-10 | или эквивалентные |
| весенние ножницы Vannas - 3 мм Режущая кромка | Fine Science Tools | 15000-00 | или эквивалент# |
| 5 Щипцы | Dumnot (Fine Science Tools) | 11295-00 | или эквивалент |
| 2. Материалы для децеллюляризации | |||
| Входной адаптер | Chemglass | CG-1013 | автоклавируемый |
| Septum | Chemglass CG-3022-99 | автоклавируемый | |
| 1/8 дюйма. ID x 3/8 OD C-Flex трубка | Cole-Parmer | EW-06422-10 | автоклавируемый |
| Наружный люэр на шланг 1/8" адаптер для шланга | McMaster-Carr | 51525K33 | автоклавируемый |
| Внутренний люэр на 1/8" адаптер для шланга | McMaster-Carr | 51525K26 | автоклавируемый |
| Prolene 7-0 хирургический шов | Ethicon | 8648G | или эквивалентная |
| кольцевая подставка | Fisher Scientific | S47807 | или эквивалентная |
| Clamp | Fisher Scientific | 05-769-6Q | или эквивалентная |
| Clamp штатная держатель | Fisher | Scientific 05-754Q | или эквивалентная |
| 60-кубовая бочка для шприца | Coviden | 1186000777T | или эквивалент |
| стакана | Kimble | 14000250 | или эквивалент |
| иглы для шприца 22 г x 1 | BD | 305155 | или эквивалент |
| шприца объемом 12 мл | Coviden | 8881512878 | или эквивалент |
| 3-стороннего стопорного крана | Smith Medical | MX5311L | или эквивалент |
| трубки PE50 | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | Должен быть формуемым при нагревании. Рекомендуется полиэтилен. |
| 1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | Рекомендуется ультрачистый сорт. Готовим свежий раствор и фильтруем стерилизуем перед использованием. |
| 1% Тритон Х-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Составить свежий раствор из 10% бульона и простерилизовать фильтр перед использованием. |
| Стерильная вода dH2O | Hyclone | SH30538.02 | или MilliQ. |
| 1x Pen/Strep | Corning CellGro | 30-001-Cl | или эквивалент |
| 3. Материалы для количественного определения ДНК | |||
| протеиназы | K Fisher | BP1700 | >30 U/mg активности |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | или эквивалента |
| MgCl2· 6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | или эквивалентный |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | или эквивалент |
| трис-основания/гидрохлорида | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | или аналог |
| набора для анализа дцДНК Pico-Green | Life Technologies | P7589 | требует, чтобы флуориметр показывал |
| 4. Метод фиксации и разрезания ткани | |||
| Параформальдегида | Sigma-Aldrich | P6148 | или эквивалентного |
| желатина типа А из свиной кожи | Sigma-Aldrich | G2500 | должно быть 300 цветков или больше |
| 5. Метод для гистологии тканей | |||
| Cryomolds 10 x 10 x 5 мм | Tissue-Tek | 4565 | или аналог |
| Cryostat | Hacker/Bright | Model OTF | или эквивалент |
| микроскопа Slides 25 x 75 x 1 мм | Fisher Scientific | 12-550-19 | или эквивалент |
| Hematoxylin 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | или эквивалент |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | или эквивалент |
| Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | или эквивалент |
| Blue buffer | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | или аналог |
| Алкогольный Эозин Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | или аналог |
| Формула 83 Заменитель ксилола | CBG Biotech | CH0104B | или эквивалентный |
| Permount Mounting Medium | Фишер Кемикал | SP15-500 | или эквивалент |
| к коллагену IV | Rockland | 600-401-106.1 | или эквивалент |
| альфа;-актинину | Abcam | AB9465 | или эквивалент |
| антитела mCherry Abcam | AB205402 | или эквивалент | |
| антитела NKX2.5 | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | или эквивалент |
| антитела Donkey против мыши AF488 | Антитело Life Technology | A21202 | или аналог |
| Donkey Anti-chicken AF594 Antibody | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | или эквивалент |
| Антитела к козлятам CY5 от осла | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | или эквивалентный |
| Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | или эквивалентный |
| Prolong Gold Antifade Mountant с DAPI | ThermoFisher | P36930 | или эквивалент< |
| HBSS (Ca, Mg Free) | Hyclone | SH30031.02 | или эквивалента |
| HEPES (1 M) | Corning CellGro | 25-060-Cl | или эквивалентного |
| клеточного фильтра | BD Falcon | 352340 | или эквивалентного |
| пробирки 50 мл | BD Falcon | 352070 | или эквивалента |
| Primeria 100 мм пластины | Corning | 353803 | поверхность Primeria усиливает прикрепление фибробластов, способствуя более высокой чистоте миоцитов |
| Трипсин | Difco | 215240 | или эквивалент |
| DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | или эквивалент |
| DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) | Гиклон | SH30022.01 | или эквивалент |
| витамина B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | или эквивалентные |
| пластины с фибронектиновым покрытием | BD Bioscience | 354501 | или аналог |
| Фетальная бычья сыворотка | Hyclone | SH30910.03 | или аналог |
| Стеклянная посуда для биореактора Heart | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | Должна быть стерилизуемой автоклавированием или газом. |
Ссылки
- Yusen, R. D., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second official adult lung and heart-lung transplantation report--2015. J Heart Lung Transplant. 34 (10), 1264-1277 (2015).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: A report from the american heart association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Kapelios, C. J., Nanas, J. N., Malliaras, K. Allogeneic cardiosphere-derived cells for myocardial regeneration: current progress and recent results. Future Cardiol. 12 (1), 87-100 (2016).
- Ott, H. C., et al. Perfusion decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Porrello, E. R., Olson, E. O. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Research. 13 (3 Pt B), 556-570 (2014).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Polizzotti, B. D., et al. Neuregulin stimulation of cardiomyocyte regeneration in mice and human myocardium reveals a therapeutic window. Sci Transl Med. 7 (281), 281ra45(2015).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
- Ambrosy, A. P., et al. The Global Health and Economic Burden of Hospitalizations for Heart Failure: Lessons Learned From Hospitalized Heart Failure Registries. J Am Coll Cardiol. 63 (12), 1123-1133 (2014).
- Roger, V. L., et al. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics-2012 Update A Report From the American Heart Association. Circulation. 125 (22), 188-197 (2012).
- Kennedy-Lydon, T., Rosenthal, N. Cardiac regeneration: epicardial mediated repair. Proc R Soc B. 282 (1821), 2147-2172 (2015).
- Williams, C., Sullivan, K., Black, L. D. Partially Digested Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Cardiomyocyte Proliferation In Vitro. Adv Healthcare Mat. 4 (10), 1545-1554 (2015).
- Borg, T. K., et al. Recognition of extracellular matrix components by neonatal and adult cardiac myocytes. Dev Biol. 104 (1), 86-96 (1984).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immnol. 111, A3-B1-3 (2015).
- Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. Quantification of DNA in biologic scaffold materials. J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng Part C Methods. 17 (9), 915-926 (2011).
- Lu, T. Y., et al. Repopulation of decellularized mouse heart with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular progenitor cells. Nat Commun. 4 (2307), 1-11 (2013).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
