Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Novel Выделение РНК-связывающих белков Стремительное Методология

9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54467

⸱

30 сентября 2016 г.

 , 
1Faculty of Biology, Technion - Israel Institute of Technology, 2Department of Biomolecular Sciences, Weizmann Institute of Science

В этой статье

Краткое содержание

РНК-белковые взаимодействия лежат в основе многих клеточных процессов. В этой статье мы описываем метод in vivo для выделения специфической РНК и идентификации новых белков, которые с ней связаны. Это может пролить новый свет на то, как РНК регулируются в клетке.

Аннотация

РНК-связывающие белки (RBP) играют важную роль во всех аспектах метаболизма и регуляции РНК. Их идентификация является одной из основных задач современной биологии. Лишь немногие методы in vitro и in vivo позволяют идентифицировать RBP, связанные с конкретной мРНК-мишенью. Однако их основными ограничениями являются идентификация RBP в неклеточной среде (in vitro) или низкая эффективность выделения РНК, представляющей интерес (in vivo). Методология очистки и идентификации РНК-связывающих белков (RaPID) была разработана для преодоления этих ограничений у дрожжей и обеспечения эффективной изоляции белков, ассоциированных in vivo. Для достижения этой цели представляющую интерес РНК помечают петлями MS2 и совместно экспрессируют со слитым белком MS2-связывающего белка и стрептавидин-связывающего белка (SBP). Затем клетки подвергаются сшиванию и лизису, а комплексы выделяются с помощью гранул стрептавидина. Белки, которые совместно очищаются с меченой РНК, затем могут быть определены с помощью масс-спектрометрии. Недавно мы использовали этот протокол для идентификации новых белков, ассоциированных с ER-ассоциированной мРНК PMP1. Здесь мы приводим подробный протокол RaPID, а также обсуждаем некоторые его ограничения и преимущества.

Введение

РНК-связывающие белки (ОДП) составляют около 10% от S. CEREVISIAE белки 1,2 и около 15% белков млекопитающих 3-5. Они участвуют во многих клеточных процессах, таких как мРНК пост-транскрипционной обработки и регулирования, перевод, биогенеза рибосом, тРНК аминоацилирования и модификации, хроматина и многое другое. Важной подгруппой ОДП является мРНК-связывающие белки (mRNPs) 6,7. В процессе созревания мРНК, различные ОДП связывают расшифровку и урегулируют свою ядерную переработку, экспорт из ядра, клеточной локализации, трансляции и деградации 6-8. Таким образом, определенный набор ОДП, связанных с конкретным транскрипта в любой момент времени определяет его обработки и в конечном счете его судьба.

Идентификация ОДП, связанных с мРНК может значительно улучшить наше понимание процессов, лежащих в основе их пост-транскрипционной регуляции. Различные генетические, Микроскопические, биохимические и биоинформатики методы были использованы для идентификации белков , участвующих в регуляции мРНК (обзор 9-11). Тем не менее, лишь немногие из этих методов позволяют идентифицировать белки, связанные с конкретной мРНК-мишени. Следует особо отметить Дрожжи Три Гибридная система (Y3H), которая использует мРНК представляют интерес в качестве приманки для скрининга библиотеку экспрессии в клетках дрожжей. Положительные клоны, как правило , наблюдается через выражение выбора роста или репортера 12-14. Основным преимуществом этого метода является большое количество белков, которые можно сканировать в сотовой среде и способность измерения силы взаимодействия РНК-белок. Недостатками включают относительно большое число ложных положительных результатов из-за неспецифического связывания, а также высокий потенциал ложных отрицательных результатов из-за, в частности, до неправильного сворачивания от добычи слитого белка или РНК приманки.

