Этот протокол описывает технику остеосинтеза с использованием интрамедуллярного стопорного гвоздя для стандартизированной фиксации остеотомий бедренной кости, которая может быть использована для анализа нормального и дефектного заживления костей у мышей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Интрамедуллярный Запирание ногтей для стандартизированной Фиксация бедренной остеотомии для анализа Normal и неполноценный заживления костей у мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Целебные модели костей имеют важное значение для разработки новых терапевтических стратегий для клинического лечения переломов. Кроме того, мышиные модели становятся все более широко используются в научных исследованиях травмы. Они предлагают большое количество мутантных штаммов и антител для анализа молекулярных механизмах, приводящих к высокодифференцированного процесса заживления костей. Для управления биомеханической среды, стандартизованные и хорошо охарактеризованные методы остеосинтеза являются обязательными для мышей. Здесь мы сообщаем о разработке и использованием остеосинтеза для стабилизации открытые остеотомии бедренной кости у мышей. Гвоздь, изготовлены из нержавеющей стали медицинского класса, обеспечивает высокую осевую жесткость и вращательную. Имплантат дополнительно позволяет создавать определенную, постоянную остеотомической размером от 0,00 мм до 2,00 мм. Интрамедуллярный замок стабилизации ногтей бедренной остеотомии с зазорами размерами 0,00 мм и 0,25 мм приводит к адекватной заживления кости через Эндохондральный и Intramembranous ossificatиона. Стабилизация бедренной остеотомии с размером зазора 2,00 мм результатов в атрофический несращения. Таким образом, интрамедуллярный гвоздь блокировки можно использовать в целебных и незаживающие моделей. Еще одно преимущество использования ногтя по сравнению с другими целебными моделями открытой кости является возможность адекватно фиксировать заменители костей и подмости с целью изучения процесса костно интеграции. Недостатком использования остеосинтеза является более инвазивные хирургические процедуры, присущие всем открытых процедур по сравнению с закрытыми моделями. Еще один недостаток может быть индукция некоторые повреждения костномозговой полости, присущие всем интрамедуллярными методы стабилизации по сравнению с экстрамедуллярных процедурами стабилизации.
Введение
Биология заживления кости могут быть изучены в пробирке с использованием клеточных культур и сфероидами, но она также требует в естественных условиях с использованием подходов , исследований на животных. В то время как эксперименты крупных животных до сих пор играют важную роль в доклинических испытаний, на ранней стадии тестирования продуктов или гипотез изменилось за последние 10 лет и в настоящее время часто проводятся в небольших моделях животных 1. Этот переключатель был выполнен по нескольким причинам. Производство и обслуживание мышей и крыс дешевле по сравнению с свиней и овец. Кроме того, мелкие животные имеют более короткое время воспроизводства и более короткие периоды нормального заживления, оба из которых облегчают выполнение большого ряда хронических экспериментов. И, наконец, наличие гена, ориентированных на животных и специфических антител позволяет для анализа молекулярных механизмов заживления кости. Тем не менее, в то время как ранее использовались методы остеосинтеза в больших моделях животных могут быть переведены с минимальным variat ион от аналогичных процедур, используемых в медицине или ветеринарии клинического ухода за пациентами, разработки и применения методов остеосинтеза в мелких крыс и мышей оказалась сложной задачей.
Хорошо известно , что биомеханические среда существенно влияет на кости , процесс 2 , заживление. Как известно из заживления переломов у людей, различия в результате разрушения стабилизации в различных режимах исцеления, в том числе Intramembranous окостенение после жесткой фиксации и эндохондральной окостенение после менее жесткой фиксации с микродвижениях. Полная осевая или ротационной неустойчивости может задержать процесс заживления или может привести к не-союзами 3. Соответственно, мы считаем, что необходимо разработать сложные системы имплантатов и методов остеосинтеза у мышей и крыс. Таким образом, биомеханические условия могут быть стандартизированы надлежащим образом, гарантируя достоверные результаты при анализе процесса заживления.
