"Фагосоме Закрытие Анализ" для визуализации фагосоме Формирование в трех измерениях с помощью полного внутреннего отражения флуоресцентной микроскопии (TIRFM)

Фагоцитоз является одной из основных функций клеток, которая начинается с признания и связывание материала с поверхностными рецепторами, которые затем приводит к интернализации и деградации проглоченного материала. В то время как одноклеточные эукариоты , такие как пресс - формы Dictyostelium discoideum и амеб используют фагоцитоз для питания бактерий, высшие организмы эволюционировали с профессиональными клетками. Макрофаги или дендритные клетки являются первой линией защиты от патогенных микроорганизмов в различных тканях и органах, и имеют решающее значение для активации адаптивной иммунной системы посредством презентации антигена и продукции цитокинов ^1-4. При определенных обстоятельствах фагоцитоз могут быть выполнены с помощью непрофессиональной фагоцитирующих клеток, например, эндотелиальных и эпителиальных клеток. Этот процесс имеет важное значение для поддержания гомеостаза в процессе развития и в зрелом возрасте для нормального оборота и ремоделировании ткани. И, наконец, специализированные фагоциты, такие как клетки Сертоли в яичках или сетчатки глазапигментные эпителиальные клетки являются чрезвычайно мощными фагоциты ^5.

Формирование фагосому где деградация микроорганизмов или продуктов распада клеток происходит начинается с агрегацию фагоцитирующих рецепторов на поверхности фагоцитарной клетки. Передачи сигнала события после кластеризацию опсоническую рецепторов, таких как рецепторы Fc (FcR) и комплемент-рецепторов (CRS) были хорошо охарактеризованы. Тем не менее, есть также многочисленные не-опсоническую рецепторов, включая Toll-подобные рецепторы (TLR,), лектины, маннозы рецепторов и мусорщик рецепторов. Эти рецепторы распознают детерминанты на поверхности частицы , такие как манноза или остатков фукозы, фосфатидилсерин, и липополисахариды ^1,6-9.

Возбудитель или остатков клеток распознавания включает в себя связывание с и группирование нескольких типов фагоцитарной-рецепторов, которые затем приводят к интенсивному и транзиторной актина ремоделирования. Параллельно фокальной экзоцитоза внутриклеточных compartmenТ.С. способствует освобождению мембранного натяжения и имеет важное значение для эффективного фагоцитоза крупных частиц. Сигнальные события, приводящие к актина полимеризации и деформации мембраны препарировали в экспериментальных моделях, которые спровоцировали одну фагоцитарную рецептор. Во время FCR-опосредованного фагоцитоза, происходит интенсивное полимеризация актина, которая регулируется малыми ГТФаз (Rac, Cdc42). Среди их вниз по течению эффекторов, синдром белок СВО (WASP) приводит к активации актин-родственного белка 2/3 комплекс (Arp2 / 3) , что зарождается актиновые филаменты ^1,2,4,10. Местное производство фосфатидилинозитол-4, 5-бисфосфат (PI (4,5) P ₂₎ имеет решающее значение для начальной полимеризации актина , который управляет псевдоподия образование. Его превращение в PI (3,4,5) P ₃ требуется для псевдоподия расширения и закрытия фагосом ^11. Несколько путей способствуют исчезновению PI (4,5) P _2. Во-первых отряд фосфатидилинозитол фосфатного кинаSES (PIPKIs) от PI фагосоме аресты (4,5) P ₂ синтеза. Во- вторых, он может быть фосфорилируется и потребляемый класса I PI3K киназ (PI3K) и преобразуется в PI (3,4,5) P ₃ ^12. Роль для фосфатаз и фосфолипаз также подразумевается в гидролизу PI (4,5) P ₂ и F-актин удаления во время фагоцитоза в клетках млекопитающих и в Dictyostelium ^13,14. Фосфолипазы С (PLC) δ гидролизует PI (4,5) P ₂ в диацилглицерина и инозитол-1,4,5- трис- фосфата. PI (4,5) P ₂ и PI (3,4,5) P ₃ фосфатазы OCRL (окулоцереброренальный синдром Lowe) также участвует в формировании фагосом. Точная локальная формация F-актина и его деполимеризации жестко регулируется в пространстве и во времени, и мы показали, что набор внутриклеточных отсеков имеет важное значение для доставки локально фосфатазы OCRL, тем самым способствуя местным актина деполимеризации на базе фагоцитарной чаши