Альтернативой генетического подхода является сродство purifiКатион РНК с его ассоциированных белков. Поли А-содержащий мРНК, могут быть выделены посредством использования олиго дТ колонн, и их ассоциированные белки обнаруживаются с помощью масс-спектрометрии. Взаимодействие РНК-белок сохраняется в клеточном контексте путем сшивания, что делает малой дальности ковалентные связи. Использование олиго дТ колонке дает общее представление о всей протеома , который связан с любым поли - А-содержащей мРНК 3,5,15. Тем не менее, это не дает список белков, которые связаны с определенной мРНК. Очень немногие из них будут доступны для выполнения такой идентификации. Метод ПАР влечет за собой трансфекцию нуклеиновой кислоты с комплементарности мРНК - мишени 16,17. Нуклеиновая кислота также присоединен к пептиду, который позволяет сшивающего ОДП в непосредственной близости от сайта взаимодействия. После сшивания, КПБ-пептид-нуклеиновая кислота может быть выделена и подвергнута анализу протеомики. В последнее время методология аптамеры на основе былауспешно применяется для извлечения из клеточных линий млекопитающих 18. РНК аптамеров с улучшенным сродством к стрептавидином была разработана и слиты с последовательностью, представляющей интерес (АС богатых элемент (ARE), в данном случае). РНК аптамеров-ARE была присоединена к стрептавидином бус и смешивают с лизата клеток. Белки, которые связаны с последовательности были очищены и идентифицированы с помощью масс-спектрометрии (МС). Хотя этот метод обнаружены ассоциации , которые имеют место вне клеточных параметров (то есть, в пробирке), то, вероятно, будет изменен в будущем , с тем , чтобы ввести аптамеров в геном и , таким образом , позволяют выделение белков , ассоциированных с мРНК , в то время как в клеточная среда (то есть, в естественных условиях). У дрожжей, где генетические манипуляции хорошо установлена, экспрессный метод (разработан в лаборатории профессора Джеффа Джерст в) обеспечивает представление ассоциаций 19 в естественных условиях. RAPID сочетает в себе конкретное и сильное связывание белка MS2 пальто (MS2-CP) в РНК последовательности MS2, и на стрептавидин-связывающий домен (СБП) с стрептавидином гранулами, конъюгированными. Это обеспечивает эффективную очистку MS2-меченых мРНК через стрептавидином бусин. Кроме того, выражение 12 копий петель МС2 позволяет использовать до шести MS2-ХП связываться одновременно с РНК и повышение эффективности ее изоляции. Таким образом, этот протокол был предложен для того, чтобы идентифицировать новые мРНК-ассоциированных белков, как только элюированные образцы подвергали анализу протеомики с помощью масс-спектрометрии.

Недавно мы использовали RAPID для идентификации новых белков , связанных с дрожжами Pmp1 мРНК 20. Pmp1 мРНК ранее показано, что связано с ER мембрану и обнаружили , что его 3 'нетранслируемой области (UTR) , чтобы быть главным фактором , определяющим в этой ассоциации 21. Таким образом, ОДП , которые связывают Pmp1 3 'UTR, вероятно, играют важную роль в его локализации. RAPID с последующей жидкостной хроматографY-масс - спектрометрии / масс - спектрометрии (ЖХ-МС / МС) привело к идентификации многих новых белков , которые взаимодействуют с Pmp1 20. Здесь мы приводим подробный протокол методологии RAPID, важные элементы управления, которые должны быть сделаны, и технические советы, которые могут улучшить урожайность и специфичность.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Вставьте последовательность, состоящую из 12 MS2-сайты связывания (МС2 петель; MS2L) в желаемый геномного локуса, как правило, между открытой рамкой считывания (ORF), и 3'-UTR. Подробный протокол для такой интеграции обеспечивается в другом месте 22. Проверьте правильность вставки и экспрессии с помощью ПЦР, северного анализа или RT-PCR 20,23. Важно, чтобы убедиться, что интеграция не вмешивались с синтезом 3'UTR. Кроме того, плазмиду , экспрессирующих МС2-СР , слитый с СБП под выражением (истощением метионин) индуцируемый промотор , также должны быть введены в клетки 24. Идентичный штамм, за исключением введенных петель MS12, следует использовать в качестве контроля для обнаружения неспецифических сигналов.