e_content "> Несмотря на то, значительное количество очень сложных мышиных методов стабилизации были введены в течение последних нескольких лет, наиболее часто используемый метод до сих пор является простой интрамедуллярная штифт. Основным недостатком этого метода, однако, является отсутствие вращения и осевого стабильность 4. для улучшения вращения и осевую устойчивость, интрамедуллярные винт был введен для стабилизации переломов бедренной кости у мышей 5. Тем не менее, крепление винт не может быть использован для анализа костно-дефектные заживление из - за необходимости контакта и сжатия между фрагментами кости в для поддержания стабильности вращения.Интрамедуллярном фиксирующего штифта обеспечивает более высокую осевую и вращательную стабильность по сравнению с простым штифтом и интрамедуллярном винтом 4. Высоко воспроизводимые бедренной остеотомии, возможно, из-за руководства для Джильи увидел и способность создавать определенные размеры зазоров, позволяет для анализа как нормального бонае исцеление и костно-дефектные заживление 6. Из-за введения переплетенных штифтов, интрамедуллярном фиксирующего штифта гарантирует постоянный размер зазора во время всего процесса заживления, даже в то время как несущие полный вес. Здесь мы сообщаем о разработке и применении интрамедуллярного блокирующего ногтя, а также о его преимуществах и недостатках в экспериментальных исследованиях по нормальной и замедленной заживления костей.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры были IACUC одобрены и последовали институциональные рекомендации (Landesamt für Verbraucherschutz, Zentralstelle Amtstierärztlicher Dienst, Саарбрюккен, Германия). Обезболивание и профилактика инфекции должны быть согласованы с соответствующими директивами страны и учреждения, в котором эксперименты должны быть выполнены.
1. Получение Имплантаты и хирургические инструменты
- Выберите лезвие скальпеля (размер 15), маленькие ножницы подготовки, тонким пинцетом, корнцанг, маленькие клещи, 24 калибра (G) и 27 G иглы, не-рассасывающийся шовный 5-0, и держатель иглы из микрохирургического инструмента коробки ,
- Распаковка остеосинтеза, блокируя контакты, специальное устройство прицеливание, Джильи увидел, шаблон для Джильи увидел, центрирование сверла (диаметр 1 мм), сверло (диаметр 0,3 мм), и ручной дрели (рис 2; см Перечень материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: intramedullary гвоздь (диаметр 0,8 мм, длина 15.7 мм) представляет собой интрамедуллярная фиксирующего штифта из нержавеющей стали медицинского класса для ретроградной имплантации в бедренной кости. Гвоздь имеет проксимальный нить (длина 4 мм) и два отверстия для вставки блокировочных штифтов (диаметр 0,3 мм) для достижения осевого вращения и стабильность (рисунок 1). - Вынести имплантаты и все хирургические инструменты в дезинфицирующий раствор (например, 96% спирта) в течение 5 мин или стерилизовать их (стерилизации паром, 130 ° С, 25 мин). После дезинфекции или стерилизации, поместите инструменты на стерильную операции тканью. Поместите стерильную операцию ткань непосредственно примыкающий к небольшой операции животных таблице.
2. Животные, Анестезия и обезболивание
- Выберите штамм, возраст и пол мышей, которые необходимы для изучения и вопрос решать.
Примечание: Для этого исследования от 12 до 14-недельных CD-1 мышей мужского пола были использованы. Для ногтей implantation, идеальный вес тела животных составляет 25 - 35 г. - Обезболить мышей с внутрибрюшинной инъекцией 15 мг / кг ксилазина и 75 мг / кг кетамина. Подтвердите обезболивание с помощью пальца щепоткой. Нанесите смазку для глаз, чтобы защитить глаза животных от высыхания во время анестезии. После вводного наркоза, поместите мышь под нагревательную лампу, чтобы поддерживать постоянную температуру тела.
- Применение трамадола гидрохлорида в питьевой воде (2,5 мг / 100 мл) в течение анальгезии с 1 дня до операции до 3-й день после операции.
3. Хирургические процедуры и Имплантация ногтей
- Перед хирургическим вмешательством, бриться всю правую заднюю ногу и нанесите крем для удаления волос. Через 5 минут, удалите крем и очистить ногу с водой. Вынести имплантаты и все хирургические инструменты к дезинфицирующим раствором (например, 96% спирта) или стерилизовать их (стерилизации паром, 130 ° С, 25 мин).
- В стерильных условиях, поместите МОВсе в положении лежа на спине на небольшой операции животных таблице. Согните правое колено, чтобы обеспечить передне подход к мыщелков коленного сустава. Выполните 5 мм медиальнее parapatellar надрез на правом колене, используя лезвие скальпеля.
- Поднимите связку надколенника с тонким пинцетом и тщательно мобилизуют связки с скальпелем. Затем переложить надколенника в боковом направлении с скальпелем, чтобы выставить межмыщелковой выемку бедренной кости.
- Открыть межмыщелковой насечку путем бурения до интрамедуллярная полости не будет достигнута.
- Начало бурения с 45º смещением оси бедренной кости с использованием 1 мм центрирующие сверло. Медленно изменить направление бурового долота во время бурения, пока он не параллелен оси кости бедренной кости. Прекратить бурение, если интрамедуллярная полость достигается.
- После открытия кости на межмыщелковой выемкой, вставьте 24 G иглу в костномозговой полости по всей длине бедренной кости. Рассверлить Intramedullary полость бедренной кости вручную через вращательные движения 24 G иглы. Удалите 24 G иглу и вставить тонкую иглу 27 G в костномозговой полости. Вставьте иглу вперед для перфорирования кортикальной кости бедренной кости в проксимальном направлении на большой вертел.