Механизм и молекулярные игроки, необходимые для закрытия фагосом и мембраны расщеплению остаются плохо определены из-за трудностей в визуализации и мониторинга сайта закрытия фагосом. До недавнего времени фагоцитоз не наблюдалось на фиксированных или живых клеток, которые позволяли частицы на их дорсальную лице или на их сторонах, что делает своевременную визуализацию места закрытия фагосом трудно. Кроме того, способы крепления может привести к втягиванию мембран и исказить результаты по расширению псевдоподий и закрытия. В противоположность этому , анализ , который мы создали и описать здесь позволяет визуализировать псевдоподия расширение и этап закрытия фагоцитоза в живых клетках ^13, основанный на общей внутренней микроскопии отражения (TIRFM) ^16. Этот оптический метод использует мимолетную волну для возбуждения флуорофоров в тонкой области на границе раздела между прозрачным таккрышка (покровное) и жидкость (культуральная среда клеток). Толщина глубины возбуждения составляет около 100 нм от твердой поверхности, что позволяет визуализировать молекулярных событий, близких к плазматической мембране. TIRFM позволяет высокое отношение сигнала к фону, и ограничивает флуоресценцию вне фокуса, собранной и цитотоксичность за счет освещения клеток.

Пользуясь TIRFM, мы разработали "фагосоме закрывающий анализа", в котором покровные активируются с поли-лизина и затем покрывают IgG-опсонированных красных кровяных телец (IgG-SRBCs). Макрофаги, экспрессирующие скоротечно флуоресцентно меченных белков, представляющих интерес, затем дают возможность поглотить IgG-SRBCs. В то время как клетки отделить целевые частицы, которые не являются ковалентно связаны с поверхностью стекла, можно наблюдать и записывается в режиме TIRF кончики подталкивателей. TIRF приобретения сочетаются с приобретения в режиме эпифлуоресцентной, после сдвига мкм стадия 3 выше, что позволяет Visualization основания фагоцитарной чаши. Добавление фармакологических препаратов, таких как те, ингибирование актина или динамин в ходе процесса также можно дополнительно рассекают процесс на молекулярном уровне.

Протокол, описанный подробно здесь для RAW264.7 мышиной линии клеток макрофага и опсонизированных частиц, но практически, она может быть адаптирована к любой другой фагоцитарной клетки и с другими целями, такие как шарики. Этот метод позволит лучше характеристику регулирования во времени и пространстве молекулярных игроков, участвующих в псевдоподия расширения и закрытия фагосом во время различных фагоцитирующих процессов.

Примечание: плазмиду использовали Lifeact-mCherry является своего рода подарком Dr. Guillaume Montagnac, Института Кюри, Париж, генерируемой после ^17.

1. Клетки и трансфекция

Примечание: RAW264.7 макрофаги выращивают до суб сплошности в полной среде (RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640, 10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ β-меркаптоэтанол, 2 мМ L-глутамина и 10% FCS ( фетальной телячьей сыворотки)) в 100 мм пластины с. Они трансфицировали плазмидами, кодирующими флуоресцентно меченных белков с помощью электропорации. Приблизительно 5 плановом порядке - 6 х 10 ⁶ клеток трансфицируют 20 мкг или 10 мкг плазмиды для каждой трансфекции или котрансфекцией соответственно. Следует отметить, что другие средства, основанные на трансфекцию электропорации или липофекцией могут быть использованы в качестве альтернативных подходов.

1. Наскребать клеток с клеточной подъемником и ресуспендируют их в 10 мл культуральной среды с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз.
2. Центрифугаклеточной суспензии 300 мкг, 5 мин при комнатной температуре в качающейся угол ротора.
3. Разогреть 10 мл полной среды с добавлением 10 мкг / мл гентамицина при 37 ° С.
4. После центрифугирования, отбросить супернатант и ресуспендируют осадок в 3 мл "промывки буфером А" из набора для электропорации.
5. Центрифуга клеточной суспензии 300 XG, 5 мин при комнатной температуре в поворотном угла ротора.
6. В то же время готовят смесь ДНК при комнатной температуре: 120 мкл 2x буфера В, 20 мкг ДНК , кодирующей плазмиды для белка , представляющего интерес, в ПБС 240 мкл H ₂ O.
7. После центрифугирования, отбросить весь супернатант.
8. Ресуспендируют осадок клеток в смеси ДНК и перенесите в электропорации кюветы 4 мм.
9. Инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин.
10. Электропорации при 250 В, 900 мкФ.
11. Сразу ресуспендирования клеток в предварительно нагретом (37 ° C) полную среду, дополненную гентамицином и табличкам в 100 мм блюдо.
12. Выдержите трансфектированных клеток в течение ночи при 37 ° С в атмосфере 5% СО _2.
13. На следующее утро, заменить полную среду с 10 мл не содержащей сыворотки среды микроскопии (RPMI 1640 без фенолового красного, 10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ β-меркаптоэтанол, 2 мМ L-глутамина).