1. Очистка RAPID

  1. Grow 500 мл дрожжевых клеток (используют 250-1,000 мл дрожжевых клеток в зависимости от уровня экспрессии представляющего интерес гена) , выражающая МС2-меченый мРНК 20 иMS2-CP-GFP-СБП слитый белок от 24 до OD 600 0,8 - 1,0 при 30 о С в соответствующей среде роста (например, синтетический Декстроза (SD) селективной среде).
  2. Центрифуга клетки при 3000 мкг в течение 4 мин при комнатной температуре и отбросить супернатант.
  3. Промыть клетки в 1X фосфатным буферным солевым раствором (PBS), центрифугируют , как и раньше (шаг 1.2), ресуспендируют в равном объеме (этап 1.1) УР без метионина, и инкубировать в течение 45 - 60 мин при 30 ° С , чтобы вызвать экспрессию MS2 -СР-GFP-СБП слитый белок.
    Примечание: Более длительное время индукции может привести к агрегации GFP.
  4. Отложите 10 мл клеток и экстракта РНК из этого образца с использованием простого "горячего фенола" метод 25. Внимание: Фенол является высокотоксичным и должны быть обработаны в соответствии с его инструкциями по технике безопасности.
    Примечание: Эта РНК является хорошим ориентиром для качества выделенной РНК (рис 1А).
  5. Для получения 500 мл клеток, добавляют 1,35 мл 37% формальдегида до конечной Concentration 0,1% сшивать РНК-белковых комплексов. Продолжить инкубации при 30 ° С в течение 10 мин. Внимание: Формальдегид обладает высокой токсичностью и должны быть обработаны в соответствии с его инструкциями по технике безопасности.
  6. Добавить 26,5 мл 2,5 М глицин до конечной концентрации 0,125 М и инкубировать в течение 3 мин, чтобы остановить сшивку. От этого шага дальше, все расставит на льду, чтобы минимизировать деградацию РНК.
  7. Центрифуга клеток при 3000 мкг в течение 4 мин при 4 ° С и промывали 45 мл холодного 1x PBS.
  8. Ресуспендируют клеток в 1 мл буфера для лизиса RAPID на 100 мл исходной клеточной культуры.
  9. Разделить на порции по 500 мкл в завинчивающейся крышкой микроцентрифужных пробирки и добавляют ~ 400 мг охлажденных стеклянных шариков в каждой аликвоты (примерно полная 0,2 мл ПЦР трубки).
  10. Лизировать клетки в бусинки с насадкой в ​​течение 3 мин. Немедленно поставить лизата на льду.
    Примечание: лизис клеток-релизы в клеточные РНКазы, которые являются основной причиной деградации РНК. RAPID буфера для лизиса содержит высокую концентрацию РНКазы inhibitors, такие как неспецифический ингибитор гепарин РНКазы и специфических ингибиторов. Работая быстро и держать все холодным также рекомендуется.
  11. Переносят лизат в новые пробирки. Пирс небольшое отверстие в нижней части каждой трубки с микроцентрифуге горячей иглой (0,8 мм х 40 мм) и поместите микроцентрифуге трубки в верхней части 15-мл пробирки. Используйте голову 5 мл шприца в качестве переходника между микроцентрифужных труб и 15 мл пробирки. Центрифуга сборку труб при 3000 х г в течение 1 мин при 4 ° С ,
  12. Перенести проточного из 15 мл трубки к новой 1,5 мл пробирку и центрифугируют при 10000 х г в течение 10 мин при 4 ° С для удаления остатков клеток.
  13. Бассейн супернатанты от всех 1,5 мл пробирки в одну 15 мл трубку и отложите 1/50 и 1/100 объем лизата для РНК и выделения белка, соответственно.
    Примечание: Они будут служить в качестве "Ввод" образцов для последующего анализа (рисунок 1).