- Удалите 27 G иглу из бедренной кости. Используя сверло руки, имплантировать остеосинтеза через межмыщелковой надрезом при непрерывном вращении и осевого давления до дистального конца ногтя не достигает уровня мыщелков.
Примечание: Дистальный конец ногтя может быть идентифицирована с небольшим знаком. - Поместите курсор в положении на левом боку. Выполните продольный разрез кожи, используя лезвие скальпеля вдоль диафизарной части боковой бедренной кости от коленного сустава до тазобедренного сустава, чтобы хирургическим путем подвергать диафиза бедренной кости.
- Используя небольшие ножницы подготовки, разделить фасции и распространять мышцы в направлении оси бедренной кости с боковой стороны.Spread мышцы, пока диафизарной часть бедренной кости не подвергается воздействию. Сохранить седалищный нерв.
- Подготовка всей окружности бедренной кости путем подрыва кости с гардеробными щипцов. Затем, убирается мышцы, распространяя корнцанг и подвергать бедренной кости.
- Установите устройство для прицеливания дистального конца ногтя. Авансовые устройство, пока оно не прикрепляет к фланце ногтя и поверните устройство в прицеливания переднелатерального положении по отношению к бедренной кости.
- Скрестите гвоздь с проксимального и дистального взаимной блокировки штифта.
- Начните с проксимального взаимной блокировки штифта.
- Вставьте биту центрирование сверла (диаметр 1 мм) в ручной дрели. Зенковки кости в проксимальном положении взаимной блокировки отверстия.
Примечание: К зенкование, небольшая полость создается в облицовке кортикальной кости без сверления через кость. Эта полость позволяет улучшить центрирования и направляющей из более тонкого сверлом (диаметром 0,3 мм),использоваться в дальнейшем. - Вставьте сверло (диаметр 0,3 мм) в ручной дрели. С помощью прибора для определения направления, просверлить отверстие через обе облицовкой и предотвращенный кортикальной кости (бикортикальными). Вставьте первый блокирующим штифт через прицельное приспособление. Блокирующий ножницы стержневого пальца отъехать, как только блокировка крутящего момента достигается.
- Повторите эту процедуру для дистального взаимной блокировки штифта.
- Выполните диафизарными остеотомию.
- Прикрепите направляющую пилы к прицельного устройства на боковой стороне между двумя взаимосвязанными штифтами. Затем увидел кость с Джильи увидел под непрерывным орошением физиологического раствора. После того, как остеотомия завершается, разрезать пилой на одном конце, близко к кости. Удалите пилы осторожно, чтобы не вызывать повреждение мягких тканей.
- Удалите устройство и прицеливания, с небольшими клещами, обрезать оставшийся вал остеосинтеза на отмеченной линии.
- Закройте мышечных слоев на латрального сайт бедренной кости и выполняют закрытие кожи с одиночными швами. На переднем участке колена, изменить положение надколенника и исправить надколенника сухожилия мышц с одной швом. Используйте одиночные швы, чтобы закрыть эту рану, а также.
- Держите животных под лампой тепло, пока они не оправиться от наркоза. Не оставляйте животных без присмотра, пока они не восстановили достаточное сознание, чтобы поддерживать вентральной лежачее. Возвращение животных в отдельных клетках в виварии.
- внимательно следить за животными каждый день. Поддерживать послеоперационное обезболивание в течение первых трех дней. Продолжайте обезболивание, если на 4-й день после операции, животные до сих пор показывают свидетельства боли, как указано вокализации, беспокойство, отсутствие подвижности, неспособность жениха, ненормальной позы, а также отсутствие интереса к нормальной обстановке. Прекратить обезболивание, когда животные являются боль бесплатно.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Общее время хирургической процедуры составляет около 30 минут от разреза кожи до закрытия раны. Использование хирургических имплантатов, предоставляемых, операция может быть выполнена без стерео-микроскопа. В послеоперационном периоде у животных контролировали ежедневно. Послеоперационный обезболивание было прекращено после того, как 3-х дней, потому что ни одно из животных не показали наличие боли (вокализации, беспокойство, отсутствие подвижности, неспособность жениха, ненормальной поз...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Наиболее важные этапы хирургической техники являются правильное позиционирование ногтя, прицельного устройства, а контакты. Гвоздь должен быть вставлен полностью к заметному отступа на дистальном конце ногтя, так как выпячивание гвоздь в коленный сустав на уровне мыщелков может ограничить движение колена (рис 3 A). Таким образом, размер бедренной кости и, соответственно, вес тела животных, должны быть рассмотрены. Хирург должен также обратить особое внимание на конечное положение прицельного устройства ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Романо Маттис является сотрудником компании RISystem AG, Давос, Швейцария, которая производит имплантаты и инструменты для имплантатов. У остальных авторов конфликта интересов нет.