2. Опсонизация ЭРИТРОЦИТОВ

Примечание: В качестве модели частицы-мишени для макрофагов, используются клетки овцы красных кровяных телец (SRBCs). Как правило, около 7 х 10 ⁶ SRBCs на 35 мм со стеклянным дном блюдо используется.

1. Промыть SRBCs 100 мкл 1х PBS (фосфатно-солевого буферного раствора) /0.1% БСА (бычий сывороточный альбумин) и центрифугу (600 XG, 4 мин).
2. После центрифугирования, отбросить супернатант и ресуспендируют SRBCs в 100 мкл 1х PBS / 0,1% BSA и центрифуге (600 XG, 4 мин).
3. После центрифугирования, отбросить супернатант и ресуспендирования SRBCs в 1x PBS / 0,1% BSA с кроличьи IgG анти-SRBCsна суб-агглютинации концентрации. С помощью 500 мкл раствора, содержащего антитело / 5 мкл SRBCs.
   Примечание: Суб-агглютинации концентрация антител соответствует самой низкой концентрации, которая не вызывает агглютинацию обнаружен как формирование сети. В общем, концентрация к югу от агглютинации составляет 8,2 мкг / мл.
   1. Определить концентрацию IgG анти-SRBCs необходимых для opsonize в SRBCs с помощью теста гемагглютинации. Серийно разбавить IgG анти-SRBCs (акции по 13,1 мг / мл) между 1/50 - 1/25600 в микропланшет. Добавить 2 х 10 ⁶ SRBCs в каждую лунку. Инкубируйте планшет в темноте при комнатной температуре в течение нескольких часов.
4. Инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин при медленном вращении.
5. После двух промываний в 1X PBS / 0,1% БСА, как описано выше, ресуспендируют IgG-опсонированных SRBCs (IgG-SRBCs), в подогретого бессывороточной среде микроскопией (2 мл / чашку).

3. Поли-лизин Покрытие покровные

1. В это время, Лечить 35 мм со стеклянным дном блюда с 2 мл 0,01% поли-L-лизина, в течение 30 мин при комнатной температуре.
2. Мыть посуду в два раза с 2 мл 1x PBS.

4. Нековалентная Фиксация SRBCs на стеклянным дном блюда

1. Залить 2 мл SRBCs суспензии на 35 мм блюдо со стеклянным дном.
2. Центрифуга с качающимся ротором при 500 мкг в течение 2 мин на 35 мм со стеклянным дном посуды.
3. Удалить супернатант и мыть один раз с 2 мл 1X PBS / 10% БСА.
4. Инкубируйте частицы в течение 30 мин с помощью 2 мл 1 x PBS / 10% БСА на чашку.
5. Мыть посуду три раза с 2 мл 1x PBS.
6. Заменить 1X PBS с 2 мл подогретого (37 ° С), не содержащей сыворотки среде микроскопии.