  14. Добавьте 300 мкг авидина на 500 мл Initial культуры дрожжей и инкубировать в течение 30 мин (это может быть уменьшено до 10 мин) при температуре 4 ° С при постоянном прокаткой (10 оборотов в минуту).
    Примечание: авидин блокирует биотин и биотинилированные белки от связывания с стрептавидином бусин.
  15. Предварительно вымыть стрептавидином шарики до инкубации с лизатом клеток.
    1. Помещают около 300 мкл стрептавидина бусин суспензии до 1,5 мл трубки микроцентрифужных и снимите верхнюю супернатант. Это приведет к 250 мкл шариков. Вымойте бисером дважды 1 мл буфера для лизиса RAPID. Центрифуга стрептавидином шарики при 660 мкг в течение 2 мин при 4 ° С между каждым шагом.
    2. Блок бусин путем инкубирования в течение 1 ч с 0,5 мл буфера для лизиса RAPID, 0,5 мл 10 мг / мл бычьего сывороточного альбумина и 10 мкл 10 мг / мл дрожжевой тРНК. Шарики могут быть оставлены O / N в блокирующем растворе при 4 ° С с вращением при необходимости.
    3. Промыть дважды с 1 мл RAPID буфера для лизиса.
      Примечание: магнитные гранулы также могут быть использованы для уменьшения времени и backgrкруглый вырез. Они, однако, имеют меньшую емкость, чем сефарозы.
  16. Добавьте 250 мкл предварительно вымытых стрептавидином бисером авидин-содержащий лизата (со стадии 1.14) и инкубировать 1 час при 4 ° C с постоянным вращением (10 оборотов в минуту).
    Примечание: Это время инкубации представляет собой компромисс между обеспечением достаточного времени связывания и свести к минимуму шансы деградации РНК.
  17. Центрифуга при 660 х г в течение 2 мин при 4 ° С , чтобы очистить стрептавидином шарики и перенести супернатант в новую 15 мл трубки. Отложите 1/50 и 1/100 объема лизата для РНК и белка изоляции, соответственно.
    Примечание: Это будут "несвязанные" образцы.
  18. Вымойте бисером с 1 мл RAPID буфера для лизиса, слегка встряхните, переход на новую 1,5-мл микроцентрифужных трубки, и центрифуга, как на этапе 1.17. Повторите этот шаг три раза.
  19. Вымойте бисером с 1 мл буфера RAPID мыться, и на этот раз вращаться (10 оборотов в минуту) в течение 5 мин при 4 ° С. Повторите этот шаг дважды.
  20. Вымойте бисером с 1 мл 1x PBS и центрифуге, как указано выше.
  21. Вымойте бисером раз с 120 мкл 1x PBS. Центрифуга, как описано выше, и взять на себя всю супернатант для РНК и извлечения белка в качестве образца "Wash".
    Примечание: Этот последний образец стирки будет указывать строгость промываний и должна быть того же объема, что и образец элюции. Это упростит обработку и загрузку в последующих анализах.
  22. Для элюирования РНК и РНК-ассоциированных белков из колонки, добавляют 120 мкл 6 мМ биотина в 1X PBS и инкубировали в течение 45 мин при температуре 4 ° С при постоянном вращении (10 оборотов в минуту).
  23. Центрифуга гранулы, как описано выше, и передать элюированный материал на новый 1,5 мл трубки. Спин элюированный образец снова и перенести верхнюю фазу к новой 1,5 мл трубки, чтобы исключить унос бисера.
  24. Возьмите образцы для РНК или экстракции белка.
    Примечание: Объем взят должен зависеть от следующего анализа и уровень экспрессии РНК или белка, представляющего интерес, В качестве ориентира для северного анализа 26, принять 80% выборки, для Вестерн - блоттинга 23,27 или RT-PCR 28, принять 20%, а для масс - спектрометрии 29 , чтобы обнаружить новые белки, взять весь образец.