Благодарности
Эта работа была поддержана RISystem AG, Давос, Швейцария.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| MouseNail | RISystem AG | 221,122 | |
| Прицельное устройство MouseNail | RISystem AG | 221,201 | |
| Блокирующий штифт MouseNail | RISystem AG | 221,121 | |
| Центрирующий сверло | RISystem AG | 592,205 | |
| Сверло | RISystem AG | 590,200 | |
| Канатная пила Gigli | RISystem AG | 590,100 | |
| Шовный материал (5-0 Prolene) | Ethicon | 8614H | |
| Щипцы | Braun Aesculap AG & CoKG | BD520R | |
| Перевязочные щипцы | Braun Aesculap AG & CoKG | BJ009R | |
| Ножницы | Braun Aesculap AG & CoKG | BC100R | |
| Иглодержатель | Braun Aesculap AG & CoKG | BM024R | |
| 24 G игла | BD Mircolance 3 | 304100 | |
| 27 G игла | Braun Melsungen AG | 9186182 | |
| Лезвие скальпеля размер 15 | Braun Aesculap AG & CoKG | ||
| Клещи | Knipex | 7932125 | |
| Радиатор обогрева | Sanitas | 605.25 | |
| Крем для депиляции | Asid bonz GmbH | NDXZ10 | |
| Смазка для глаз | Bayer Vital GmbH | 2182442 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH | 1320422 | |
| Ketamine | Serumwerke Bernburg | ||
| Tramadol | Grü nenthal GmbH | 2256241 | |
| Раствор для дезинфекции (SoftaseptN) | Braun Melsungen AG | 8505018 | |
| мыши CD-1 | Charles River | 22 |
Ссылки
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Claes, L., Augat, P., Suger, G., Wilke, H. J. Influence of size and stability of the osteotomy gap on the success of fracture healing. J Orthop Res. 15 (4), 577-584 (1997).
- Histing, T., et al. Characterization of the healing process in non-stabilized and stabilized femur fractures in mice. Arch Orthop Trauma Surg. 136 (2), 203-211 (2016).
- Histing, T., et al. Ex vivo analysis of rotational stiffness of different osteosynthesis techniques in mouse femur fracture. J Orthop Res. 27 (9), 1152-1156 (2009).
- Holstein, J. H., et al. Development of a stable closed femoral fracture model in mice. J Surg Res. 153 (1), 71-75 (2009).
- Garcia, P., et al. The LockingMouseNail-a new implant for standardized stable osteosynthesis in mice. J Surg Res. 169 (2), 220-226 (2011).
- Cheung, K. M., Kaluarachi, K., Andrew, G., Lu, W., Chan, D., Cheah, K. S. An externally fixed femoral fracture model for mice. J Orthop Res. 21 (4), 685-690 (2003).
- Garcia, P., et al. A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing. J Biomech. 41 (8), 1689-1696 (2008).
- Histing, T., et al. An internal locking plate to study intramembranous bone healing in a mouse femur fracture model. J Orthop Res. 28 (3), 397-402 (2010).
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. J Orthop Res. 20 (5), 1091-1098 (2002).
- Hiltunen, A., Vuorio, E., Aro, H. T. A standardized experimental fracture in the mouse tibia. J Orthop Res. 11 (2), 305-312 (1993).
- Manigrasso, M. B., O'Connor, J. P. Characterization of a closed femur fracture model in mice. J Orthop Trauma. 18 (10), 687-695 (2004).
- Lovati, A. B., et al. Diabetic mouse model of orthopaedic implant-related Staphylococcus aureus infection. PLoS One. 8 (6), e67628(2013).
- Slade Shantz, J. A., Yu, Y. Y., Andres, W., Miclau, T. 3rd, Marcucio, R. Modulation of macrophage activity during fracture repair has differential effects in young adult and elderly mice. J Orthop Trauma. 28, 10-14 (2014).
- Claes, L. E., et al. Effects of mechanical factors on the fracture healing process. Clin Orthop Relat Res. 355 (Suppl), 132-147 (1998).
- Gröngröft, I., et al. Fixation compliance in a mouse osteotomy model induces two different processes of bone healing but does not lead to delayed union. J Biomech. 18 (13), 2089-2096 (2009).
- Glatt, V., Matthys, R. Adjustable stiffness, external fixator for the rat femur osteotomy and segmental bone defect models. J Vis Exp. (9), e51558(2014).
- Manassero, M., et al. A novel murine femoral segmental critical-sized defect model stabilized by plate osteosynthesis for bone tissue engineering purposes. Tissue Eng Part C Methods. 19 (4), 271-280 (2013).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