5. Фагоцитоз визуализировали TIRFM

1. микроскоп
   Примечание: TIRFM проводили с помощью микроскопа , снабженного объективом масляной иммерсии (N 100X, NA1.49), нагревательную камеру с СО _2, и два поютле камеры обнаружения фотонов EMCCD (электронного умножителя прибор с зарядовой связью) в сочетании с 1.5X объективом.
   1. За день до начала сессии микроскопа TIRF, включите камеру нагрева при температуре 37 ° С, чтобы обеспечить однородный нагрев столик микроскопа.
2. Определение критического угла
   Примечание: программное обеспечение ImageJ Color Profiler используется для обработки потоков TIRF изображений.
   1. Поместите 35 мм со стеклянным дном блюдо, содержащее опсонизированным SRBC с бессывороточной средой микроскопии под микроскопом.
   2. Наскребать клетки и ресуспендируют их в среде перед добавлением (100 - 500 мкл) в чашке.
   3. С помощью программного обеспечения "Живая Приобретение" для управления микроскопом и выполняют возбуждение с 491 нм и / или 561 нм лазера для идентификации клеток, экспрессирующих флуоресцентно меченных белков.
   4. Определите ячейку, выражающую флуоресцентно меченных белков.
   5. Поместите его в середине поля и приобрести 500 IMвозраст на одной длине волны возбуждения, с разными углами , начиная от 0º до 5º, с шагом 0.01º (рис 2А). Углы автоматически изменяются системой микроскопа.
   6. Определить критический угол, позволяющий падающий свет будет полностью отражено в / интерфейс среды стекла и генерировать мимолетную волну. С помощью программного обеспечения ImageJ Color Profiler, откройте последовательность изображения, нажав на кнопку "Файл", "Открыть" и выберите файл.
   7. Выберите интересующую область (ROI), с прямоугольным инструмента, в ячейке с однородной флуоресценции (рис 2B желтый 1).
   8. Постройте "Z профиль оси" средней интенсивности флуоресценции , измеренный в ROI с функцией углов на оси х, нажав на вкладке "Изображение", "Штабеля" в раскрывающемся меню и "Plot Z-оси Profile" (рис 2B красный 2).
      Примечание: критический угол угол, ведущий к маximum флуоресценции перед резким снижением флуоресценции.
   9. Используйте любое значение угла на оси х превосходит критический угол во время сеанса микроскопии , чтобы получить TIRF сигнал в качестве примера 2,00 (фиг.2с).
3. Приобретения
   1. Использование ПО Живой Acquisition, настроить параметры приобретения с модулем «Редактор протоколов» (рис 3А).
      1. Создание протокола с "петлей" содержащий "Multi каналов" приобретение для получения флуоресцентного сигнала от белков, представляющих интерес в TIRF регионе. Введите угол TIRF (например , 2,00), время экспозиции (например , 50 мс) и интенсивность лазерного излучения (например , 50%) (фигура 3В 1).
      2. Введем "Z ход" от 3 мкм цель выше TIRF области для получения сигнала в приобретении эпифлуоресцентной с помощью инструмента "Multi Каналы". Введите угол ниже тон критический угол ( в качестве примера 1.00), время экспозиции (50 мс) и интенсивности лазерного луча (50%) (фигура 3В, 2 и 3).
      3. Затем добавьте "Z" движение в цель 3 мкм ниже, чтобы вернуться в область TIRF (рис 3B 4). Добавить "снимок" ячейки при ярком свете LED (Light-Emitting Diode) (рис 3B 5).
   2. Найти ячейку интереса с умеренным уровнем флуоресцентно меченого экспрессии белка, который инициирует фагоцитоз ЭБ за счет расширения плазмы мембраны вокруг частицы.
   3. Поместите его в середине поля.
   4. Начать потоковое приобретение 500 - 1000 кадров. На вкладке "счетчик цикла", введите "750 кадров" (рис 3B 1).
      Примечание: программное обеспечение ImageJ Color Profiler используется для обработки потоков TIRF изображений.
   5. Откройте изображения последовательности в программном обеспечении Image J, нажав"Файл", "Открыть" и выбрав файл.
   6. Отдельные каналы, нажав на вкладке "Изображение", "Hyperstacks" выпадающего меню и на "Стек для HyperStack" функции. Заполните появившемся окне: Order: xyctz; Канал (с): количество каналов (например: "2", если у вас есть два флуорохромии); Ломтики (г): количество срезов в оси Z (например: "1", если нет движения в z- оси); Рамы (т): количество изображений, разделенных по количеству каналов; Режим отображения: оттенки серого.
      Примечание: Две отдельные последовательности изображений генерируются, соответствующие двум различным каналам.

Экспериментальная система , описанная в данной рукописи схематично представлена ​​на фиг.1. Трансфицированных RAW264.7 макрофаги , экспрессирующие белки , представляющие интерес , слитого с флуоресцентной метки помещены в контакт с IgG-опсонизированным эритроциты барана (SRBCs) , которые были нековалентно неподвижная на покровное. Макрофаги могут отделить SRBC от покровного поглотить его. TIRF микроскоп используется позволяет сопутствующее получение сигналов от области TIRF, соответствующих кончиков подталкивателей и сигналов в режиме эпифлуоресцентной после Z сдвига 3 мкм выше.

Крайне важно , чтобы определить критический угол полного внутреннего отражения флуоресценции , как описано на рисунке 2. Это обеспечивает чистый сигнал TIRF из области 100 нм ниже плазменной мембраны. Рисунок 3 представляет собой развитие acquisitiот параметров через модуль под названием «Редактор протоколов» включены в программное обеспечение Живая Приобретение. Этот модуль позволяет пользователям создавать и управлять рабочих процессов, прежде чем они направляются в микроскоп, который будет выполнять этот процесс. В конце приобретения, пользователь собирает поток TIFF.