2. Экстракция РНК

  1. Добавить равный объем 2x Сшивание Реверсирование буфера и инкубируют в течение 45 мин при 65 ° С. Продолжить непосредственно для экстракции РНК.
    Примечание: сшивающий Реверсирование буфер содержит этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), что существенно повышает экстракции РНК 20.
  2. Используйте стандартный фенол: хлороформ метод 26 для извлечения РНК из "входа" и "несвязанных" образцов (шаги 1.13 и 1.17).
    Примечание: Эти образцы содержат большое количество ингибитора РНКазы гепарина, который может ингибировать последующее обратное Transcriptase- (RT) с использованием анализов (например, RT-PCR), поэтому, LiCl осадков 30 рекомендуется , чтобы удалить его. "ВаSH "и" элюции "образцы (шаги 1,21 и 1,24) содержат малые количества РНК и осаждают с помощью следующих шагов.
  3. Добавить равный объем 8M гуанидин-HCl (GuHCl) и два объема 100% этанола к "промывкой" и "вымывания" образцов. Инкубируют при температуре -80 ° С в течение по меньшей мере 2 ч.
    Примечание: гуанидин будет эффективно денатурации белков и, таким образом, ингибируют РНКазы и протеазы в образце.
  4. Центрифуга при 20000 х г, 4 ° С в течение 30 мин и отбросить супернатант. Промыть гранулу с холодным 80% этанолом и снова центрифуге при 20000 х г, 4 ° С в течение 15 мин.
  5. Растворить осадок РНК в 400 мкл РНКазы свободной воды и выпадают в осадок снова, чтобы удалить остатки GuHCl или другие загрязняющие вещества. Добавить 40 мкл 3 М ацетата натрия, рН 5,2 и 800 мкл 100% этанола, инкубируют при -20 & deg; С в течение по меньшей мере 1 ч.
  6. Центрифуга и мыть, как на стадии 2.4 и удалить все этанол с наконечником 10 мкл. Ресуспендируют РНК Пелли др в 10 мкл РНКазы свободной воды. Соблюдайте особую осторожность, так как осадок РНК, как правило, не видно.
    Примечание: Образцы могут быть использованы для Нозерн - анализа , как описано в 23 (фиг.1).

3. Получение белка для Вестерн-блот или масс-спектрометрического анализа

  1. Добавьте 1/3 объема 4x Laemmli буфера выборок (LSB) для образцов белка и инкубировать 45 мин при 65 ° С, чтобы полностью изменить сшивание РНК и белков.
    Примечание: Образцы можно хранить при -20 ° С.
  2. Запуск белки на полиакриламидном геле (SDS-PAGE) 31. Скорректировать процент геля в зависимости от размера белков, которые необходимо проанализировать.
    Примечание: 10% гель акриламид дает широкий спектр разделения и хорош в качестве первого приближения.
  3. Перенос белков на мембрану , как в стандартном анализе иммуноблот 27 для контроля эффективности изоляции (Рисунок 1С). Пятно либо кумасси голубым R250 или окрашивания серебром перед анализом масс-спектрометрии.
    Примечание: Серебро пятно является предпочтительным выбором , поскольку он является более чувствительным и позволяет лучше обнаружения (рис 1B). Окрашивание можно сделать с помощью либо вручную приготовленных растворов или коммерческих наборов. Время инкубации геля в растворе окончательного красителя должно быть определено экспериментально. Длинные инкубации может выявить низкие обильные белки, но может привести к весьма выраженные белки, такие как MS2-CP-СБП-GFP, чтобы быть более окрашена и могут маскировать окружающие белки в их окрестности. Кроме того, высокий фон может произойти. Внимательно следить за реакцией, и добавить стоп-раствора в соответствующее время.
  4. Вырежьте полосы из геля и передавать их в 1,5 мл пробирки. Образцы хранить при температуре -20 ° С, или отправить для экстракции белка и усвоением трипсина с последующим анализом ЖХ-МС / МС 32.
  5. В качестве альтернативного подхода протеомического исключить стадию разделения геля, переваривать элюированный материал с шага 1,24 в таклюция с помощью трипсина и с учетом анализа LC-MS / MS 33.
    Примечание: Опуская разделение SDS-PAGE упрощает протокол и повышает урожайность. Тем не менее, образцы могут содержать следы моющего средства NP-40, ингибирующего масс-спектрометрический анализ. Чтобы преодолеть эту проблему, выполните следующие действия:
    1. Запуск белка на SDS-PAGE 31 за 10 - 15 мин.
    2. Вырежьте всю часть переулка (то есть, где белки расположены).
      Примечание: образец белка может включать значительное количество белка МС2-CP-SBP, которые могут затенить сигналов низкого белков изобилии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

RAPID делает возможным выделение специфической РНК-мишени с ее ассоциированных белков. Критическое для его успеха является сохранение РНК нетронутыми как можно больше, в результате чего получают достаточное количество белков. Для определения эффективности изоляции и качества РНК, Нозерн - анализ выполняется (рисунок 1А). Северный анализ имеет преимущество непосредственно отчетности эффективности и качества стремительной. Таким образом, относительные количества полной дли...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Различные методы используют выделение специфических мРНК для выявления связанных с ними белков 11,34 35. Эти методы применяются в пробирке и в естественных условиях стратегий для исследования РНК-белковых взаимодействий. В пробирке методы инкубировать экзогенно транскрипции РНК с лизатом клеток , чтобы захватить ОДП и изолировать RNP комплексы 36,37. Был представлен эффективный подход такого типа в последнее время , что позволило выявить новых белков , которые ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим профессора Джеффа Джерст и Борис Слободин за их полезные советы по настройке Стремительное протокола и предоставления необходимых плазмид. Мы также благодарим доктора Avigail ATIR-Ланде за помощь в создании этого протокола и д-р Тамар Зива из Smoler протеомики Центра за помощь с анализом LC-MS / MS. Мы благодарим профессора Т.Г. Kinzy (Rutgers) для YEF3 антитела. Эта работа была поддержана грантом 2011013 от научного фонда бинасиональ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
TrissigmaT1503
SDSбио-лаборатория1981232300
DTTsigmaD9779
Кислотный фенол (pH 4,3)sigmaP4682
Кислый фенол: хлороформ (5:1, pH 4,3)sigmaP1944
Хлороформбио-лаборатория3080521
формальдегидомFrutarom5551820
GlycinesigmaG7126
NP-40Calbiochem492016
гепаринSigmaH3393
Фенилметилсульфонилфторид (PMSF)SigmaP7626
ЛеупептинSigmaL2884
АпротининSigmaA1153
Ингибитор трипсина соиSigmaT9003
пепстатинSigmaP5318
DNаза IPromegaM610A
рибонуклеаза  ИнгибиторTakara2313A
Стеклянные бусиныSartoriusBBI-8541701диаметр 0,4-0,6 мм 
Mini BeadBeaterBioSpecMini BeadBeater 16
гуанидинийSigmaG4505
AvidinSigmaA9275
Стрептавидиновые бусиныGE Healthcare 17-5113-01
Бычий сывороточный альбумин (БСА)SigmaA7906
ТРНК дрожжейSigmaR8508
Биотин SigmaB4501
Дрожжевой экстрактBacto288620
пептонBacto211677
глюкозойSigmaG8270
1x Фосфатно-солевой буфер (PBS)
0,2 М NaOH
4x Laemmli Sample Buffer (LSB)0,2 М Tris-hcl pH 6,8, 8% SDS, 0,4 М DTT, 40% глицерин, 0,04% бромфенол-синий.
для лизиса фенола10 мМ Трис pH 7,5, 10 мМ ЭДТА, 0,5% SDS 
3 М Ацетат натрия pH 5,2
100% и 70% этанол (EtOH)
РНазный водный
буфер20 мМ Tris pH 7,5, 150 мМ NaCl, 1,8 мМ MgCl<суб>2, 0,5% NP-40, 5 мг/мл гепарина, 1 мМ дитиотреитол (DTT), 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF), 10 &; г/мл Лейпептин, 10 & микро; г/мл Апротинин, 10 & микро; г/мл ингибитор соевого трипсина, 10 & микро; г/мл Пепстатин, 20 Ед/мл ДНКазы I, 100 Ед/мл Рибонуклеаза  Ингибитор.
2x Буфер для сшивки100 мМ Tris pH 7,4, 10 мМ ЭДТА, 20 мМ DTT, 2 % SDS.
RaPID промывочный буфер20 мМ Tris-HCl pH 7,5,  300 мМ NaCl, 0,5% NP-40
0,5 М ЭДТА pH 8
Silver Stain Plus KitBio-Rad 161-0449Для детектирования белков в полиакриламидных гелях
SD селективной среды 1,7 г/л Дрожжевая азотная основа без аминокислот и сульфата аммония, 5 г/л Сульфат аммония, 2% глюкозы, 350 мг/л Треонина, 40 мг/л Метионина, 40 мг/л Аденина, 50 мг/л Лизина, 50 мг/л Триптофана, 20 мг/л Гистидина, 80 мг/л Лейцина, 30 мг/л Тирозина, 40 мг/л Аргинина
Anti-eEF3 (EF3A, YEF3)Подарок от Kinzy TG. (Медицинская школа Роберта Вуда Джонсона UMDNJ)1:5,000
Anti GFP антителоSanta Cruzsc-83341:3,000
Anti rabbit IgG-HRP конъюгированноеSIGMAA91691:10,000
Горячий буфер для лизиса RaPID