На рисунке 4 показано, представитель живых клеток TIRFM фильм о "фагосом закрытия анализа" в RAW264.7 макрофагов , трансфицированных плазмиды (например, Lifeact-mCherry, своего рода подарок доктора Гийома Montagnac, Института Кюри, Париж, генерируемой после того, как 17) следовать актина полимеризации. Макрофаги скоротечно, выражающие плазмиду позволили поглотит IgG-SRBCs, связанные с покровным. Как кончики подталкивателей были соединенной со покровного стекла вокруг одного ЭБ, Ф-актин кольцо было обнаружено в зоне TIRF (верхняя панель), которая постепенно суженный до его закрытия. Параллельно размыто F-актинсигнал, обнаруженный эпифлуоресцентной после сдвига ступени 3 мкм выше (нижняя панель) соответствует деполимеризации у основания фагоцитарной чаши. Через 3 мин приобретения, ЭБ был полностью усвоены, как это было подтверждено в проходящем свете (панель справа).

Следовательно, этот метод может быть использован, чтобы правильно различать молекулярные события, которые происходят на самых концах подталкивателей и молекулярных событий, происходящих в основании фагоцитарной чаши.

Рисунок 1. Схематическое изображение "фагосоме Закрытие Пробирной" проанализированная с помощью TIRFM. Анализ закрытия фагосоме осуществляется с использованием макрофаги скоротечно экспрессирующие один или два флуоресцентно меченых белков. Макрофаги оседают на IgG-опсонированных SRBCs нековалентно закрепленными на поли-лизин-КоАTed покровные. Изображения записываются в режиме TIRF , чтобы обнаружить место закрытия фагосом и в режиме эпифлуоресцентной обнаружить основание фагоцитарной чашки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Определение критического угла TIRFM. (A) Использование "Живое приобретение", клетка , экспрессирующая флуоресцентно меченных белков помещают в середине поля (область 1 в красном). С помощью опции TIRF стека, изображения были получены на одной длине волны возбуждения, с разными углами , начиная от 0 ° до 5 °, с шагом 0,01 ° (область 2 красным цветом). (В) Последовательность изображений открывается с использованием ImageJ программное обеспечение Color Profiler и средняя интенсивность флуоресценции арв области температуры интереса (ROI) строится с функцией углов на оси х с использованием "стеки" и "Plotz оси профиль" (область 1 в красном цвете). (С) х положение пика флуоресценции на графике соответствует критический угол: 1,98 ° (черная пунктирная линия). Любое значение после того, как этот угол может быть использован. В качестве примера, 2,00 ° может быть выбрана (красная линия). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Процесс документооборота с помощью модуля on - Acquisition: "Редактор протоколов". (A) В окне «Редактор протоколов», рабочий процесс холст создается. (B) Этот протокол содержит «петля» действий, микроскоп будет повторяться столько раз решилпользователем. В качестве примера: 750 (1). Один цикл включен: "Multi каналы" приобретение с лазерным возбуждением флуоресцентных белков, представляющих интерес в режиме TIRF. В качестве примера: Лазер 491 нм интенсивность 50% -TIRF угол 2,00 (2); "Z ход" объектива 3 мкм (3); "Multi каналы" получение в режиме эпифлуоресцентной (4); "Z ход" объектива обратно в TIRF области (5) и "снимок" в проходящем свете (6). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. F-актин Накопленная как точка в месте закрытия анализа фагосоме закрытия. Фагосоме была выполнена с использованием RAW264.7 макрофаги скоротечно , выражающие плазмиды Lifeact-mCherry (своего рода подарок доктора Гийома Моntagnac, Институт Кюри, Париж, генерируется после 17). Плазмида сигнал был приобретен в TIRF области (вверху) и в режиме эпифлуоресцентной (внизу). Красный стрелолист указывает на накопление актина в TIRF регионе. Проходящий свет изображение в 3 мин представлено, что свидетельствует об интернализированную SRBC. Шкала бар, 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Фильм 1: F-актин аккумулируется в кончиках псевдоподий и на месте фагосоме закрытия, в то время как он очищается от основания анализа Фагоцитарная Кубка фагосоме закрытия была выполнена с использованием RAW264.7 макрофаги скоротечно , выражающие плазмиды.. Плазмидную изображений в TIRF (верх) и в режиме эпифлуоресцентной (внизу) с помощью TIRFM была выполнена альтернативаLY каждые 50 мс в течение 3 мин при 37 ° C. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы просмотреть это видео.

Авторам нечего раскрывать.