Ссылки

  1. Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6, e255(2008).
  2. Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae. PloS One. 5, (2010).
  3. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149, 1393-1406 (2012).
  4. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15, 829-845 (2014).
  5. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46, 674-690 (2012).
  6. Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol Cell. 54, 547-558 (2014).
  7. Licatalosi, D. D., Darnell, R. B. RNA processing and its regulation: global insights into biological networks. Nat Rev Genet. 11, 75-87 (2010).
  8. Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
  9. Ascano, M., Gerstberger, S., Tuschl, T. Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks. Curr Opin Genet Dev. 23, 20-28 (2013).
  10. Denman, R. B. mRNPs take shape by CLIPPING and PAIRING. BioEssays. 28, 1132-1143 (2006).
  11. McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15, 203(2014).
  12. Bernstein, D. S., Buter, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
  13. SenGupta, D. J., et al. A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8496-8501 (1996).
  14. Yosefzon, Y., et al. Divergent RNA binding specificity of yeast Puf2p. RNA. 17, 1479-1488 (2011).
  15. Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nat Struct Mol Biol. 20, 127-133 (2013).
  16. Zielinski, J., et al. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1557-1562 (2006).
  17. Bell, T. J., Eberwine, J. Live Cell Genomics: RNA Exon-Specific RNA-Binding Protein Isolation. Methods Mol Biol. 1324, 457-468 (2015).
  18. Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Res. 42, e13(2014).
  19. Slobodin, B., Gerst, J. E. A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes. RNA. 16, 2277-2290 (2010).
  20. Samra, N., Atir-Lande, A., Pnueli, L., Arava, Y. The elongation factor eEF3 (Yef3) interacts with mRNA in a translation independent manner. BMC Mol Biol. 16, 17(2015).
  21. Loya, A., et al. The 3'-UTR mediates the cellular localization of an mRNA encoding a short plasma membrane protein. RNA. 14, 1352-1365 (2008).
  22. Haim-Vilmovsky, L., Gadir, N., Herbst, R. H., Gerst, J. E. A genomic integration method for the simultaneous visualization of endogenous mRNAs and their translation products in living yeast. RNA. 17, 2249-2255 (2011).
  23. Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids Res. 36, 6728-6738 (2008).
  24. Slobodin, B., Gerst, J. E. RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes. Methods Mol Biol. 714, 387-406 (2011).
  25. Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 18, 3091-3092 (1990).
  26. Eldad, N., Arava, Y. A ribosomal density-mapping procedure to explore ribosome positions along translating mRNAs. Methods Mol Biol. 419, 231-242 (2008).
  27. Arava, Y., Seger, R., Fbeta Walker, M. D. GRFbeta, a novel regulator of calcium signaling, is expressed in pancreatic beta cells and brain. J Biol Chem. 274, 24449-24452 (1999).
  28. Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes. Diabetes. 48, 552-556 (1999).
  29. Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site. FEBS J. 282, 504-520 (2015).
  30. Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).
  31. Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
  32. Gundry, R. L., et al. Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25(2009).
  33. Medzihradszky, K. F. In-solution digestion of proteins for mass spectrometry. Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).
  34. Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins. RNA. 5, 1509-1516 (1999).
  35. Oeffinger, M. Two steps forward--one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes. Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).
  36. Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein. Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).
  37. Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum. Science. 276, 1128-1131 (1997).
  38. Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2, 437-445 (1998).
  39. Aizer, A., et al. Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage. J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).
  40. Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
  41. Lopez de Heredia,, M,, Jansen, R. P. RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5, 14(2004).
  42. Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway. Sci Rep. 5, 8572(2015).
  43. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Res. 24, 142-153 (2014).
  44. Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).
  45. de Godoy, L. M. SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification. Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

MS2
Novel Выделение РНК-связывающих белков Стремительное Методология
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.